銀杏二萜內(nèi)酯K 對D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞抗衰老作用

操嬌嬌，杜雨芯，張倩霞，吳 偉，楊穎博，肖保國，肖 偉，王振中*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000

2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海 200120

3. 中藥制藥過程與智能制造技術(shù)全國重點實驗室，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001

4. 上海復(fù)旦大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所，上海 200040

腦細(xì)胞主要由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等）組成。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的細(xì)胞類型，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)雜功能和腦環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著極其重要作用[1]，包括調(diào)節(jié)突觸傳遞、維持血腦屏障、為神經(jīng)元提供結(jié)構(gòu)支撐、營養(yǎng)支持等作用[2]。細(xì)胞衰老是人體衰老的基本機制之一，是與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的核心組成部分。衰老細(xì)胞特征包括細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型、DNA 損傷、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶的表達(dá)、細(xì)胞周期抑制蛋白的表達(dá)等。這些表征的衰老細(xì)胞可損害腦組織的結(jié)構(gòu)和功能，引發(fā)突觸損失和認(rèn)知能力下降，增加衰老相關(guān)疾病的發(fā)病率，或推動年齡相關(guān)的疾病進(jìn)一步惡化[3]。因此，靶向星形膠質(zhì)細(xì)胞的衰老治療可能是緩解年齡相關(guān)神經(jīng)退行性疾病發(fā)生和進(jìn)展的一種有潛力的治療方式。

銀杏二萜內(nèi)酯K（ginkgolide K，GK）是從銀杏葉中分離出來的二萜內(nèi)酯類成分，GK 作為銀杏二萜內(nèi)酯B（ginkgolide B，GB）的同系物，也是血小板活化因子受體（platelet-activating factor，PAF）的拮抗劑，其抗氧化應(yīng)激和對急性缺血性卒中的抗血小板聚集和神經(jīng)保護(hù)作用備受關(guān)注[4-7]。本研究通過D-半乳糖誘導(dǎo)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞衰老模擬腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞衰老，探索GK 抗衰老的作用，同時初步探索其可能的抗衰老作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF 級ICR 新生鼠購自上海必凱科翼生物科技有限公司，實驗動物許可證號為SCXK（滬）2018-0006。動物實驗通過上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理審查（批準(zhǔn)號PZSHUTCM220110002）。

1.2 藥品與試劑

GK（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司中藥制藥過程與智能制造技術(shù)全國重點實驗室制備；D-半乳糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，批號JF68252A）購自上海泰坦科技股份有限公司；DMEM 培養(yǎng)基（批號MA0212）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；胎牛血清（批號10099-141C）購自美國Gibco 公司；PBS（批號ST447）、胰酶細(xì)胞消化液（批號C0203）、β-半乳糖苷酶染色試劑盒（批號C0602）、RIPA 裂解液（批號P00138）、PMSF（批號ST505）、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物（批號P1045）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號P0012）、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（批號P0015L）、ECL化學(xué)發(fā)光液（批號P0018FS）購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司；NC 膜（批號66485）、PVDF 膜（批號6054520）購自美國Pall 公司；p53 抗體（批號2524S）、核纖層蛋白B1（Lamin B1）抗體（批號13435S）、沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）抗體（批號9475S）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）抗體（批號47808S）、Ki67 抗體（批號9449S）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體（3670S）、β-actin 抗體（批號4970S）、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（批號7074S）、HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 抗體（批號7076P2）購自美國CST 公司；p21 抗體（批號ab109199）、p62 抗體（批號ab109012）購自英國Abcam 公司；微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3-Ⅱ/I（microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ/I，LC3-Ⅱ/I）抗體（批號NB100-2220）購自美國Novus 公司；Cy3 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 抗體（批號A0521）購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA 試劑盒（批號DY406-05）、小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒（批號DY410-05）、小鼠IL-1β ELISA 試劑盒（批號DY401-05）購自美國R&D Systems 公司。

1.3 儀器

Synergy H1 型多模式微孔檢測系統(tǒng)（美國Bio-Tek 公司）；Universal Hood Ⅱ Chemi Doc XRS 系統(tǒng)、PowerPac HC 蛋白印跡轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；DM6B 型熒光顯微鏡（德國Leica 公司）。

2 方法

2.1 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的提取與培養(yǎng)

