艷山姜揮發油自乳化釋藥系統的毒性及對Caco-2 細胞單層細胞旁轉運與P-糖蛋白的影響

吳朝花，何 麗，肖 婷，陳 英，甘詩泉，沈祥春*，陶 玲*

1. 貴州醫科大學第二附屬醫院，貴州 凱里 556000

2. 貴州醫科大學藥學院 藥用植物功能與應用國家重點實驗室，貴州省天然藥用資源高效利用工程中心，貴州 貴安新區 550025

3. 貴州醫科大學藥學院 藥物藥理教研室，貴州省天然藥物藥理與可藥性高等教育重點實驗室，貴陽市聯合重點實驗室，天然藥物資源優化利用重點實驗室，貴州 貴安新區 550025

艷山姜為姜科山姜屬植物艷山姜Alpinia zerumbet(Pers.) Burtt. et Smith 的干燥成熟果實，其主要化學成分為揮發油類、黃酮類、二萜類和有機酸類等化合物。課題組前期對艷山姜主要活性部位進行了考察，結果表明，艷山姜揮發油（essential oil ofFructusAlpiniazerumbet，EOFAZ）為主要活性部位，具有抗心肌缺氧、抗動脈粥樣硬化、降壓作用和抗心肌缺血等藥理作用[1-7]。EOFAZ 作為治療心血管疾病的潛在藥物，具有較大的開發和利用價值。但EOFAZ 為油狀液體，水溶性差，易揮發，傳統劑型嚴重限制了其在臨床應用的發展。

自乳化釋藥系統（self-emulsifying drug delivery system，SEDDS）是由油相、乳化劑和助乳化劑以及藥物組成，在胃腸道內通過胃腸道蠕動可自發乳化形成粒徑透明、動力學穩定的藥物傳遞系統[8]，其具有增加藥物表面積和溶解度，提高溶出度和滲透率，提高藥物生物利用度，因而成為提高難溶藥物溶出度和生物利用度方面的研究熱點[9-12]。在前期研究中，課題組將EOFAZ 成功制備成EOFAZSEDDS[13]。然而SEDDS 處方中含有大量乳化劑，乳化劑可能會刺激胃腸道[14-17]，同時乳化劑及其代謝產物在機體內引起的生物學變化，亦對機體可能造成的毒副作用包括急性毒性、亞急性毒性、慢性毒性等[18]，另一方面，大劑量乳化劑可引起膜損傷和細胞死亡[19]，此外，乳化劑還可通過改變腸粘膜屏障通透性等來影響藥物滲透性[20]，且本研究所用乳化劑Kolliphor HS 15 的安全劑量、耐受劑量其對腸黏膜屏障通透性的影響未見報道。因此，對EOFAZ-SEDDS 的安全性及其對腸黏膜屏障通透性的影響進行考察具有一定的必要性。

人結直腸腺癌Caco-2 細胞在培養條件下可形成完整致密的極性單細胞層，該細胞層的形態和功能類似人體小腸上皮層。已有研究證實Caco-2 細胞保留了P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）高表達的特性，可在有代謝狀況下測定藥物的跨膜轉運[21-22]，并且藥物透過Caco-2 細胞的體外過程與藥物口服后在體內的吸收和代謝有良好的相關性[23]。因此，Caco-2 細胞是快速篩選腸吸收和細胞毒性研究的可靠且廣泛使用的體外模型。

P-gp 是由多藥耐藥基因1（multi-drug resistance gene l，MDR1）基因編碼的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）能量依賴的多藥耐藥外排泵。腸道內的P-gp 可將其底物從腸上皮細胞泵回到腸腔而限制藥物的吸收，因此P-gp 的功能和（或）表達的變化，可能影響藥物的藥動學參數，導致其生物利用度的改變，從而影響其吸收、分布、代謝、排泄和毒性，也會影響化合物與藥物、藥物與藥物、食物與藥物、草藥與藥物、草藥與草藥的相互作用[24-26]。

