經典名方三化湯基準樣品量值傳遞研究

劉明松，鄧亞偉，忻曉東，梁董茜，李春花,2*，劉曉明

1. 河北中醫學院藥學院，河北 石家莊 050200

2. 河北省中藥組方制劑技術創新中心，河北 石家莊 050090

3. 河北省藥品審評中心，河北 石家莊 050090

三化湯（Sanhua Decoction）為國家中醫藥管理局公布的《古代經典名方目錄（第一批）》第55 首，來源于金·劉完素《素問病機氣宜保命集》卷中[1]。原文記載：“中風外有六經之形證，先以加減續命湯，隨證治之，內有便溺之阻格，復以三化湯主之。”可見三化湯治療中風臨床應用已久[2]。全方由大黃、枳實、羌活、厚樸4 味藥組成，君藥大黃與枳實、厚樸3 藥合用，瀉熱祛瘀、通腹降氣，再加羌活祛風解表，有升有降、表里結合，共治內風外風，是中醫治療中風的經典方[3-5]。

目前，有關三化湯的研究多集中于臨床、藥理和含量測定等方面，對其量值傳遞研究較少[6]。在國家藥品監督管理局藥品審評中心組織起草的《按古代經典名方目錄管理的中藥復方制劑藥學研究技術指導原則（試行）》要求中明確指出，經典名方基準樣品的關鍵質量屬性（critical quality attributes，CQAs）的研究應包括特征圖譜、指標成分含量及干膏率等關鍵信息[7-8]。本研究在文獻考證結合煎煮工藝結果的基礎上確定三化湯制備工藝，制備了15 批基準樣品煎液，通過構建其特征圖譜并對指標性成分進行含量測定，確定其含量及轉移率范圍，并結合出膏率分析飲片-基準樣品量值傳遞規律，為其質量研究提供科學依據，也為三化湯中藥復方制劑進一步研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters H-Class 型超高效液相色譜儀、Empower工作站，美國Waters 公司；YP2002 型電子天平，上海津平科學儀器有限公司；D5.5-L 型煎藥壺，潮州市潮安區康雅順電器有限公司；Milli-QReference超純水系統，法國Millipore 公司；KQ500D 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HCP-1000A型高速多功能粉碎機，浙江省永康市金穗機械制造廠；HWS-28 型恒溫水浴鍋、DHG-9030A 型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 試藥

對照品厚樸酚（批號PS012117，質量分數≥98.5%）、紫花前胡苷（批號PS010688，質量分數≥99.5%）、紫丁香苷（批號PS012100，質量分數99.86%）、柚皮苷（批號PS012062，質量分數≥99.5%）、新橙皮苷（批號PS011239，質量分數99.54%）、橙皮苷（批號 PS011588，質量分數99.54%）、蕓香柚皮苷（PS012543，質量分數≥98.5%），均購自成都普斯生物科技股份有限公司；對照品大黃酚（批號20120320）、蘆薈大黃素（批號20120320），質量分數均≥98%，購自上海源葉生物科技有限公司；對照品和厚樸酚（批號MUST-20032205，質量分數＞98%）、大黃酸（批號MUST-11032801，質量分數＞98%）、大黃素（批號MUST-19100810，質量分數≥98%），購自成都曼思特生物科技有限公司。甲醇，色譜級，賽默飛世爾科技有限公司；甲酸，色譜級，天津大茂化學試劑廠；三氯甲烷，天津大茂化學試劑廠；乙腈，色譜級，天津市康科德科技有限公司。

不同產地及批號飲片見表1，經河北中醫學院藥學院段緒紅副教授鑒定，大黃為蓼科大黃屬植物藥用大黃RheumofficinaleBaill.的干燥根和根莖，枳實為蕓香科柑橘屬植物酸橙CitrusaurantiumL.的干燥幼果，羌活為傘形科羌活屬植物羌活NotopterygiumincisumTing ex H. T. Chang 的干燥根莖和根，厚樸為木蘭科厚樸屬植物厚樸Magnolia officinalisRehd. et Wils.的干燥干皮及枝皮，以上均為符合《中國藥典》2020 年版炮制要求的飲片。通過隨機數表法對表1 中不同批次三化湯飲片進行隨機組合，結果見表2。

