逍遙散拆方藥隊醋酸乙酯部位抗抑郁作用的HPA 軸-神經可塑性關聯調控機制研究

曾九僧，陳 力，彭 希，欒 飛，胡靖文，劉 蓉，曾 南*

1. 成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137

2. 成都中醫藥大學 西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137

3. 成都醫學院第一附屬醫院 藥劑科，四川 成都 610500

逍遙散作為經典名方，首載于宋朝《太平惠民和劑局方》，具有疏肝解郁、調和肝脾、養血健脾之功效，實驗研究及臨床應用中均被證實有確切的抗抑郁效果[1-3]。逍遙散拆方藥隊（CDB）是實驗室前期基于逍遙散功效拆方和均勻設計研究獲得的發揮抗抑郁作用的精簡組方[4-5]。研究表明，CDB 水煎劑通過上調腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）/磷酸化酪氨酸激酶受體B（phosphorylated tyrosine kinase receptor B，p-TrkB）/磷酸化環磷腺苷效應元件結合蛋白（phosphorylated cAMP-response element binding protein，p-CREB）通路活性，抑制下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamicpituitary-adrenal，HPA）軸-功能亢進，并調節5-羥色胺1A（5-hydroxytryptamine1A，5-HT1A）/5-HT2A受體平衡，顯著抑制慢性不可預見性溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）動物模型中的抑郁樣行為，且抗抑郁效果與全方逍遙散相當[6-7]。然而，CDB 中發揮抗抑郁作用的物質基礎和深入的作用機制需要進一步闡明，目前采用中藥復方提取物的特定萃取部位作為研究對象開展藥理學研究，不僅能遵循中醫理論的整體觀，而且能在保持復方整體性的前提下富集復方有效成分，對進一步揭示復方物質基礎與作用機制具有重要應用價值[8]。

HPA 軸的過度活躍是抑郁癥患者中重要的神經內分泌變化，海馬區神經可塑性的受損與抑郁癥的發病關系同樣密切，且2 種發病機制之間存在明顯的串擾[9]。研究表明，海馬不僅是神經發生的主要區域，也是HPA 軸負反饋的高位調節中樞，參與了壓力介導的應激反應[10-11]，為抑郁癥發生發展中的分子水平改變到結構水平變化提供了理論基礎，也為抑郁癥臨床治療提供了新的思路。本研究以反復注射糖皮質激素地塞米松誘導的小鼠抑郁模型為載體，從調節HPA 軸-神經可塑性關聯角度探究CDB 醋酸乙酯部位的抗抑郁作用機制，有助于豐富CDB 的抗抑郁作用研究內涵，同時可為經方逍遙散的二次開發提供更多的藥理學依據。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性ICR 小鼠，5 周齡，體質量22～24 g，由北京斯貝福生物技術公司提供，合格證號SCXK（京）2019-0010。所有動物均飼養在成都中醫藥大學藥學院動物觀察室[合格證號SYXY（川）2019-124）]，自由進食飲水，在24 h 明暗周期的環境中飼養，晝夜各12 h（開燈光照時間為8: 30～20: 30），溫度（25±1）℃，相對濕度40%～60%。所有動物的飼養和實驗操作均符合成都中醫藥大學實驗動物倫理委員會要求，批準號TCM-2019-312。

1.2 藥物

CDB 藥物配比與實驗室前期研究一致[5]，成人（60 kg）一日用量合計33 g 原生藥，CDB 所需的3種藥材均購自太極大藥房，柴胡（河北一仁藥業有限公司，產地山西，批號200801）為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.的干燥根，當歸（四川省中藥飲片有限責任公司，產地甘肅，批號201022）為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels 的干燥根，薄荷（江蘇東蓮藥業有限公司，批號210227）為唇形科植物薄荷MenthahaplocalyxBriq.的干燥地上部分。經成都中醫藥大學中藥鑒定教研室龍飛副教授鑒定均為正品，符合《中國藥典》2020年版要求。

將所需藥材適度粉碎，加8 倍量水浸泡1 h，武火加熱煮沸后，文火煎煮40 min，趁熱濾過；同法加6 倍量的水煎煮30 min 及6 倍量的水煎煮20 min；合并3 次濾液，減壓濃縮至1.2 g/mL，臨用前稀釋至所需濃度。

將所需藥材適度粉碎，以8 倍量的95%乙醇浸泡藥材12 h，回流提取3 次，每次3 h，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，得到醇提物。將醇提物分散在40 ℃純水中，質量濃度為1 g/mL，待恢復至室溫后，加入2 倍體積石油醚萃取，萃取8 次至近無色后，收集上層石油醚溶液，下層水溶液加入2倍體積的醋酸乙酯，萃取8 次至近無色，合并醋酸乙酯溶液，減壓濃縮并低溫烘干，冷凍干燥后獲得CDB 醋酸乙酯部位，得率為1.45%（即每100 克生藥經提取得到1.45 g CDB 醋酸乙酯部位）。采用UPLC-QE/MS 對CDB 醋酸乙酯部位的化學成分進行分析，結合文獻比對確定其主要的化學成分，進一步使用HPLC 法同時測定柴胡皂苷B2、柴胡皂苷A、阿魏酸、迷迭香酸、橙皮苷、綠原酸的平均質量分數為4.20%、3.22%、1.99%、0.79%、0.35%、0.16%。