本研究在前期基礎上進一步采用Caco-2 細胞考察EOFAZ-SEDDS 的細胞毒性，及其對Caco-2 細胞單層通透性和P-gp 表達及功能的影響；采用KM小鼠考察EOFAZ-SEDDS 的體內毒性，為EOFAZSEDDS 進一步開發和合理應用提供參考，為更好地合理利用艷山姜資源從而發揮貴州民族醫藥產業奠定一定的實驗基礎。

1 材料

1.1 動物和細胞

SPF 級昆明種小鼠，雌雄各半，體質量18～22 g，6～8 周齡，購自貴州醫科大學動物中心，動物合格證號SCXK（黔）2017-0001，實驗動物使用許可證號SYXK（黔）2017-0001。所有小鼠均自由攝食和飲水，適應性喂養7 d，室溫保持在20～23 ℃，相對濕度保持在40%～70%。動物實驗得到貴州醫科大學倫理委員會批準（批準號No.1800459）。

Caco-2 細胞購自中國上海富恒細胞中心。

1.2 藥材

艷山姜購自貴州省黔西南州貞豐縣連環鄉巧巖村，經貴州醫科大學張旭副教授鑒定為艷山姜A.zerumbet(Pers.) Burtt. et Smith 的成熟果實，憑證標本編號20150930，保存于貴州醫科大學藥學院天然藥物資源優化利用重點實驗室（貴陽）。

1.3 藥品與試劑

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒（批號A020-2）購自南京建成生物工程研究所；MTT（批號911L051）、羅丹明123（批號1214E051）購自北京索萊寶科技有限公司；P-gp 抗體（批號ab170904）購自英國Abcam 公司；甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號60004-1-g）、二抗（批號SA00001-2）購自美國Proteintech 公司。

1.4 儀器

700-SERIES 型超低溫冰箱、3020-426 型多功能全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；HF240型CO2培養箱（上海力申科學儀器有限公司）；CFX 型凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）；5810R型冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；SIM-F140AY65型制冰機（日本SANYO 電子有限責任公司）；NovoCyte 流式細胞儀（艾森生物杭州有限公司）。

2 方法

2.1 艷山姜揮發油的提取制備

將艷山姜干燥果實破碎至種子破裂，按《中國藥典》2020 年版要求均勻取樣，精密稱取500 g，加12 倍蒸餾水浸泡1 h，按《中國藥典》2020 年版四部通則2204 揮發油測定法提取7 h，收集揮發油，經無水硫酸鈉干燥后，-20 ℃冰箱儲存備用。艷山姜揮發油經GC-MS 檢測，其主要化學成分為β-蒎烯、α-蒎烯、莰烯及1,8-桉葉油醇等，相對質量分數分別為29.549%、9.861%、3.112%、0.248%[27]。

2.2 EOFAZ-SEDDS 的制備

將EOFAZ 與表面活性劑Kolliphor HS 15、乙醇以6∶2∶2 的質量比混合，輕輕搖勻[13]。

2.3 細胞培養

將Caco-2 細胞于含有完全DMEM 培養液（含20%熱滅活的胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺、1%青霉素-鏈霉素）的塑料細胞培養瓶中培養。培養瓶置于37 ℃、5% CO2培養箱培養，每隔1 d 更換1 次培養液。當細胞融合度達到80%時，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA 混合消化液，輕輕搖晃培養瓶，放于培養箱中消化1 min，按1∶2 進行細胞傳代。使用第20～40 代的細胞進行細胞毒性和轉運實驗。

2.4 細胞毒性實驗

2.4.1 MTT 細胞活力實驗 設置空白組（無細胞無藥物）、對照組（無藥物），EOFAZ（24、36、48、60、72、84 μg/mL）組，EOFAZ-SEDDS 組（40、60、80、100、120、140 μg/mL，分別含24、36、48、60、72、84 μg/mL 的EOFAZ），Kolliphor HS 15＋無水乙醇組（16、24、32、40、48、56 μg/mL，相當于EOFAZ-SEDDS 各劑量組中Kolliphor HS 15 和無水乙醇混合物含量）。分別將各組與不同培養天數（1、3、5 d）的Caco-2 細胞溫育，每個質量濃度設6 個平行孔，培養24 h。每孔加20 μL MTT（5 mg/mL）溶液，孵育4 h。吸棄各孔液體，加入150 μL 二甲基亞砜，低速振搖10 min，用酶標儀于490 nm 處測定吸光度（A）值，計算細胞存活率。