表1 三化湯飲片來源信息Table 1 Source information of Sanhua Decoction herbal pieces

表2 三化湯隨機組合Table 2 Random combination table of Sanhua Decoction

2 方法與結果

2.1 三化湯基準樣品的制備

三化湯原文記載“每服三兩，水三升，煎至一升半，終日服之。”經文獻考證，確定處方中各飲片所用劑量及加水量，最終明確煎煮工藝。確定全方為厚樸、大黃、枳實、羌活各30 g，粉碎過10 目篩，加純水2100 mL，浸泡0.5 h，開蓋，武火煮沸后，保持文火（500 W）微沸狀態約90 min，200 目濾網濾過，濾液放涼，調整體積至1050 mL，即得三化湯基準樣品。同法制備三化湯各單味飲片及缺大黃、缺枳實、缺厚樸、缺羌活的陰性樣品溶液。

2.2 三化湯基準樣品特征圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Acquity UPLC?BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，10%～13%乙腈；5～11 min，13%～17%乙腈；11～31 min，17%～25%乙腈；31～32 min，25%～29%乙腈；32～40 min，29%～34%乙腈；40～43 min，34%～47%乙腈；43～55 min，47%～75%乙腈；體積流量0.2 mL/min；進樣體積2 μL；柱溫35 ℃；檢測波長255 nm。三化湯基準樣品UPLC 圖見圖1-A，混合對照品圖見圖1-B。

圖1 三化湯基準樣品的UPLC 圖譜 (A) 和對照品圖譜 (B)Fig. 1 UPLC chromatogram (A) and comparator chromatogram (B) of substance benchmarks in Sanhua Decoction

2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取“2.1”項制備的煎液2 mL，甲醇定容至10 mL 量瓶中，搖勻，靜置，取上清液過0.22 μm 濾膜，即得供試品溶液。

2.2.3 對照品溶液的制備 分別取異歐前胡素、大黃酸、大黃素、大黃酚、和厚樸酚、厚樸酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、紫丁香苷、紫花前胡苷、柚皮苷、橙皮苷、蕓香柚皮苷和新橙皮苷對照品適量，精密稱定，甲醇定容，制成質量濃度為25.21、15.25、16.11、19.13、17.29、18.22、16.34、12.31、42.11、72.08、210.64、36.24、45.62、171.97 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.4 精密度考察 取S1 號供試品溶液，按“2.2.2”項下方法制備，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣6 次，色譜圖中新橙皮苷（13 號峰）保留時間適中且峰形較好、分離度高，因此以新橙皮苷為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積，結果顯示各共有峰相對保留時間的RSD 均＜0.5%，相對峰面積的RSD 均＜1.5%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復性考察 取同一批三化湯基準樣品，平行制備6 份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，以新橙皮苷（13 號峰）為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積，結果顯示各共有峰相對保留時間的RSD 均＜0.8%，相對峰面積的RSD 均＜1.8%，表明該方法重復性好。

2.2.6 穩定性考察 取同一供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，分別于制樣后0、2、4、8、12、24 h 進樣，以新橙皮苷（13 號峰）為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積，結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD 均＜0.9%，相對峰面積的RSD 均＜2.6%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3 三化湯特征圖譜評價及飲片-基準樣品量值傳遞關系研究

2.3.1 基準樣品相似度評價 將表2 不同批次飲片組合按“2.2.2”項制備方法制備15 批三化湯基準樣品供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件測定，記錄色譜圖。將S1～S15 批基準樣品特征圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”生成疊加圖（圖2），以S1 為參照圖譜，時間窗寬度0.1 s，設置中位數法，Marker 峰匹配，并生成對照圖譜（R），S1～S15 批基準樣品相似度結果分別為0.996、0.981、0.988、0.994、0.985、0.997、0.993、0.995、0.995、0.998、0.987、0.994、0.991、0.997、0.984，可見，各批次三化湯基準樣品特征圖譜相似度均大于0.98。

圖2 15 批三化湯基準樣品特征圖譜Fig. 2 Characteristic chromatogram of substance benchmarks in 15 batches of Sanhua Decoction

圖3 三化湯基準樣品與單味飲片的UPLC 圖譜Fig. 3 UPLC chromatogram of Sanhua Decoction benchmark samples and single herbal pieces