1.3 藥品與試劑

鹽酸氟西汀膠囊（20 mg/粒，批號9833A）購自法國Patheon France 公司；無水乙醇（批號2020041001）、石油醚（批號2020041001）、醋酸乙酯（批號2020041001）購自成都市科隆化學品有限公司；地塞米松磷酸鈉注射液（批號2107208）購自國藥集團容生制藥有限公司；5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2′-deoxyuridine，Brdu，批號B5002）購自美國Sigma 公司；甲苯胺藍（批號190410）購自上海如吉生物科技發展有限公司；小鼠皮質酮（corticosterone，CORT）ELISA 試劑盒、小鼠促腎上腺皮質激素（adreno-cortico-tropic-hormone，ACTH）ELISA 試劑盒、小鼠促腎上腺皮質激素釋放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）ELISA 試劑盒、小鼠BDNF ELISA 試劑盒購自江蘇晶美生物科技公司，批號分別為JM-02344M1、JM-11447M1、JM-02792M1、JM-02487M1；磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K）兔多克隆抗體、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）兔多克隆抗體、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，pmTOR）兔多克隆抗體、mTOR 兔多克隆抗體、p-CREB 兔多克隆抗體、CREB 兔多克隆抗體、磷酸化糖皮質激素受體（phosphorylated glucocorticoid receptor，p-GR）兔多克隆抗體、GR 兔多克隆抗體、熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）兔多克隆抗體、BDNF 兔多克隆抗體購自美國CST 公司，批號分別為4228S、4060S、2983S、5536S、9198S、9197S、4161S、12041S、4877S、47808S；PI3K 兔多克隆抗體、Akt 兔多克隆抗體、血清和糖皮質激素調節蛋白激酶 1（serum and glucocorticoidinducible kinase 1，SGK1）、p-TrkB 兔多克隆抗體、TrkB 兔多克隆抗體、突觸生長蛋白（Synaptophysin）兔多克隆抗體、β-Tubulin 小鼠多克隆抗體購自上海Abmart 生物醫藥有限公司，批號分別為T40065、T40067、T55613、T55598、M047714、T55273、M20005；FK506 結合蛋白51（FK506 binding protein 51，FKBP51）兔多克隆抗體（批號DF13305）購自Affinity Biosciences 有限公司；突觸后致密蛋白95（postsynaptic density protein 95，PSD95）兔多克隆抗體（批號20665-1-AP）購自武漢Proteach 有限公司；β-actin 兔多克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔多克隆抗體、雙皮質素（doublecortin，DCX）小鼠多克隆抗體、Brdu 兔多克隆抗體、CY3 山羊抗兔熒光二抗、山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗購自武漢賽維爾生物科技有限公司，批號分別為GB15003、GB11002、GB11317、GB12051、GB21303、G1214、G1213。

1.4 儀器

RE-3000A 型旋轉蒸發儀（鄭州亞榮儀器有限公司）；UPK-10T 型純水儀（廣州優普科技有限公司）；BS323S 型電子天平（德國Sartorius 公司）；LGJ-18 型冷凍干燥機（北京松源華興科技發展有限公司）；ZZ-6 型小鼠自主活動測試儀（成都泰盟軟件有限公司）；ST16R 型冷凍離心機、Varioskan Flash全波長多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；2016 型轉輪式切片機（德國Leica 公司）；DS-U3 型切片成像系統（日本Nikon 公司）；Pannoramic250 型數字切片掃描儀（濟南丹吉爾電子有限公司）；DYY-6C 型電泳儀電源（北京六一儀器廠）；1658001 型Mini-ProteanTetra 小型垂直電泳槽、ChemiDoc 免染型化學發光凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 反復注射地塞米松誘導的抑郁小鼠模型建立及給藥

小鼠適應性喂養3 d，并在3 d 天內進行糖水偏好測試訓練。將純凈水和1%糖水放在一個鼠籠上，每隔12 h 將2 個水瓶交換位置，適應性喂養結束后，按照體質量隨機分為對照組、模型組、氟西汀（13.2 mg/kg）組、CDB 水煎液（生藥量22.0 g/kg）組和CDB 醋酸乙酯部位低、高劑量（0.159、0.319 g/kg，即生藥量11.0、22.0 g/kg）組。CDB 醋酸乙酯部位和氟西汀均采用含0.5%羧甲基纖維素鈉和0.5%聚山梨酯-80 的溶液進行配制。除對照組外，其余小鼠連續21d（每天9: 30～11: 00 時）ip 地塞米松（10 mg/kg）造模[12]，對照組ip 等體積生理鹽水。造模后4 h（13: 30～15: 00 時）各給藥組ig 相應藥物，對照組和模型組ig 等體積生理鹽水。在造模并給藥的第18～21 天完成行為學測試，行為學測試結束后12 h，麻醉小鼠取血并分離血清，冰臺上剖取海馬組織，立即置于液氮中，而后轉移至-80 ℃保存備用。

2.2 行為學測試

各組小鼠在造模并給藥的第17～21 天依次完成以下行為學測試：①飛濺測試：使用噴壺將10%蔗糖水噴灑于小鼠背部，連續噴灑8 次，總體積2 mL。然后將小鼠放回飼養鼠籠中累積記錄5 min 內小鼠梳洗背部被噴灑糖水部位的行為時間，即梳洗時間[13]。②懸尾測試：用膠帶將小鼠懸掛在懸尾儀中垂直金屬棒上，使其呈倒懸狀態，頭部距離底部臺面大于6 cm，適應2 min 后觀察并記錄隨后4 min內小鼠累計保持不動狀態的時間。③強迫游泳測試：在高30 cm、直徑20 cm 的圓柱型透明器皿中注入20 cm 深的清水，溫度（24±1）℃。將小鼠置于器皿內，適應2 min 后記錄隨后4 min 內小鼠累計不動時間。④糖水偏好測試：將小鼠單只放置于鼠籠中，每個鼠籠上放2 個已稱定質量的水瓶（分別為1%的糖水和純凈水），小鼠禁食禁水24 h 后進行測定，以小鼠3 h 內糖水偏好率（糖水偏好率＝糖水消耗量/總液體消耗量）作為評價指標[14]。⑤新穎抑制性攝食測試：實驗前小鼠禁食不禁水24 h，在自制敞箱底部覆蓋一層墊料，在敞箱中心區域放置一顆粒狀食物并用垂直光源進行照射凸顯。小鼠面向箱壁放置在平臺的角落，立即開始計時，記錄5 min內小鼠開始進食的時間（攝食潛伏期），超過5 min則按5 min 計[15]。