2.4.2 LDH 活力實驗 設置對照組（無藥物），EOFAZ（24、36、48、60、72、84 μg/mL）組，EOFAZSEDDS 組（40、60、80、100、120、140 μg/mL），Kolliphor HS 15＋無水乙醇組（16、24、32、40、48、56 μg/mL）。收集對數生長期細胞，以4×105個/孔接種于6 孔板中，在37 ℃、CO2培養箱中培養5 d。分別將各組與Caco-2 細胞溫育24 h。按照試劑盒說明書測定各樣品的A值。

2.5 藥物對Caco-2 細胞單層通透性的影響

2.5.1 Caco-2 單層細胞模型的建立 將 0.012 mg/mL 的鼠尾膠原蛋白加入12 孔Transwell 小室中，開蓋在超凈工作臺中過夜晾干，或室溫放置1 h后，用PBS 洗3～4 次后直接使用。取處于對數生長期的Caco-2 細胞，以1×105個/孔接種于12 孔Transwell 培養板中。在12 孔Transwell 培養板的細胞內側（apical，AP）每孔加入0.5 mL DMEM 完全培養基，基底側（basolateral，BL）每孔加入1.5 mL DMEM 培養基，在接種后的第1 周內隔天更換培養基，1 周后每天更換培養基，直至第21 天，用細胞電阻儀測定Caco-2 細胞的跨內皮細胞電阻（transepithelium electrical resistant，TEER）值。

2.5.2 EOFAZ-SEDDS 對熒光黃滲透性的影響 根據MTT 和LDH 活力實驗結果，用培養基稀釋EOFAZ、EOFAZ-SEDDS、無水乙醇和Kolliphor HS 15 混合物、Kolliphor HS 15、無水乙醇，得到無毒濃度的EOFAZ（24 μg/mL）、EOFAZ-SEDDS（40 μg/mL）、無水乙醇和Kolliphor HS 15 混合物（16 μg/mL）、Kolliphor HS 15（8 μg/mL）、乙醇（8 μg/mL）。取建模成功的Caco-2 單層細胞模型小心吸去培養基，細胞單層用37 ℃的Hank’s 緩沖液洗細胞表面3 次，每次5 min，以除去殘余的培養基。洗滌后，AP 側分別入含受試樣品的Hank’s 緩沖液，并加入熒光黃（40 μg/mL），將1.5 mL 新鮮Hank’s緩沖液（pH 7.4、37 ℃）加到BL 側中。在15、30、45、60、120 min 從BL 側取出0.5 mL 樣品，并同時補充同溫同體積的空白Hank’s 緩沖液。用酶標儀在450 nm 的激發波長和520 nm 的發射波長下測量樣品的熒光值，并計算熒光黃滲透量。

2.6 Western blotting 考察EOFAZ-SEDDS 對P-gp蛋白表達的影響

Caco-2 細胞以4×105個/孔接種于6 孔板中培養，細胞融合度達到80%～90%后分別加入環孢素A（1 μmol/L，陰性對照），維拉帕米（80 μmol/L，陽性對照）以及不同質量濃度的EOFAZ（6、12、24 μg/mL）、EOFAZ-SEDDS（10、20、40 μg/mL）、單一表面活性劑（2、4、8 μg/mL）、表面活性劑混合物（4、8、16 μg/mL），另設置不含藥物的對照組。溫育24 h 后，吸去培養液，用預冷的PBS 潤洗3次，加入細胞裂解緩沖液，置于搖床上振搖20 min，收集細胞，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，吸取上清液，采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，加入5%牛血清白蛋白的TBST 溶液，封閉1 h。分別加入P-gp（1∶1000）、GADPH（1∶10 000）抗體，4 ℃孵育過夜；漂洗3 次，每次10 min，加入二抗（1∶7000），孵育2 h，TBST 洗滌3次，使用ECL 化學發光試劑盒進行顯色，然后將膜置于凝膠成像系統進行曝光，隨后用Image-Lab 軟件對數字圖像進行量化。