在超凈臺無菌環(huán)境下，取出生24 h 內(nèi)新生小鼠，置潔凈大皿，75%乙醇消毒后，用經(jīng)高溫高壓滅菌后的手術(shù)剪，快速剪下整個頭，再剪開頭蓋骨，用鑷子小心取下2 片皮層，置于無血清的DMEM 培養(yǎng)基中，待10 只新生鼠全部取完，用潔凈的巴氏管吹打皮層，直至在燈光下觀察無明顯團(tuán)塊或聚集，培養(yǎng)基呈混懸狀，300×g離心5 min，棄無血清DMEM 培養(yǎng)基。加入含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)基適量，繼續(xù)用巴氏管吹打混勻，經(jīng)70 μm 細(xì)胞濾膜濾過，除去未吹散的團(tuán)塊，加入含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基至60 mL，混勻，每只大皿加6 mL 含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基。放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育，細(xì)胞在培養(yǎng)箱中孵育24～36 h 后，輕輕搖晃后將所有培養(yǎng)上清回收，2500 r/min 快速離心，除去沉淀，上清重新加入大皿，不足6 mL 則用新鮮完全培養(yǎng)液補充。每隔1 d 置換一半新鮮培養(yǎng)液，至第7 天，細(xì)胞鋪滿皿底，搖床置培養(yǎng)箱中360 r/min 搖晃3～4 h 除去小膠質(zhì)細(xì)胞和其他雜細(xì)胞。加入3 mL PBS 清洗2次，胰酶消化1 min，吹下細(xì)胞后800 r/min 離心3 min，吸去上清，加入2 mL 新鮮完全培養(yǎng)液，細(xì)胞計數(shù)后根據(jù)所需，即可種板進(jìn)行后續(xù)實驗。GFAP 免疫熒光染色顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞純度＞95%。

2.2 β-半乳糖苷酶衰老染色

將原代星形膠質(zhì)細(xì)胞以1.6×105個/孔接種于6孔板，待細(xì)胞生長至鋪滿皿底80%時即可實驗。加入GK（50 μg/mL）[8]預(yù)處理3 h，然后添加150 mmol/LD-半乳糖造模6 d，另設(shè)置不含藥物的對照組。實驗結(jié)束后，除去培養(yǎng)基，用1 mL PBS 清洗1次，吸凈PBS。每孔加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液室溫固定15 min，PBS 清洗3 次后，每孔加入1 mL 染色工作液，用保鮮膜封住，37 ℃孵育過夜。次日除去染色工作液，加入1 mL PBS，于顯微鏡下觀察并拍照，使用Image J 軟件對藍(lán)色染色區(qū)域進(jìn)行定量分析。

2.3 Western blotting 檢測p53、p21、Lamin B1、BDNF、SIRT1、p62 和LC3Ⅱ/I 蛋白表達(dá)

將原代星形膠質(zhì)細(xì)胞以1.6×106個/皿接種于大皿，待細(xì)胞生長至鋪滿皿底80%時即可實驗。GK（50 μg/mL）預(yù)處理3 h，然后添加150 mmol/LD-半乳糖造模6 d，另設(shè)置不含藥物的對照組。收集細(xì)胞，加入含蛋白酶、磷酸酶抑制劑和PMSF 的RIPA緩沖液裂解，然后用BCA 法測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，加入5%脫脂奶粉，室溫封閉2 h，TBST洗滌，加入相應(yīng)一抗，4 ℃搖床孵育過夜；TBST 洗滌3 次，每次10 min，加入二抗（1∶1000），室溫孵育2 h，TBST 洗滌3 次，加入ECL 發(fā)光試劑顯影，應(yīng)用ECL 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照，采用Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值。

2.4 免疫熒光檢測Ki67 蛋白表達(dá)

24 孔板每孔放置1 片爬片，將原代星形膠質(zhì)細(xì)胞以4×104個/孔接種，待細(xì)胞生長至鋪滿皿底80%時即可實驗。GK（50 μg/mL）預(yù)處理3 h，然后添加150 mmol/LD-半乳糖造模6 d，另設(shè)置不含藥物的對照組。除去培養(yǎng)液，500 μL PBS 清洗1 遍，吸凈PBS，加入300 μL 4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌3 遍，每次5 min；TritonX-100 通透30 min，PBS 洗滌2 遍；加入1%牛血清白蛋白封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜；PBS 洗滌3 遍，每次5 min，加入二抗，室溫避光孵育2 h；PBS 洗滌3 遍，每次5 min，加入100 μL DAPI 染核5～10 min；PBS 洗滌1 遍，載玻片滴10 μL 封片液（PBS-甘油1∶1），取出爬片，倒扣于載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，使用Image J 軟件進(jìn)行分析。