2.3 ELISA 法檢測小鼠血清CORT、ACTH 及CRH 水平

行為學測試結束后12 h，所有小鼠麻醉取血，靜置30 min，3500 r/min 離心15 min 分離血清，于-80 ℃低溫保存備用。按照試劑盒說明書測定血清CORT、ACTH 及CRH 水平。

2.4 甲苯胺藍染色法檢測海馬CA3 區尼氏小體

取小鼠大腦組織固定于4%中性多聚甲醛中，包埋后切片（2～3 μm），切片常規脫蠟至水，放入經預熱至50 ℃的1%甲苯胺藍水溶液中，并在56 ℃溫箱中染色25 min；蒸餾水洗后使用70%乙醇浸泡1 min；95%乙醇分化，鏡下控制分化程度，直至尼氏小體顯示清晰；無水乙醇迅速脫水，使用二甲苯透明，并用中性樹膠封固。采用數字切片掃描儀對切片進行圖像采集，每張切片先于40 倍鏡下觀察全部組織，觀察大體病變，選擇檢測區域采集3 張400 倍圖片，進行計數。

2.5 免疫熒光法檢測海馬齒狀回區Brdu 和DCX表達

小鼠取材前7 d，每組隨機取4 只小鼠ip Brdu（50 mg/kg）以標記分裂增殖的細胞，1 次/d，共注射7 次。剖取小鼠大腦組織固定于4%多聚甲醛中，包埋后切片（3 μm），切片常規脫蠟至水，用檸檬酸（pH 6.0）進行抗原修復，PBS（pH 7.4）洗滌后用組化筆畫圈，3%牛血清白蛋白封閉30 min 后，加入Brdu 兔抗（1∶200）、DCX 小鼠抗（1∶500）孵育過夜，PBS 洗滌后加熒光二抗［山羊抗兔（1∶300），山羊抗小鼠（1∶400）］避光室溫孵育50 min，PBS洗滌后滴加DAPI 避光室溫孵育10 min，PBS 洗滌后加入自發熒光淬滅劑孵育5 min 后洗滌。封片后使用全景切片掃描儀觀察并采集圖像，使用Indica labs（Halo v3.0.011.314）軟件定量觀測海馬齒狀回區的總細胞數，Brdu、DCX 陽性細胞數及Brdu/DCX雙陽性細胞數。

2.6 Western blotting 檢測海馬組織相關蛋白表達

稱取海馬組織約15 mg，加入10 倍體積的RIPA裂解液勻漿，冰上裂解1 h 后，12 000×g離心15 min，取上清液，BCA 法測定總蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液配制成樣品。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，封閉后，孵育p-GR 兔抗（1∶1000）、GR 兔抗（1∶1000）、SGK1 兔抗（1∶1000）、p-PI3K 兔抗（1∶1000）、PI3K 兔抗（1∶1000）、p-Akt 兔抗（1∶1000）、Akt兔抗（1∶1000）、p-mTOR 兔抗（1∶1000）、mTOR兔抗（1∶1000）、p-TrkB 兔抗（1∶1000）、TrkB 兔抗（1∶1000）、p-CREB 兔抗（1∶1000）、CREB 兔抗（1∶1000）、BDNF 兔抗（1∶1000）、Synaptophysin兔抗（1∶1000）、PSD95 兔抗（1∶5000）、GAPDH兔抗（1∶2000）、β-actin 兔抗（1∶2000）、β-Tubulin鼠抗（1∶2000），4 ℃孵育過夜。TBST 溶液洗膜，孵育二抗（1∶3000），洗膜后在凝膠成像系統中成像，使用Image Lab 凝膠圖像分析軟件分析條帶灰度值。

2.7 統計學分析

采用SPSS 21.0 統計軟件分析數據，正態分布計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組的組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK 法。

3 結果

3.1 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠行為學的影響

如表1 所示，與對照組比較，模型組小鼠在懸尾試驗、強迫游泳試驗中的不動時間顯著延長（P＜0.001），飛濺試驗中的梳洗時間顯著縮短（P＜0.01），且糖水偏好率顯著降低（P＜0.001），攝食潛伏期顯著延長（P＜0.001），上述行為學指標的異常，提示模型小鼠呈現出自我護理能力下降、自我激勵行為缺失等抑郁樣行為，主觀能動性下降，食物獲得感減弱，以及焦慮相關的抑郁樣行為。其中，糖水偏好率顯著降低能反映動物出現了快感缺失和大腦獎賞機制缺乏，是抑郁癥的核心癥狀之一，由此可認為反復注射地塞米松可誘導小鼠抑郁樣行為，表明模型構建成功。與模型組比較，CDB 醋酸乙酯部位各劑量組能顯著增加小鼠梳洗時間和糖水偏好率（P＜0.05、0.01），明顯縮短小鼠的懸尾/強迫游泳不動時間和攝食潛伏期（P＜0.05、0.01），表明CDB 醋酸乙酯部位對模型小鼠各項抑郁樣行為指標均有顯著改善作用。