2.7 羅丹明123 攝取法考察EOFAZ-SEDDS 對P-gp 功能的影響

精密稱取0.2 mg 羅丹明123，用超純水配成質量濃度為500 μmol/L 的羅丹明123 溶液。將處于對數生長期的Caco-2 細胞用胰酶消化，用含20%胎牛血清的DMEM 重懸為單個細胞，計數，4 ℃、1500 r/min 離心5 min，棄去上清，用PBS 分散成細胞密度為1×106個/mL 的細胞懸液，取0.5 mL 至1.5 mL EP 管中，1500 r/min 離心5 min，棄上清，分別加入0.5 mL 維拉帕米（50 μmol/L，陽性對照）以及不同質量濃度的EOFAZ（6、12、24 μg/mL）、EOFAZSEDDS（10、20、40 μg/mL）、單一表面活性劑（2、4、8 μg/mL）、表面活性劑混合物（4、8、16 μg/mL），另設置不含藥物的對照組。于37 ℃、5% CO2培養60 min，置冰上終止轉運，4 ℃、2500 r/min 離心5 min，棄上清，用預冷的PBS 洗滌2 次，離心后棄上清。加入羅丹明123，37 ℃、5% CO2培養60 min，置冰上終止作用，4 ℃、2500 r/min 離心5 min，棄上清，用預冷的PBS 洗滌2 次，離心后棄上清，加入0.5 mL PBS 輕輕吹打，制成單個細胞懸液（1×104個細胞）。采用流式細胞術測定檢測胞內羅丹明123 平均熒光強度（激發波長為488 nm、發射波長為535 nm）。

2.8 EOFAZ-SEDDS 的小鼠急性毒性試驗

2.8.1 最高致死量和最低致死量的試驗研究 預試驗目的是為了找出引起動物LD0和100%（LD100）死亡的劑量，以便安排正式實驗。取小鼠20 只，體重18～22 g，每個試驗組4 只動物，雌雄各半，進行預試驗[28]。給藥前小鼠禁食不禁水過夜，一次性口服不同劑量的EOFAZ-SEDDS，測定最大耐受劑量（LD0）、絕對致死量（LD100）。預試驗結果表明，小鼠口服制劑的LD0和LD100分別為4 g/kg 和7 g/kg，組間劑量比為1∶1.150 1。

2.8.2 小鼠急性毒性試驗研究 根據預試驗獲得的最高致死量和最低致死量對正式試驗進行分組，共5 組，每組試驗動物10 只，雌雄各半。給藥最高劑量為7 g/kg，給藥前小鼠禁食不禁水過夜，給藥后立刻觀察小鼠的外觀體征、飲食欲、行為活動、大小便、中樞神經系統癥狀、呼吸系統等情況，死亡情況，給藥后連續觀察14 d。對在試驗中死亡的動物以及試驗結束時處死的動物進行解剖，對組織器官出現的體積、顏色等改變進行詳細記錄。根據每組藥物各劑量動物的死亡數，用。按Bliss 機率單位法計算半數致死劑量（median lethal dose，LD50）及其95%可信限評估EOFZA-SEDDS 制劑對小鼠的急性毒性。給藥后逐日觀察并記錄中毒反應、死亡率和死亡情況。給藥后連續觀察14 d。對在試驗中死亡的動物以及試驗結束時處死的動物進行解剖，對組織器官出現的體積、顏色等改變進行詳細記錄。

2.9 統計學分析

3 結果

3.1 細胞毒性實驗

3.1.1 MTT 細胞活力實驗 如圖1 所示，與對照組比較，無水乙醇與Kolliphor HS 15 混合物在16～56 μg/mL（相當于60～140 μg/mL 的EOFAZ-SEDDS中所含混合乳化劑的量）對培養5 d Caco-2 細胞存活率沒有影響，但顯著增加培養1、3 d 的Caco-2 細胞存活率（P＜0.05、0.01）。與EOFAZ 組比較，EOFAZ-SEDDS 處理培養1、3、5 d 的Caco-2 細胞24 h 后細胞存活率均顯著升高（P＜0.05、0.01），表明 EOFAZ 的細胞毒性比含有等量 EOFAZ 的SEDDS 的細胞毒性大，說明將EOFAZ 制備成SEDDS 后降低了EOFAZ 的細胞毒性，乳化劑混合物對細胞活力沒有影響。