2.5 ELISA 檢測IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平

將原代星形膠質(zhì)細(xì)胞以1.6×105個/孔接種于6孔板，待細(xì)胞生長至鋪滿皿底80%時即可實驗。GK（50 μg/mL）預(yù)處理3 h，然后添加150 mmol/LD-半乳糖造模6 d，另設(shè)置不含藥物的對照組。收集上清液，按照試劑盒說明書檢測IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 GK 抑制D-半乳糖誘導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞衰老

如圖1 所示，與對照組比較，D-半乳糖誘導(dǎo)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中β-半乳糖苷酶表達(dá)（P＜0.001），上調(diào)p53 和p21 表達(dá)（P＜0.05、0.01），抑制Lamin B1 和Ki67 表達(dá)（P＜0.01），成功構(gòu)建了星形膠質(zhì)細(xì)胞的衰老模型。50 μg/mL GK 干預(yù)6 d 可顯著抑制β-半乳糖苷酶陽性表達(dá)（P＜0.001），下調(diào)p53 和p21 蛋白表達(dá)（P＜0.05），上調(diào)Lamin B1 和Ki67 的表達(dá)（P＜0.01）。表明GK 具有抑制D-半乳糖誘導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞衰老的作用。

圖1 GK 抑制D-半乳糖誘導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞衰老Fig. 1 GK inhibits D-galactose induced senescence in primary astrocytes

3.2 GK 抑制D-半乳糖誘導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型

衰老相關(guān)分泌表型是衰老細(xì)胞分泌的一系列促炎因子、趨化因子或生長因子等現(xiàn)象，可對細(xì)胞的微環(huán)境和鄰近細(xì)胞產(chǎn)生影響。如圖2 所示，在原代星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的一系列細(xì)胞因子中，D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型中IL-6 和IL-1β 水平無明顯增加，GK 也無明顯抑制作用；但衰老的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α 的分泌顯著升高（P＜0.01），而GK 干預(yù)后顯著抑制TNF-α 的分泌（P＜0.05），提示GK可抑制衰老相關(guān)分泌表型中TNF-α 的分泌。

圖2 GK 抑制D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老相關(guān)分泌表型 (±s, n = 3)Fig. 2 GK inhibits D-galactose induced secretory-associated senescence phenotype (±s, n = 3)

3.3 GK 促進(jìn)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞營養(yǎng)因子釋放

分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子是星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能之一，可以對神經(jīng)元的生長發(fā)育和功能維持起到營養(yǎng)作用。如圖3 所示，與對照組比較，模型組BDNF蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），表明衰老的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌營養(yǎng)因子的功能下降；與模型組比較，GK 顯著上調(diào)BDNF 蛋白表達(dá)（P＜0.05）。

3.4 GK 促進(jìn)SIRT1 表達(dá)和自噬功能

SIRT1 被稱為“長壽”蛋白，也被稱為細(xì)胞年輕化標(biāo)志分子，與多種生物的衰老過程密切相關(guān)，據(jù)報道SIRT1 可通過去乙酰化抑制p53 的表達(dá)[9]，從而抑制p21 的表達(dá)[10]。自噬與衰老之間存在聯(lián)系，細(xì)胞在響應(yīng)衰老信號的誘導(dǎo)時，自噬被抑制，受損的蛋白和細(xì)胞器無法及時降解，將進(jìn)一步促進(jìn)衰老通路的激活，導(dǎo)致細(xì)胞衰老標(biāo)志物的累積和生長停滯[11]。如圖4 所示，衰老的星形膠質(zhì)細(xì)胞SIRT1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），而GK 可以上調(diào)SIRT1 蛋白表達(dá)（P＜0.05）。同時D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老星形膠質(zhì)細(xì)胞LC3-Ⅱ/I 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），自噬底物標(biāo)志p62 蛋白表達(dá)升高（P＜0.001），表明細(xì)胞此時的自噬活動減少，導(dǎo)致p62 標(biāo)記的降解物積聚。GK 干預(yù)則增加LC3-Ⅱ/I 蛋白表達(dá)（P＜0.01），降低泛素化蛋白p62 蛋白表達(dá)（P＜0.01），增加細(xì)胞此時的自噬活動，減少p62 標(biāo)記的降解物積聚。以上結(jié)果提示GK 可能通過上調(diào)SIRT1 表達(dá)，同時促進(jìn)BDNF 產(chǎn)生和細(xì)胞自噬，多維度協(xié)同達(dá)到抗細(xì)胞衰老的效應(yīng)。

圖4 GK 促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞SIRT1 表達(dá)和自噬功能 (±s, n = 3)Fig. 4 GK promotes SIRT1 expression and autophagy functions in astrocytes (±s, n = 3)