表1 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠行為學的影響 (±s, n = 10)Table 1 Effect of CDB ethyl acetate fraction on behavior of depression model mice (±s, n = 10)

表1 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠行為學的影響 (±s, n = 10)Table 1 Effect of CDB ethyl acetate fraction on behavior of depression model mice (±s, n = 10)

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下表同#P ＜ 0.05 ##P ＜ 0.01 ###P ＜ 0.001 vs control group; *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 ***P ＜ 0.001 vs model group, same as below tables

組別 劑量/(g·kg-1) 梳洗時間/s 懸尾不動時間/s 強迫游泳不動時間/s 糖水偏好率/% 攝食潛伏期/s對照 — 148.3±19.9 58.5±15.2 70.9±18.4 82.7±14.1 75.1±21.6模型 — 73.7±14.8## 114.5±16.0### 159.5±22.4### 54.7±12.5### 187.0±34.9###氟西汀 0.013 2 123.3±11.2** 67.4±18.2** 145.0±33.1 82.4±18.2** 106.1±32.5**CDB 水煎液 22.0 100.6±18.9* 66.4±17.8** 92.1±21.4** 75.3±16.3* 89.4±29.1**CDB 醋酸乙酯部位 11.0 101.7±13.5* 91.8±21.9* 105.4±19.2* 77.3±12.7* 99.4±21.6**22.0 110.8±17.3** 72.5±14.1** 86.1±19.8** 81.2±17.5** 128.3±36.1*

3.2 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠血清BDNF 水平及海馬CA3 區尼氏小體的影響

BDNF 作為體內含量最豐富的神經營養因子，在突觸可塑性及神經元存活等生物過程中發揮重要的功能。如表2、圖1 和表3 所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中BDNF 水平顯著降低（P＜0.001），海馬CA3 區平均A值顯著下降（P＜0.001），提示尼氏小體破碎、消失，數量減少，并且位置出現變化，神經元胞間排列松散，分層模糊，表明反復注射地塞米松能使小鼠BDNF 水平下降，并引起神經元功能活性與形態受損。與模型組比較，CDB醋酸乙酯部位各劑量組小鼠血清BDNF 水平顯著升高（P＜0.05、0.01），海馬CA3 區平均A值顯著增加（P＜0.05、0.01），尼氏小體增加，表明CDB 醋酸乙酯部位能通過上調血清BDNF 水平，發揮神經保護活性從而體現出抗抑郁作用，且作用與CDB 水煎液組比較無明顯差異。

表2 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠血清BDNF 水平的影響 (±s, n = 10)Table 2 Effect of CDB ethyl acetate fraction on BDNF level in serum of depression model mice (±s, n = 10)

表2 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠血清BDNF 水平的影響 (±s, n = 10)Table 2 Effect of CDB ethyl acetate fraction on BDNF level in serum of depression model mice (±s, n = 10)

組別 劑量/(g·kg-1) BDNF/(ng·mL-1)對照 — 650.64±62.47模型 — 357.93±54.05###氟西汀 0.013 2 615.67±70.15**CDB 水煎液 22.0 589.86±66.09**CDB 醋酸乙酯部位 11.0 554.15±68.22*22.0 604.71±52.63**

圖1 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠海馬CA3 區尼氏小體的影響 (×250)Fig. 1 Effect of CDB ethyl acetate fraction on hippocampus CA3 Nissl body of depression model mice (× 250)

表3 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠海馬CA3 區尼氏小體的影響 (±s, n = 4)Table 3 Effect of CDB ethyl acetate fraction on hippocampus CA3 Nissl body of depression model mice(±s, n = 4)

表3 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠海馬CA3 區尼氏小體的影響 (±s, n = 4)Table 3 Effect of CDB ethyl acetate fraction on hippocampus CA3 Nissl body of depression model mice(±s, n = 4)

組別 劑量/(g·kg-1) 平均A 值對照 — 39.76±4.90模型 — 23.12±3.36###氟西汀 0.013 2 37.43±5.47**CDB 水煎液 22.0 33.54±3.81*CDB 醋酸乙酯部位 11.0 32.99±4.83*22.0 34.67±5.91**

3.3 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠血清HPA軸功能指標及海馬糖皮質激素受體相關蛋白表達的影響

如表4、圖2 和表5 所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中CORT、ACTH 及CRH 水平均顯著升高（P＜0.001），海馬部位FKBP51、SGK1 及p-GR/GR 蛋白表達水平均顯著上調（P＜0.001），提示在慢性地塞米松的刺激下，大量糖皮質激素與GR結合，FKBP51 和SGK1 受到激活，啟動了GR 的核轉移，致使GR 信號傳導主導的負反饋調節受損，進而造成小鼠海馬神經細胞的糖皮質激素抵抗，誘導了HPA 軸的過度亢進。與模型組比較，CDB 醋酸乙酯部位能顯著降低血清中CORT、ACTH 及CRH 水平（P＜0.05、0.01），顯著下調p-GR/GR 值及SGK1 的表達，抑制GR 的核轉移（P＜0.05、0.01），對FKBP51 的表達升高有下調趨勢，提示CDB 醋酸乙酯部位能抑制GR 的過度激活，恢復GR 的調節活性，改善GR 的負反饋調節損傷，進而降低HPA 軸的過度活化，發揮其抗抑郁作用。各組HSP90 蛋白表達無顯著變化。