圖1 EOFAZ-SEDDS 對培養1 (A)、3 (B)、5 d (C) 的Caco-2 細胞活力的影響 (±s, n = 3)Fig. 1 Effect of EOFAZ-SEDDS on cell viability of Caco-2 cells cultured for 1 (A), 3 (B), 5 d (C) (±s, n = 3)

3.1.2 LDH 活力實驗 如圖2 所示，與對照組比較，EOFAZ（24～84 μg/mL）、EOFAZ-SEDDS（60～140 μg/mL）、乳化劑混合物（48～56 μg/mL）顯著升高細胞LDH 外漏率（P＜0.05、0.01）。與EOFAZ組比較，EOFAZ-SEDDS（60～140 μg/mL）組LDH外漏率顯著降低（P＜0.05、0.01）；與EOFAZ-SEDDS組比較，乳化劑混合物（24～56 μg/mL）組LDH 外漏率顯著降低（P＜0.05、0.01）。表明高濃度乳化劑混合物可損傷細胞膜，將EOFAZ 制備成EOFAZSEDDS 降低了EOFAZ 的細胞毒性。

圖2 EOFAZ-SEDDS 對Caco-2 細胞LDH 外漏率的影響 (±s, n = 3)Fig. 2 Effect of EOFAZ-SEDDS on leakage rate of LDH in Caco-2 cells (±s, n = 3)

3.2 藥物對Caco-2 細胞單層通透性的影響

3.2.1 Caco-2 單層細胞模型的建立 培養21 d 后Caco-2 細胞的TEER 值＞1000 Ω·cm2，細胞單層膜的AP 側和BL 側培養基中堿性磷酸酶的活力比大于3∶1，熒光黃由細胞膜單層AP 側的表觀滲透系數（apparent permeability coefficient，Papp）值為（3.57±1.75）×10-7cm/s，說明細胞單層的緊密性良好，滿足實驗要求。

3.2.2 EOFAZ-SEDDS 對熒光黃滲透性的影響 如圖3 所示，EOFAZ、EOFAZ-SEDDS、無水乙醇和Kolliphor HS 15 混合物、Kolliphor HS 15 和無水乙醇可以影響細胞旁通透性，進而影響腸吸收。

圖3 藥物對Caco-2 單層的熒光黃滲透性的影響 (±s,n = 3)Fig. 3 Effect of samples on Lucifer yellow permeability of Caco-2 monolayer (±s, n = 3)

3.3 Western blotting 考察EOFAZ-SEDDS 對P-gp蛋白表達的影響

如圖4 所示，與對照組比較，EOFAZ（12、24 μg/mL）組Caco-2 細胞中P-gp 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），EOFAZ-SEDDS（10、20、40 μg/mL）組、Kolliphor HS 15（8 μg/mL）組、無水乙醇（2、4、8 μg/mL）組、Kolliphor HS 15＋無水乙醇混合物（8 μg/mL）組P-gp 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05、0.01）。表明EOFAZ 可抑制P-gp 的表達，而EOFAZSEDDS、Kolliphor HS 15、無水乙醇、Kolliphor HS 15 和無水乙醇混合物均可誘導P-gp 的表達。

圖4 EOFAZ-SEDDS 對P-gp 蛋白表達的影響 (±s, n = 3)Fig. 4 Effect of EOFAZ-SEDDS on P-gp protein expression (±s, n = 3)