2.3.2 特征峰歸屬 按“2.2.2”項方法制備各單味飲片和陰性供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。通過基準樣品與各單味飲片（圖3）及陰性供試品圖譜（圖4）比對，將各特征峰進行歸屬，全處方共歸屬26 個特征峰，其中峰6、7、14、15、16、17（蘆薈大黃素）、18（大黃酸）、21（大黃素）、25（大黃酚）、26（大黃素甲醚）歸屬于大黃；峰1、2、4、22（和厚樸酚）、24（厚樸酚）歸屬于厚樸；峰3、8、10（蕓香柚皮苷）、11（柚皮苷）、12（橙皮苷）、13（新橙皮苷）歸屬于枳實；峰5、9（紫花前胡苷）、19、20、23（異歐前胡素）歸屬于羌活。

圖4 三化湯基準樣品與陰性樣品的UPLC 圖譜Fig. 4 UPLC chromatogram of Sanhua Decoction benchmark samples and negative sample

2.3.3 量值傳遞關系研究 以每味藥中的1 個特征峰為參照峰（大黃參照峰為15 號，枳實參照峰為13號，羌活參照峰為9 號，厚樸參照峰為22 號），對基準樣品與各單味飲片共有峰峰面積比值作分析，結果見表3。各單味藥與基準樣品中對應共有峰峰面積雖存在差異，但大部分特征峰比值變化較小，結果表明各單味藥特征圖譜中主要物質成分可以從飲片-基準樣品較為完整地傳遞，且各物質成分歸屬關系清晰。

表3 三化湯基準樣品與各藥味飲片中特征峰峰面積比值Table 3 Peak area ratio of characteristic peaks between Sanhua Decoction benchmarks sample and each herbal pieces

2.4 三化湯基準樣品及各單位飲片中指標成分含量測定方法的建立

2.4.1 色譜條件

（1）枳實飲片、羌活飲片、基準樣品（紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷）UPLC 定量色譜條件：Acquity UPLC?BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～10 min，10%～17%乙腈；10～28 min，17%～26%乙腈；體積流量0.2 mL/min；進樣體積2 μL；柱溫35 ℃；檢測波長290 nm。對照品見圖5-A，基準樣品見圖5-B。

圖5 混合對照品 (A) 和三化湯基準樣品指標性成分 (B) 含量測定色譜圖Fig. 5 Chromatogram for content determination of mixed control sample (A) and reference standard components of Sanhua Decoction (B)

（2）大黃飲片、厚樸飲片、基準樣品（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、和厚樸酚、厚樸酚）UPLC 定量色譜條件：Acquity UPLC?BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～8 min，30%～42%乙腈；8～18 min，42%～46%乙腈；18～22 min，46%～50%乙腈；22～30 min，50%～72%乙腈；體積流量0.2 mL/min；進樣體積2 μL；柱溫35 ℃；游離總蒽醌（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚）檢測波長254 nm，混合對照品色譜圖見圖5-A，基準樣品見圖5-B；和厚樸酚、厚樸酚檢測波長295 nm，混合對照品色譜圖見圖5-A，基準樣品見圖5-B。

2.4.2 三化湯基準樣品含量測定供試品溶液的制備（1）紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷：同“2.2.2”項下制法制備供試品溶液。

（2）游離總蒽醌、和厚樸酚、厚樸酚：精密量取基準樣品湯液25 mL，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取3 次，每次20 mL，合并三氯甲烷溶液，蒸干，殘渣加適量甲醇溶解，轉移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，靜置，過0.22 μm 濾膜，即得供試品溶液。

2.4.3 單味飲片含量測定溶液的制備

（1）枳實：取飲片粉末約0.1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇30 mL，稱定質量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，靜置，過0.22 μm 濾膜，即得。

（2）羌活：取飲片粉末約0.1 g，精密稱定，分別置不同具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，過0.22 μm 濾膜，即得。

（3）大黃、厚樸：含量測定供試品溶液的制備參照《中國藥典》2020 年版。

2.4.4 對照品溶液的制備 取紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、和厚樸酚、厚樸酚對照品適量，精密稱定，甲醇溶解，制得質量濃度分別為248.01、908.02、992.01、68.42、86.01、64.41、74.80、32.41、204.01、156.80 μg/mL 的各對照品溶液。

2.4.5 線性關系考察 取不同質量濃度的指標性成分對照品溶液，采用“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線并計算回歸方程，結果如表4 所示，結果表明蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、和厚樸酚、厚樸酚、紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷在各自的線性范圍內線性關系良好。