表4 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠血清中HPA 軸功能指標的影響 (±s, n = 6)Table 4 Effect of CDB ethyl acetate fraction on HPA axis functional indicators in serum of depression model mice (±s, n = 6)

表4 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠血清中HPA 軸功能指標的影響 (±s, n = 6)Table 4 Effect of CDB ethyl acetate fraction on HPA axis functional indicators in serum of depression model mice (±s, n = 6)

組別 劑量/(g·kg-1) CORT/(ng·mL-1) ACTH/(pg·mL-1) CRH/(ng·mL-1)對照 — 88.31±14.58 15.54±3.25 15.66±4.08模型 — 151.63±21.77### 22.86±3.17### 25.87±4.67###氟西汀 0.013 2 113.78±29.04** 18.99±4.11* 20.85±3.75**CDB 水煎液 22.0 115.93±26.12** 19.45±3.64* 20.65±4.94*CDB 醋酸乙酯部位 11.0 123.11±22.81* 18.84±4.29* 21.60±4.48*22.0 115.56±28.23** 16.66±3.64** 20.22±3.09**

圖2 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠海馬區糖皮質激素通路相關蛋白表達的影響Fig. 2 Effect of CDB ethyl acetate fraction on glucocorticoid pathway-related protein expressions in hippocampus region of depression model mice

表5 CCDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠海馬糖皮質激素通路相關蛋白表達的影響 (±s, n = 4)Table 5 Effect of CDB ethyl acetate fraction on glucocorticoid pathway-related protein expressions in hippocampus region of depression model mice (±s, n = 4)

表5 CCDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠海馬糖皮質激素通路相關蛋白表達的影響 (±s, n = 4)Table 5 Effect of CDB ethyl acetate fraction on glucocorticoid pathway-related protein expressions in hippocampus region of depression model mice (±s, n = 4)

組別 劑量/(g·kg-1) FKPB51/GAPDH SGK1/GAPDH HSP90/GAPDH p-GR/GR對照 — 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模型 — 2.43±0.59### 3.59±0.64### 1.03±0.26 3.87±0.37###氟西汀 0.013 2 1.71±0.43* 2.62±0.41* 1.11±0.13 1.88±0.46**CDB 水煎液 22.0 2.13±0.50 2.97±0.39 0.93±0.23 2.42±0.33*CDB 醋酸乙酯部位 11.0 2.23±0.43 2.27±0.58* 0.83±0.17 2.27±0.54*22.0 2.18±0.56 2.07±0.64** 0.82±0.15 1.97±0.43**

3.4 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠海馬區神經發生及突觸相關蛋白表達的影響

神經發生是產生新神經元的過程，在哺乳動物的海馬體中持續存在。如圖3 和表6 所示，與對照組比較，模型組小鼠海馬齒狀回區Brdu 及DCX 陽性表達均顯著減少（P＜0.001），提示反復注射地塞米松會導致小鼠海馬齒狀回區神經干細胞增殖成新生神經元減少，且抑制新生神經元分化、遷移及成為成熟神經元；與模型組比較，CDB 醋酸乙酯部位顯著促進Brdu 陽性表達（P＜0.05），高劑量組顯著促進DCX 陽性表達（P＜0.05）。

圖3 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠海馬齒狀回區神經元Brdu 和DCX 陽性表達的影響 (×400)Fig. 3 Effect of CDB ethyl acetate fraction on Brdu and DCX positive expressions in hippocampus dentate gyrus region of depression model mice (× 400)

表6 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠海馬齒狀回區Brdu 和DCX 陽性表達的影響 (±s, n = 3)Table 6 Effect of CDB ethyl acetate fraction on Brdu and DCX positive expressions in hippocampus dentate gyrus region of depression model mice (±s, n = 3)

表6 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠海馬齒狀回區Brdu 和DCX 陽性表達的影響 (±s, n = 3)Table 6 Effect of CDB ethyl acetate fraction on Brdu and DCX positive expressions in hippocampus dentate gyrus region of depression model mice (±s, n = 3)

組別 劑量/(g·kg-1)DCX 陽性表達率/%Brdu 陽性表達率/%對照 — 38.6±6.9 8.4±2.0模型 — 20.2±3.7### 4.9±0.5###氟西汀 0.013 2 36.7±7.4** 7.8±0.8*CDB 水煎液 22.0 34.1±5.9* 7.6±0.6*CDB 醋酸乙酯部位 11.0 25.2±4.9 6.7±0.5*22.0 31.4±5.5* 7.5±0.6*

PSD95 和Synaptophysin 作為神經突觸形成的主要效應分子，在新生神經元的突觸生長和信息傳遞中具有重要作用，能有效反映神經元中神經發生的情況。如圖4 和表7 所示，與對照組比較，模型組小鼠海馬區PSD95 及Synaptophysin 蛋白表達均顯著減少（P＜0.001）；與模型組比較，CDB 醋酸乙酯部位能夠顯著上調小鼠海馬區 PSD95、Synaptophysin 蛋白表達（P＜0.05、0.01），提示慢性地塞米松應激可抑制小鼠海馬齒狀回區神經元增殖、分化，減弱神經發生，CDB 醋酸乙酯部位則能通過增加突觸相關蛋白的表達，從而促進突觸生長，增強神經可塑性，使神經發生功能恢復正常，進而發揮抗抑郁作用。

圖4 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠海馬區PSD95 和Synaptophysin 蛋白表達的影響Fig. 4 Effect of CDB ethyl acetate fraction on PSD95 and Synaptophysin protein expressions in hippocampus region of depression model mice