3.4 羅丹明123 攝取法考察EOFAZ-SEDDS 對P-gp 功能的影響

如圖5 所示，與對照組比較，EOFAZ（6、12、24 μg/mL）組、EOFAZ-SEDDS（40 μg/mL）組細胞內羅丹明123 熒光強度顯著增加（P＜0.05），Kolliphor HS 15、無水乙醇、Kolliphor HS 15＋無水乙醇混合物在所考察濃度范圍內對細胞內羅丹明123 的熒光強度增強作用與對照組比較無顯著性差異。表明EOFAZ 和高劑量的EOFAZ-SEDDS 均對P-gp 外排功能具有抑制作用，低、中劑量的EOFAZSEDDS、Kolliphor HS 15 與無水乙醇混合物、單獨Kolliphor HS 15 和無水乙醇對P-gp 外排功能沒有影響。

圖5 EOFAZ-SEDDS 對P-gp 功能的影響 (±s, n = 3)Fig. 5 Effect of EOFAZ-SEDDS on P-gp function (±s, n = 3)

3.5 EOFAZ-SEDDS 的小鼠急性毒性試驗

小鼠口服EOFAZ-SEDDS 制劑正式試驗結果發現，小鼠口服制劑的LD50為5.291 5 g/kg，LD50的95%可信限為4.927 8～5.682 1 g/kg（表1）。在小鼠口服EOFAZ-SEDDS 制劑給藥后，出現自主活動、探究、梳理、運動減少，同時出現嗜睡、僵住、強直性驚厥、震顫、俯臥、共濟失調、呼吸急促、呼吸困難、呼吸暫停、飲食欲下降、水樣便、尿失禁、流淚等癥狀，但停藥后恢復正常。將死亡后小鼠剖檢可見心、肝、脾、肺、腎的體積和顏色未發現任何異常改變。

表1 EOFAZ-SEDDS 對小鼠的急性毒性試驗結果Table 1 Acute toxicity test results of EOFAZ-SEDDS in mice

4 討論

Caco-2 細胞廣泛用作研究藥物腸道滲透和評價細胞毒性的體外模型，但在報道的細胞培養方案中仍存在相當大的差異。關鍵細胞培養參數的變化如培養持續時間，對Caco-2 細胞群的形態和功能特性有直接影響[29-30]。對于在細胞毒性和滲透試驗中使用的細胞的成熟度也沒有統一標準。Bu 等[31]證明具有不同融合度和成熟度的Caco-2 細胞對相同的藥物表現出不同的敏感性。故在本研究MTT 實驗中建立了一系列具有相同初始接種密度但不同培養持續時間的Caco-2 細胞。結果表明EOFAZ 處理培養不同天數的Caco-2 細胞24 h 后細胞存活率均顯著低于EOFAZ-SEDDS。與EOFAZ 相比，Caco-2 細胞對EOFAZ-SEDDS 產生顯著耐受性，推測可能是由于EOFAZ 留在胃腸道中形成的微乳液的乳滴中，從而限制其與腸細胞膜的接觸，從而降低其細胞毒性。MTT 結果表明，與對照組比較，16～56 μg/mL表面活性劑對Caco-2 細胞沒有顯示出任何毒性作用；而LDH 實驗結果表明，48～56 μg/mL 表面活性劑對細胞的毒性具有顯著性統計學意義。導致MTT 和LDH 測定結果差異的原因可能是兩者測定原理不同所致。

LDH 滲漏是細胞膜損傷的細胞毒性研究的經典生物標志物，當細胞損傷時，發生細胞凋亡或壞死而造成細胞膜結構破壞，導致細胞膜通透性改變，導致細胞質內的LDH 釋放到培養液中，因此LDH法通過檢測從細胞中釋放到培養液中的LDH 的活性，對細胞毒性進行定量分析[32]。MTT 檢測原理主要基于在線粒體中MTT 的酶促轉化，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能，在一定細胞數范圍內，MTT 結晶形成的量與存活細胞數呈正相關。Sambuy 等[33]證明表面活性劑的細胞毒性機制不是線粒體呼吸的抑制，而是通過影響膜完整性導致膜組分的溶解，進而產生細胞毒性。因此本研究LDH 結果顯示乳化劑混合物可損傷細胞膜，而MTT 檢測結果顯示乳化劑混合物對細胞線粒體沒有影響。