表4 指標性成分含量測定方法學考察Table 4 Methodological investigation of determining of content of index components

2.4.6 精密度考察 取同一批三化湯基準樣品（S1），參照“2.4.2”項下方法制備供試品溶液1 份，按“2.4.1”項下色譜條件，連續進樣6 次，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、和厚樸酚、厚樸酚、紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD 值均小于1.95%，RSD 見表4，表明儀器精密度良好。

2.4.7 重復性考察 取同一批三化湯基準樣品，按“2.4.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣檢測，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、和厚樸酚、厚樸酚、紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷質量分數的RSD 值均小于2.68%，RSD 見表4，表明該方法的重復性良好。

2.4.8 穩定性考察 取同一批三化湯基準樣品（S1），參照“2.4.2”項下方法制備供試品溶液1 份，按“2.4.1”項下色譜條件，分別在制樣后0、2、4、8、12、18、24 h 進行測定，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、和厚樸酚、厚樸酚、紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD 見表4，結果表明供試品溶液在24 h 內穩定。

2.4.9 加樣回收率考察 精密量取已測知指標成分含量的三化湯基準樣品（S1）共6 份，分別按已知質量濃度的80%、100%和120%加入對照品，采用“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，測定樣品中各指標成分含量，計算加樣回收率，結果如表4 所示，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、和厚樸酚、厚樸酚、紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷的平均加樣回收率均在95%～105%，RSD 均小于3.0%，表明方法準確度良好。

2.4.10 樣品測定 取三化湯基準樣品（S1～S15）和各單味藥材飲片，分別按照“2.4.2”“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.4.1”項下色譜條件進樣分析，計算三化湯基準樣品和單味飲片中指標成分的含量。

2.5 三化湯飲片-基準樣品中指標成分轉移率考察

按照公式計算三化湯飲片-基準樣品中指標成分的轉移率。

w為基準樣品中指標性成分的含量，W為飲片中指標性成分的含量

由表5、6 結果可知，15 批三化湯基準樣品中指標成分紫花前胡苷質量分數在0.39%～0.72%，平均轉移率為（28.08±5.28）%；柚皮苷質量分數在2.70%～3.77%，平均轉移率為（45.07±5.17）%；新橙皮苷質量分數在1.69%～3.88%，平均轉移率為（41.03±4.75）%；和厚樸酚與厚樸酚總質量分數在0.11%～0.32%，平均總轉移率為（3.32±0.92）%；大黃游離總蒽醌質量分數在0.10%～0.28%，平均轉移率為（16.54±3.57）%。

表5 三化湯飲片-基準樣品紫花前胡苷、柚皮苷、新橙皮苷含量及轉移率Table 5 Content and transfer rate of nodakenin, naringenin and neohesperidin in Sanhua Decoction herbal pieces-benchmark samples

2.6 出膏率測定

按“2.1”項下制備方法制備15 批基準樣品湯液，精密吸取50 mL 于蒸發皿中，水浴蒸干，真空干燥48 h 后，置干燥器中至恒定質量，稱定質量，計算得到各批次三化湯基準樣品出膏率。

其中m表示干膏質量，M表示飲片質量，v代表取樣體積，V代表湯液總體積

分別取15 批對應批號的大黃、枳實、羌活、厚樸單味飲片，按“2.1”項下方法制備得到4 味藥單味飲片水煎液，按照上述制備方法，得到單味飲片出膏率。出膏率結果見表7。全處方共計120 g，則理論出膏率＝大黃出膏率×25%＋枳實出膏率×25%＋羌活出膏率×25%＋厚樸出膏率×25%，其中枳實出膏率最高（44.61%±3.01%），厚樸的出膏率最低（13.61±0.67）%，各批次處方干膏轉移率為64.43%～76.22%，均保持在均值的±10%。

表8 三化湯基準樣品出膏率及轉移率Table 8 Paste yield rate and transfer rate of Sanhua Decoction benchmark samples