4 討論

衰老細(xì)胞不同于凋亡細(xì)胞，具有廣泛的代謝活性，但無增殖能力。自首次從體外培養(yǎng)非永生化成纖維細(xì)胞觀察到“細(xì)胞復(fù)制性衰老”現(xiàn)象以來，至今對衰老大腦的廣泛研究已經(jīng)確定腦細(xì)胞的衰老是神經(jīng)變性和認(rèn)知能力下降的關(guān)鍵因素。研究證明，細(xì)胞衰老與阿爾茨海默病、帕金森病以及多發(fā)性硬化等多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[12-13]，研究報道，在阿爾茨海默病患者的額葉皮質(zhì)中，衰老標(biāo)志蛋白p16ink4a陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著高于非阿爾茨海默病的同齡人[14]。另有研究報道，黃芪甲苷可通過促進(jìn)有絲分裂自噬來抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的衰老，從而改善帕金森病模型中的多巴胺能神經(jīng)變性[15]，這些報道表明靶向星形膠質(zhì)細(xì)胞的衰老可能是治療或改善與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的一種潛在的治療方式。

β-半乳糖苷酶來源于GLB1基因編碼的β-D-半乳糖苷酶，隨著細(xì)胞的衰老，增殖能力下降，其數(shù)量和大小不斷累積，其活性與衰老程度高度相關(guān)，在具有分化能力的細(xì)胞中無法檢測到，因此β-半乳糖苷酶一直是體內(nèi)外鑒定衰老細(xì)胞最廣泛使用的生物標(biāo)志物[16]。p53 蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，在DNA 損傷時激活導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯，指導(dǎo)細(xì)胞和機體的衰老。p21 是p53的下游基因，其表達(dá)受p53 調(diào)控，p21 可抑制細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）的活性，具有和細(xì)胞周期蛋白N端和C端結(jié)合位點以及增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的C端結(jié)合位點，可與CDK 復(fù)合物結(jié)合并抑制其活性，進(jìn)而阻滯細(xì)胞周期[17]。Lamin B1 是一種核中間絲蛋白，在DNA 復(fù)制、有絲分裂紡錘體的形成、基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞增殖的維持中起著至關(guān)重要的作用。Lamin B1 的下調(diào)是衰老后的關(guān)鍵介質(zhì)，是局部染色質(zhì)變化的觸發(fā)因素，從而影響整體的基因表達(dá)[18]。D-半乳糖廣泛用于體內(nèi)外建立衰老模型，在本研究中，使用D-半乳糖誘導(dǎo)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞衰老，150 mmol/LD-半乳糖處理6 d 可成功構(gòu)建細(xì)胞衰老模型，表現(xiàn)為β-半乳糖苷酶染色和衰老標(biāo)志物p53、p21 蛋白表達(dá)增加，Lamin B1 蛋白表達(dá)下降，這些結(jié)果表明該條件可以成功誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的衰老模型。GK 的干預(yù)可以抑制β-半乳糖苷酶染色和衰老標(biāo)志物p53、p21 蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)Lamin B1 蛋白表達(dá)增加。Ki67 染色在臨床上被廣泛用作增殖指標(biāo)，其在細(xì)胞分裂S 期、G2期和M 期積累，G1期和G0期即降解，因此Ki67 是細(xì)胞周期進(jìn)行和靜止期的分級標(biāo)志物[19]。本研究結(jié)果顯示，對照組和GK 組Ki67 表達(dá)顯著多于模型組，表明正在進(jìn)行分裂增殖的細(xì)胞明顯多于模型組，GK 可促進(jìn)細(xì)胞增殖。這些研究數(shù)據(jù)表明GK 可以在體外抑制由D-半乳糖誘導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的衰老，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

衰老相關(guān)分泌表型是衰老的細(xì)胞分泌細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶等信號分子的總稱。衰老的細(xì)胞分泌這些因子會改變局部組織微環(huán)境導(dǎo)致長期慢性炎癥。這些因子不僅以自分泌的方式促進(jìn)細(xì)胞自身的衰老，還以旁分泌的方式影響周圍細(xì)胞的衰老[20]。衰老相關(guān)分泌表型可導(dǎo)致衰老相關(guān)炎癥、代謝失調(diào)、慢性疾病、老年綜合征和恢復(fù)力喪失等，減少衰老相關(guān)分泌表型的相關(guān)分泌也是臨床的一種干預(yù)方式[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，衰老的星形膠質(zhì)細(xì)胞會增加TNF-α 的分泌，而GK 可以減少TNF-α 的分泌。其他細(xì)胞因子IL-6 和IL-1β 可能受限于體外培養(yǎng)，細(xì)胞含量少，細(xì)胞因子水平處于試劑盒檢測下限，所以GK 也沒能顯示明顯抑制作用。