本研采用Caco-2 細胞單層模型考察EOFAZ、EOFAZ-SEDDS、Kolliphor HS 15、無水乙醇、無水乙醇和Kolliphor HS 15 混合物對細胞旁通透性的影響，結果表明，EOFAZ、EOFAZ-SEDDS、無水乙醇和Kolliphor HS 15 混合物、單獨的Kolliphor HS 15和無水乙醇均可顯著增加細胞旁通透性。而用于熒光黃滲透性實驗的EOFAZ、賦形劑或SEDDS 的濃度均為安全濃度，表明EOFAZ、賦形劑或SEDDS的滲透增強作用可能不是由細胞毒性引起的，即EOFAZ、賦形劑、SEDDS 改變細胞單層屏障功能可能是由于損傷細胞間緊密連接所致。已有研究表明乙醇作用后腸上皮屏障通透性增加達到峰值后又逐漸恢復，乙醇是通過短暫性破壞細胞緊密連接的完整性進而增加腸上皮屏障通透性[34]。然而對于EOFAZ、Kolliphor HS 15 或SEDDS 的滲透增強作用是否可逆有待進一步研究。因此，當EOFAZ、EOFAZ-SEDDS 與被動轉運藥物（如阿昔莫司）聯合用藥時，可能會增加被動轉運藥物的生物利用度。

本研究使用Caco-2 單層作為小腸模型評估了EOFAZ、EOFAZ-SEDDS 或賦形劑對腸P-gp 表達和功能的影響。結果表明EOFAZ 可抑制P-gp 的功能和表達，EOFAZ-SEDDS 誘導P-gp 的表達，低、中劑量的EOFAZ-SEDDS 對P-gp 的功能沒有影響，只有高劑量的EOFAZ-SEDDS 抑制P-gp 外排功能；乳化劑雖然誘導了P-gp 的表達但對其功能沒有影響。由此可見，在一定的濃度范圍內EOFAZ-SEDDS雖然誘導了P-gp 的表達但其外排功能并沒有增加，這可能與Caco-2 細胞表面新近表達的P-gp 功能缺失有關，研究表明新表達的P-gp 需要大約10 d 的時間才能發揮其全部功能[35]。另一方面可能是因為EOFAZ 停留在形成的微乳液的乳滴中，因此減弱了EOFAZ 對P-gp 功能的抑制作用，當濃度較高時，乳液中游離的EOFAZ 達到一定濃度才發揮了其對P-gp 功能的抑制作用。因此EOFAZ 或較大劑量的EOFAZ-SEDDS 抑制P-gp 的功能增強P-gp 底物的口服吸收，長期應用EOFAZ 或較大劑量的EOFAZSEDDS 可能通過抑制腸道以及其他器官P-gp 的功能而降低P-gp 的活性，改變其他P-gp 底物的生物利用度。

小鼠口服EOFAZ-SEDDS 制劑正式試驗結果發現EOFAZ-SEDDS 對小鼠實際無毒。在急性毒性實驗中，受試物的給藥容量受試驗動物胃的內容物的影響，若給藥途徑為口服給藥，小鼠和大鼠在給藥前須禁食，可自由飲水。嚙齒動物禁食時間的長短也會影響藥物代謝酶的活性以及受試物在腸道中的吸收，所以小鼠和大鼠在給藥前須嚴格禁食12 h，給藥時間最好在上午。在口服藥品的急性毒性試驗中，給藥體積也會影響受試藥物的吸收，從而影響動物死亡率，故本研究選擇適宜的給藥體積，使每只動物在給藥容量上相等。

綜上，EOFAZ-SEDDS 對小鼠實際無毒，此外制備所得的EOFAZ-SEDDS 可以降低EOFAZ 的細胞毒性，但改變Caco-2 細胞單層屏障功能，同時誘導P-gp 表達，在一定濃度范圍內對P-gp 功能沒有影響。本研究有待于進一步觀察EOFAZ-SEDDS 作用后，P-gp 表達程度與其活性之間的相關性是否與Caco-2 細胞表面新近表達的P-gp 功能缺失有關，以為臨床合理用藥提供實驗性參考依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突