3 討論

3.1 處方組成及計量考證

經典名方療效確切且應用歷史悠久，但存在著古今劑量換算及炮制差異等眾多難點問題。經文獻考證，金元與唐宋時期處方劑量折算類似[9-10]，宋代1 兩合今39～41 g[11-12]，與國家中醫藥管理局和國家藥品監督管理局公布的“古代經典名方關鍵信息表（25 首方劑）”信息中金時期1 兩約為41.30 g 基本吻合，“每服三兩”也就是每服處方117.00～123.00 g，“大黃、枳實、羌活、厚樸各等分”則四味藥各29.25～30.75 g；參考苑禎等[13]對宋元時期“升”的考證，得到處方現代計量單位換算：金元時期1 升折合今約為702 mL。最終確定處方為大黃、枳實、羌活、厚樸均為生品各30 g，加水“三升”（2100 mL），煎至“一升半”（1050 mL）。

3.2 色譜條件分析

本實驗采用UPLC 建立三化湯特征圖譜和指標成分含量測定方法，前期實驗分別采用乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液做流動相，經對比發現，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液進行梯度洗脫時，基線平穩，色譜峰分離效果較好。

另外考察不同體積流量（0.2、0.3、0.4 mL/min）對色譜峰的影響，當體積流量升高時，主要成分色譜峰分離度較低，當體積流量控制在0.2 mL/min 時，色譜峰峰形較好。波長在250～260 nm 時，特征圖譜出峰較多，整體成分信息較為全面；255 nm 波長下基線平穩，各成分色譜峰分離效果較好，故最終選擇255 nm 作為特征圖譜的最佳波長。

3.3 指標成分的選擇及量值傳遞研究

基準樣品中柚皮苷和新橙皮苷專屬性強且含量遠高于其他成分，在特征圖譜中較為明顯，2 成分在熱水中水溶性較好，有研究證明，新橙皮苷對柚皮苷具有一定的增溶作用[14]，且兩者轉移率均大于40%，前期實驗研究發現辛弗林在含量測定圖譜中有明顯陰性干擾，因此未選擇其作為枳實的測定指標成分。基準樣品中紫花前胡苷相比于《中國藥典》2020 年版規定的羌活測定指標成分異歐前胡素和羌活醇UPLC 分離效果更好，而且在進行TLC 鑒別過程中紫花前胡苷的分離度較好、表征明顯，更有利于質量標準的建立，因此選擇其作為指標成分之一。基準樣品中游離總蒽醌、和厚樸酚與厚樸酚極性較低，作者采用三氯甲烷作提取溶劑制備基準樣品中游離總蒽醌、和厚樸酚與厚樸酚含量測定供試品，有效降低了大極性成分對于檢測指標的干擾，同時縮短了檢測時間，并通過切換不同波長，增強了檢測指標色譜峰信號。

以指標成分轉移率在均值的±30%為衡量標準，15 批三化湯基準樣品中紫花前胡苷、柚皮苷和新橙皮苷轉移率結果均符合該規定，但部分批次和厚樸酚與厚樸酚總量、游離總蒽醌的轉移率未在均值的±30%范圍內，其中220105、220502 批次厚樸中明顯略高于均值的30%，分析原因可能是制備過程中受煎煮環境等因素影響導致指標成分轉移率相差較大，后期制劑生產可考慮適當剔除部分批次轉移率過低的飲片或采用混批投料方式來保證量值傳遞的均一性。大黃中游離蒽醌類化合物與厚樸中厚樸酚已被證明均是三化湯發揮治療腦卒中的重要成分[15-16]，厚樸酚與和厚樸酚是同一化學結構的同分異構體，具有疏水性烯丙基聯苯酚類結構[17]，水溶性較差，轉移率較低；隨著提取時間增加，部分游離蒽醌并不穩定，會產生氧化分解[18]，后期制劑生產中應改進提取工藝，以期提高藥效成分含量。

經典名方基準樣品作為制劑開發的中間體，是制劑前期生產的重要部分[19]，更是建立飲片-中間體-制劑質量控制體系的關鍵，闡明方中關鍵成分量值傳遞規律，可以保證基準樣品的均一、穩定[20-22]。本研究通過建立不同批次基準樣品特征圖譜對三化湯整體成分信息進行表征和相似度評價，并對其共有峰進行了指認與歸屬，所建立的特征圖譜相似度均大于0.98，含量測定結果顯示基準樣品各指標成分轉移率基本控制在均值的±30%，各批次處方干膏轉移率均在均值的90%～110%，波動范圍在規定的均值±10%，表明基準樣品制備工藝及處方轉移率較為穩定，可為后續三化湯制劑的進一步開發提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突