BDNF 可以促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生，對神經(jīng)元的營養(yǎng)支持作用是星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能之一。衰老的星膠分泌營養(yǎng)因子功能下降，而GK 可以促進(jìn)BDNF 的分泌，恢復(fù)其部分功能。在帕金森病患者和動物模型中也發(fā)現(xiàn)其黑質(zhì)紋狀體通路中BDNF 水平下降，因此BDNF 可能可以作為一種治療分子。但相關(guān)研究卻表明外源性BDNF 直接送入大腦并不能緩解癥狀，且神經(jīng)營養(yǎng)因子血腦通透性差、半衰期短、生物利用度差[22]，或許促進(jìn)腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌營養(yǎng)因子是一種更加行之有效的方法。

SIRT1 是一種NAD+依賴的去乙酰化酶，主要位于細(xì)胞核內(nèi)，可以去乙酰化某些關(guān)鍵蛋白，從而調(diào)控衰老信號通路。據(jù)報道，SIRT1 可以去乙酰化非組蛋白底物p53，改變其轉(zhuǎn)錄活性，從而參與細(xì)胞衰老和生物體壽命的調(diào)節(jié)[23]。SIRT1 也被稱為長壽調(diào)節(jié)因子，增加SIRT1 的表達(dá)可以延長多種生物的壽命，包括酵母、蒼蠅、蠕蟲和哺乳動物等[24]，而SIRT1 在體內(nèi)的蛋白和轉(zhuǎn)錄水平會隨著年齡的增加而下降[25]，同樣，過表達(dá)小鼠大腦中SIRT1 水平可以顯著延長小鼠的壽命[26]。進(jìn)一步研究表明SIRT1 具有抗衰老的作用，可以促進(jìn)機體或細(xì)胞年輕化，近年來，靶向SIRT1 來預(yù)防和治療衰老相關(guān)疾病已經(jīng)引起人們的注意。本研究發(fā)現(xiàn)GK 可以顯著激活SIRT1 的表達(dá)，表明GK 的抗衰老作用可能與SIRT1 有關(guān)。

自噬是一種分解細(xì)胞內(nèi)成分的過程，可降解和回收細(xì)胞中一些受損或不需要的成分，以維持能量穩(wěn)態(tài)和保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激，自噬在發(fā)育和疾病的過程中起著至關(guān)重要的作用。近年來研究表明自噬激活與延長壽命之間存在正相關(guān)，在調(diào)節(jié)衰老中發(fā)揮著重要作用。衛(wèi)星細(xì)胞隨著年齡的增長，自噬現(xiàn)象消失，導(dǎo)致受損蛋白和細(xì)胞器累積，繼而引發(fā)衰老和干細(xì)胞耗竭[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)衰老的星形膠質(zhì)細(xì)胞LC3-Ⅱ/I 的表達(dá)減少，p62 表達(dá)增加。而GK 干預(yù)則可促進(jìn)LC3-Ⅱ/I 的表達(dá)上升，p62 表達(dá)減少，LC3II 是自噬形成的前體物質(zhì)，在衰老的星形膠質(zhì)細(xì)胞中自噬被抑制，從而導(dǎo)致自噬底物標(biāo)志物p62不能及時被降解而增多，而GK 可以促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的自噬現(xiàn)象，提示GK 可能通過促進(jìn)自噬來抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的衰老，但分子機制仍有待進(jìn)一步深入研究加以闡明。另有相關(guān)研究報道，在衰老的細(xì)胞中，自噬系統(tǒng)被激活[29]，與本研究結(jié)果相反，這可能與細(xì)胞種類不同或不同的衰老模型有關(guān)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)GK 具有顯著的抗衰老作用，能夠促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和營養(yǎng)因子分泌，減少炎癥因子TNF-α 的分泌，同時促進(jìn)自噬和SIRT1表達(dá)。大量研究顯示細(xì)胞的衰老是一個非常復(fù)雜的過程，是由諸多因素動態(tài)平衡紊亂導(dǎo)致的結(jié)局。GK介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞抗衰老作用可能通過上調(diào)SIRT1 表達(dá)，同時促進(jìn)BDNF 產(chǎn)生和細(xì)胞自噬，多維度協(xié)同達(dá)到抗細(xì)胞衰老的效應(yīng)。至于SIRT1 上調(diào)、BDNF 產(chǎn)生和細(xì)胞自噬相互間的關(guān)系，以及在GK抗衰老作用中的權(quán)重值得進(jìn)一步利用現(xiàn)代細(xì)胞-分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行探索和驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突