表7 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠海馬區PSD95 和Synaptophysin 蛋白表達的影響 (±s, n = 4)Table 7 Effect of CDB ethyl acetate fraction on PSD95 and Synaptophysin protein expressions in hippocampus region of depression model mice (±s, n = 4)

表7 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠海馬區PSD95 和Synaptophysin 蛋白表達的影響 (±s, n = 4)Table 7 Effect of CDB ethyl acetate fraction on PSD95 and Synaptophysin protein expressions in hippocampus region of depression model mice (±s, n = 4)

組別 劑量/(g·kg-1) PSD95/β-tubulin Synaptophysin/β-tubulin對照 — 1.00±0.00 1.00±0.00模型 — 0.52±0.12### 0.51±0.09###氟西汀 0.013 2 0.88±0.14** 0.87±0.13**CDB 水煎液 22.0 0.91±0.15** 0.82±0.15**CDB 醋酸乙酯部位 11.0 0.76±0.14* 0.62±0.14*22.0 0.83±0.17** 0.79±0.17**

3.5 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠海馬PI3K/Akt/mTOR 及TrkB/CREB/BDNF 信號通路相關蛋白表達的影響

PI3K/Akt/mTOR 信號通路作為突觸相關蛋白的主要上游信號，在抑郁癥的發生發展中發揮重要作用，此外TrkB/CREB/BDNF 信號通路亦是抑郁癥中影響突觸可塑性及海馬神經發生的經典信號通路。如圖5、表8、圖6、表9 所示，與對照組比較，模型組小鼠海馬區p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、pmTOR/mTOR、TrkB/TrkB 和p-CREB/CREB 值和BDNF 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.001），提示在慢性地塞米松的刺激下可抑制海馬區PI3K/Akt/mTOR 通路和TrkB/CREB/BDNF 通路，從而直接影響其下游突觸蛋白 PSD95 、Synaptophysin 及BDNF 的表達，進而影響海馬神經發生。與模型組比較，CDB 醋酸乙酯部位能夠顯著增加p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p-TrkB/TrkB 和p-CREB/CREB 值以及BDNF 蛋白表達（P＜0.05、0.01），呈現出對抗模型小鼠PI3K/Akt/mTOR 和TrkB/CREB/BDNF 通路抑制的作用，從而增加突觸相關蛋白的表達，促進突觸生長，增強神經可塑性，發揮其抗抑郁作用。

圖5 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠海馬區PI3K/Akt/mTOR 信號通路蛋白表達的影響Fig. 5 Effect of CDB ethyl acetate fraction on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway protein expressions in hippocampus region of depression model mice

表8 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠海馬PI3K/Akt/mTOR 信號通路蛋白表達的影響 (±s, n = 4)Table 8 Effect of CDB ethyl acetate fraction on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway protein expressions in hippocampus region of depression model mice (±s, n = 4)

表8 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠海馬PI3K/Akt/mTOR 信號通路蛋白表達的影響 (±s, n = 4)Table 8 Effect of CDB ethyl acetate fraction on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway protein expressions in hippocampus region of depression model mice (±s, n = 4)

組別 劑量/(g·kg-1) p-PI3K/PI3K p-Akt/Akt p-mTOR/mTOR對照 — 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模型 — 0.51±0.11### 0.45±0.12### 0.49±0.07###氟西汀 0.013 2 0.92±0.14** 0.95±0.11** 0.87±0.15**CDB 水煎液 22.0 0.97±0.12** 1.01±0.19** 0.82±0.12**CDB 醋酸乙酯部位 11.0 0.86±0.15* 0.91±0.16** 0.79±0.12*22.0 0.96±0.14** 0.89±0.18** 0.86±0.14**

圖6 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠海馬區TrkB/CREB/BDNF 信號通路蛋白表達的影響Fig. 6 Effect of CDB ethyl acetate fraction on TrkB/CREB/BDNF signaling pathway protein expressions in hippocampus region of depression model mice

表9 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠海馬TrkB/CREB/BDNF 信號通路蛋白表達的影響 (±s, n = 4)Table 9 Effect of CDB ethyl acetate fraction on TrkB/CREB/BDNF signaling pathway protein expressions in hippocampus region of depression model mice (±s, n = 4)

表9 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠海馬TrkB/CREB/BDNF 信號通路蛋白表達的影響 (±s, n = 4)Table 9 Effect of CDB ethyl acetate fraction on TrkB/CREB/BDNF signaling pathway protein expressions in hippocampus region of depression model mice (±s, n = 4)

組別 劑量/(g·kg-1) p-TrkB/TrkB p-CREB/CREB BDNF/GAPDH對照 — 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模型 — 0.54±0.12### 0.43±0.15### 0.57±0.10###氟西汀 0.013 2 0.98±0.16** 0.98±0.15** 1.02±0.17**CDB 水煎液 22.0 0.94±0.17** 0.95±0.17** 1.01±0.19**CDB 醋酸乙酯部位 11.0 0.88±0.16* 0.93±0.16** 0.84±0.13*22.0 0.99±0.13** 1.03±0.14** 0.77±0.14**

3.6 CDB 醋酸乙酯部位抗抑郁作用的HPA 軸-神經可塑性關聯調控機制相關性分析

鑒于CDB 醋酸乙酯部位對HPA 軸/GR 以及神經可塑性相關指標均具有調節作用，因此對反映上述2 方面功能的代表性指標進行了Pearson 相關性分析，并基于相關性系數構建了HPA 軸-神經可塑性關聯調控機制相關性矩陣。如圖7 所示，HPA 軸/GR 以及神經可塑性相關指標間均呈負相關，相關性系數均介于0～-1。其中，p-GR/GR 值體現了GR的核轉移水平，與血清BDNF、Brdu 陽性數、海馬BDNF 及Synaptophysin 表達呈顯著的負相關，相關性系數均小于-0.73。此外，CORT 與各項神經可塑性指標均有較強的負相關，相關性系數均小于-0.68，表明高水平CORT 在減弱海馬神經可塑性方面發揮顯著影響作用，其中CORT 對Brdu 和Synaptophysin 的負相關性最強，提示CORT 在影響海馬神經元分裂增殖及突觸前膜的信號釋放方面作用顯著。血清BDNF 和海馬Brdu 陽性數與HPA 軸功能指標及p-GR/GR 均具有較強的關聯性，也表明在反復注射地塞米松誘導的抑郁模型血清中BDNF水平和神經元新生表現受到抑制，血清BDNF 可作為判斷模型成功與否的重要指標。SGK1 與FKBP51在此模型中與神經可塑性關聯較小，僅有FKBP51與PSD95 呈現較強的負相關關系。

圖7 CDB 醋酸乙酯部位的HPA 軸-神經可塑性關聯調控機制相關性矩陣熱圖Fig. 7 Correlation matrix heat map of CDB ethyl acetate fraction exert HPA axis-neuroplasticity associated regulatory mechanisms

4 討論

逍遙散的抗抑郁作用已得到各項實驗研究證實，且在臨床應用中也具有顯著療效[16-17]。CDB 作為逍遙散的精簡方劑，已有研究表明其在22.0 g/kg（生藥量）劑量下能通過調節5-HT1A/5-HT2A受體平衡、激活BDNF/TrkB/CREB 通路及抑制HPA 軸功能亢進等不同路徑，顯著抑制CUMS 模型小鼠抑郁樣行為，表現出與逍遙散全方相當的抗抑郁作用[6-7]。本研究以通過石油醚和醋酸乙酯極性梯度萃取獲得的CDB 醋酸乙酯部位為研究對象開展抗抑郁作用研究，旨在進一步挖掘CDB 的抗抑郁物質基礎及其深入的作用機制。

慢性CORT 刺激能模擬抑郁癥患者體內HPA軸功能持續亢進的病理特征[18]，能誘導動物產生抑郁樣行為，是目前抗抑郁藥的評價及機制研究中常用的動物模型之一[19]。其中人工合成的皮質類固醇地塞米松已被廣泛用于抑郁癥動物模型的研究中[20-22]。本研究ip 地塞米松（10 mg/kg）21 d 能成功誘導模型小鼠出現糖水偏好降低、懸尾和強迫游泳試驗的不動時間延長、飛濺測試中梳洗時間減少及新穎抑制性攝食測試中攝食潛伏期增加等一系列抑郁樣行為。此外，亦發現模型小鼠血清BDNF水平顯著下降，海馬CA3 區神經元尼氏小體溶解、消失，表明慢性地塞米松刺激可使BDNF 功能下調，導致錐體神經元密度降低、樹突棘減少、突觸可塑性受損。與氟西汀的作用相似，CDB 醋酸乙酯部位則表現出上調模型小鼠血清BDNF 水平，改善海馬CA3 區神經元的結構和功能，從而緩解慢性地塞米松刺激引起的抑郁樣行為，CDB 水煎劑（22.0 g/kg）表現出同樣的抗抑郁作用。

GR 是CORT 的主要細胞質受體，在大腦分布廣泛，是完成HPA 軸反饋調節的最關鍵分子。糖皮質激素與GR 結合后，FKBP51 從HSP90-異源復合體解離，促進GR 核轉移。核轉移后，GR 同型二聚體與糖皮質激素反應元件結合，以誘導或抑制各種基因的轉錄表達[23]。正常情況下，GR 入核后會上調FKBP51 的表達，FKBP51 增加后能與HSP90 協同以抑制GR 的活性，基于此負反饋循環保持了外環境中糖皮質激素的相對平衡。若中樞CORT 持續處于高水平的情況下，GR 主導的負反饋調節則失衡，會改變中樞GR 水平和/或功能，致使受體抵抗[24]，引發或加劇HPA 軸的過度活化。此外，SGK1作為GR 轉移的“下游”機制，也參與調節GR 功能。研究表明，GR 介導的SGK1 表達增加能進一步增強絲氨酸殘基S211 處的GR 磷酸化，從而促進和維持了GR 核易位[25-26]。本研究中，模型小鼠海馬部位的p-GR/GR 值、FKBP51、SGK1 蛋白表達顯著上調，提示在慢性地塞米松的刺激下，啟動了GR 的核轉移，導致海馬糖皮質激素信號傳導的負反饋調節紊亂，進而造成HPA 軸功能的過度亢進，致使血清CORT、ACTH 以及CRH 水平異常升高。CDB 醋酸乙酯部位則表現出顯著降低模型小鼠海馬p-GR/GR 值、SGK1 表達水平的作用，對FKBP51激活有下調趨勢，并降低模型小鼠血清CORT、ACTH 和CRH 含量。HSP90 蛋白表達變化不明顯，推測與其作為一種多功能分子伴侶，普遍表達于各種細胞中，影響因素較多有關。

海馬體作為大腦邊緣系統的一部分，是中樞神經系統管理情緒和記憶的重要腦區，含有高水平的GR 和各種神經遞質，是HPA 軸的高位調節中樞，因此更容易受到壓力和應激的影響[27]。大量證據表明，抑郁癥患者和動物模型的海馬存在病理性結構與功能異常[28-29]。海馬區主要由椎體細胞和神經干細胞構成，負責情緒相關的信息處理、短期記憶的形成[30]以及生命周期中神經元的分裂、增殖與遷移，是新生神經元的主要區域[31]。研究表明，HPA軸激活狀態下，神經干/祖細胞增殖和/或分化存在缺陷[10]；海馬區新生神經元標志物表達減少，神經可塑性被抑制[11]。長時程增強（long-term potentiation，LTP）是神經元胞間交流和相互刺激生長分化的微觀現象，也是與突觸可塑性/突觸傳遞相關的重要生理過程[32]，在抑郁癥的神經可塑性假說中具有重要地位。Synaptophysin 和PSD95 分別位于突觸前膜和突觸后膜，主要影響突觸連接和神經元網絡，進一步維持和增加LTP 過程[33]。本研究中，模型小鼠海馬齒狀回區Brdu 和DCX 陽性表達減少，海馬Synaptophysin 和PSD95 表達下降，與文獻報道結果吻合，證實了慢性地塞米松刺激可導致海馬神經元和神經干細胞增殖分化能力下降[34-35]。CDB 醋酸乙酯部位能提高模型小鼠海馬Synaptophysin、PSD95 蛋白表達量，一定程度上提示藥物能增強神經可塑性，從而對抗小鼠的抑郁樣行為，表明藥物能通過神經保護作用來發揮抗抑郁作用。

TrkB/CREB/BDNF 通路是介導突觸結構和功能變化的經典機制之一[36]，BDNF 的轉錄依賴于CREB 的激活，該蛋白在LTP 和突觸可塑性中發揮關鍵作用[37]。研究表明，在多種慢性應激刺激下TrkB/CREB/BDNF 通路的功能均出現不同程度的下調[38-39]，提示神經可塑性受到影響。BDNF與TrkB特異性結合后會激活下游多條細胞信號通路，參與神經元生長、分化及再生等神經可塑性調節活動[40]。其中PI3K/Akt 是信號傳遞中最活躍的激酶之一，Akt 的磷酸化能在很大程度上反映BDNF/TrkB 信號活性[41]。PI3K/Akt 是細胞內重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶信號通路之一，在介導多種生長因子促存活和促增殖方面至關重要[42]。研究表明，發育過程中PI3K活性與干細胞、神經祖細胞的功能有關[43]；Akt基因缺陷的小鼠大腦體積與重量減小，表明Akt 在中樞神經系統神經發生中有關鍵作用[44]。mTOR 作為一種保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K/Akt 下游的重要效應蛋白，整合參與蛋白質合成和突觸可塑性的多種細胞外信號[45]。mTOR 的激活能加速神經前體細胞的細胞周期間期，從而增加神經細胞的增殖和分化，且能增加LTP 相關蛋白的表達，在神經可塑性方面有積極作用[42,46]。本研究中，模型小鼠海馬部位 PI3K/Akt/mTOR 通路與 TrkB/CREB/BDNF 通路均呈現抑制表現，CDB 醋酸乙酯部位則對此具有對抗作用，能上調通路蛋白表達量，提示可增加突觸可塑性，促進神經發生，從而發揮抗抑郁作用。

研究表明，糖皮質激素能影響GR 與TrkB 在細胞內的直接相互作用[47]，對BDNF 下游信號傳導激活和維持產生負面影響，而PI3K 激活對于BDNF依賴的突觸成熟至關重要[36]；此外，慢性壓力造成的細胞外糖皮質激素水平升高能導致星形膠質細胞中GRs 的減少，并通過PI3K/Akt 信號通路來介導三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的釋放[48]；神經祖細胞中的Akt 信號傳導被抑制時，成纖維生長因子-2（fibroblast growth factor-2，FGF-2）刺激的細胞中CREB 的激活會受到限制，暗示CREB 可作為PI3K/Akt 下游效應因子[49]。上述研究表明糖皮質激素、GR 和BDNF 之間存在著功能的串擾，本研究基于模型小鼠反映HPA 軸、神經可塑性功能代表性指標的相關性分析所獲得的矩陣熱圖，一定程度上解釋了HPA 軸-神經可塑性關聯調控機制，CORT 與海馬神經可塑性相關指標之間，及p-GR/GR 值與血清/海馬BDNF 水平之間呈現顯著負向調節關系。

綜上，CDB 醋酸乙酯部位能改善慢性注射DEX誘導的抑郁模型小鼠的抑郁樣行為，促進海馬CA3區尼氏小體合成，抑制海馬GR 的過度磷酸化和GR相關蛋白的過度激活從而減輕模型小鼠HPA 軸的過度激活，并增加海馬齒狀回區增殖、遷移的陽性細胞比例，表現出對神經可塑性的積極作用，作用發揮可能與上調TrkB/CREB/BDNF 通路和PI3K/Akt/mTOR 通路，促進下游突觸相關蛋白表達有關，呈現出抑制HPA 軸的亢進和促進神經可塑性的作用路徑（圖8），為逍遙散拆方藥隊的研發提供了藥理學依據。

圖8 CDB 醋酸乙酯部位對抑郁模型小鼠HPA 軸-神經可塑性關聯調控機制Fig. 8 Mechanism of regulation of HPA axis-neuroplasticity association in depression model mice by CDB ethyl acetate fraction

后續研究中可對CDB 醋酸乙酯部位進行成分的進一步富集，利用電鏡和膜片鉗技術，觀察藥物是否能直接影響海馬的結構可塑性和功能可塑性，進一步證明其對神經可塑性的調控作用，并在體內或體外水平上采用靶標抑制或質粒載體構建沉默技術，深入研究其影響HPA 軸-神經可塑性關聯調控的機制及藥物相關作用靶點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突