基于質量源于設計理念優化都梁方滲漉提取工藝

李燕燕，周瑋玲，侯寓森，趙淋仙，徐純藝，馬 川，劉 兵，代文東，何 瑤*，胡慧玲*

1. 西南特色中藥資源國家重點實驗室，成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137

2. 四川全泰堂中藥飲片有限公司，四川 遂寧 629000

都梁方源于宋代王璆集民間驗方所著《是齋百一選方》[1]，由白芷研末加煉蜜為丸而成。后人在此基礎上加入川芎作為臣藥，以4∶1 的質量配比制成蜜丸劑（《北京市中藥成方選集》），能散風止痛，主治感冒風寒、頭痛眩暈、鼻塞不通、身熱倦怠[2]。方中白芷與川芎配伍，白芷善入頭部，祛風散寒、通竅止痛，多用于眉棱骨痛，治陽明經頭痛，為君藥；川芎乃血中之氣藥，能上行頭目，下行血海，活血行氣，為臣藥。二藥合用，共奏祛風散寒、活血止痛之效，臨床上用于風寒瘀血阻滯脈絡所致的頭痛，癥見頭脹痛或刺痛，痛有定處，反復發作，遇風寒誘發或加重。研究表明，都梁方中白芷、川芎配伍在鎮痛、抗炎等方面具有良好的協同作用[3-4]，醇提部位是其發揮藥效的重要部位，其藥效物質基礎包括白芷香豆素類成分、川芎苯酞類及有機酸類成分等[5-7]。都梁方作為經典頭痛驗方，研究人員對其進行了不同的劑型改良研究，如都梁口服液[8]、都梁顆粒[9]等。《中國藥典》2020 年版收錄有都梁丸、都梁軟膠囊及都梁滴丸[10]。然而，現有的都梁方制劑提取工藝優化往往以方中1 個或2 個成分為指標，且溶劑用量、乙醇體積分數、提取溫度等參數范圍選擇不一[11-12]。都梁軟膠囊和都梁滴丸的提取工藝均采用了乙醇為提取溶媒，但乙醇的體積分數不一，工藝參數不明確，且《中國藥典》2020 年版質量標準中僅規定白芷歐前胡素和異歐前胡素為含量測定指標成分，未對川芎有效成分做定量質量檢測要求，其質量控制和工藝研究有待加強。

中藥質量是保證中藥功效穩定性及應用安全性的基礎，其規范化、標準化、現代化，是推動中藥走向國際化的重要前提[13]。近年來國家高度重視中藥全過程質量控制體系的建設，《國務院辦公廳關于全面加強藥品監管能力建設的實施意見》《國家藥監局關于促進中藥傳承創新發展的實施意見》等均明確提出要加強中藥全過程質量控制，促進中藥傳承創新發展。質量源于設計（quality by design，QbD）是一種用于藥品研發生產的科學理念，注重于對源頭、過程的控制，將藥品質量控制從成品檢驗移至前期工藝設計、生產過程當中，從設計層次保證藥品質量。QbD 的核心在于建立設計空間，其本質在于獲得一個參數操作和原料質量波動的優化范圍，各因素在可接受的范圍內變動，均不會影響工藝所得產物的質量穩定性。在中藥制劑工藝環節中，提取工藝是中藥復方藥效物質與質量控制領域的核心環節，優化中藥復方提取工藝參數，是高效充分提取藥效物質，保障臨床有效性的前提，也是影響中藥制劑質量的關鍵因素[14]。因而，本實驗在QbD 理念下明確關鍵工藝參數（critical process parameters，CPPs）和關鍵質量屬性（critical quality attributes，CQAs），以白芷中歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯和川芎中阿魏酸、Z-藁本內酯、洋川芎內酯A為指標成分，采用Box-Behnken 實驗優化滲漉提取工藝，建立設計空間并進行驗證，以保證都梁方滲漉提取工藝的穩定，為促進都梁方制劑質量控制水平提升及其改良型新藥開發奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Ultimate 3000 型高效液相色譜儀，8321033DAD 型檢測器，7120988 型四元泵，8738269型自動進樣器，6280773 型柱溫箱，美國Thermo Fisher 公司；PS-100A 型超聲清洗機，深圳潔康超聲波清洗器有限公司；SQP 型十萬分之一電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；UPK-I-10T 型優普系列超純水器，四川優普超純科技有限公司；800A 型佰好佳多功能粉碎機，永康市紅太陽機電有限公司；DZKW-4 型電子恒溫水浴鍋，北京中興偉業儀器有限公司；101-2B 型電熱恒溫干燥箱，尚誠儀器制造有限責任公司。

1.2 試藥

白芷飲片（批號21110103）購自四川翼方中藥飲片有限公司，執行《中國藥典》2020 年版標準；酒川芎飲片（批號210701）購自四川德仁堂中藥科技股份有限公司，執行《四川省中藥飲片炮制規范》2015 年版標準。經成都中醫藥大學中藥鑒定專業劉薇副教授鑒定，白芷為傘形科當歸屬植物杭白芷Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook.f. var.formosana(Boiss.) Shan et Yuan 的干燥根，川芎為傘形科藁本屬植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖。

對照品歐前胡素（批號21070702）、異歐前胡素（批號21091802）、佛手柑內酯（批號21031001）、阿魏酸（批號 22032207）、Z-藁本內酯（批號wkq20051709）、洋川芎內酯A（批號22021701），質量分數均≥98%，購自成都普菲德對照品科技有限公司。色譜純冰乙酸（批號2021092701）、分析純乙醇（批號2022091501）購自成都市科隆化學品有限公司；色譜純甲醇（批號WXBD8013V）購自西格瑪奧德里奇貿易有限公司。

2 方法與結果

2.1 都梁方的提取工藝

稱取白芷粗粉40.0 g，川芎粗粉10.0 g，采用滲漉法提取。加適量一定體積分數的乙醇，浸漬一定時間后，以適宜的速度滲漉，收集滲漉液，調整體積至500 mL（飲片量0.1 g/mL）。

2.2 CPPs 和CQAs 的確定

2.2.1 CPPs 的的篩選及風險評估 都梁方采用滲漉法提取過程中主要受4 個方面的因素影響：環境、設備、飲片和提取條件，將以上4 個因素細化，繪制成魚骨圖，初步確定潛在關鍵工藝參數（potential critical process parameters，pCPPs），結果見圖1。采用失效模式及效應分析（failure modes and effect analysis，FMEA），根據魚骨圖提供的pCPPs 進行篩選，通過嚴重程度（S）、發生概率（O）和檢測難易程度（D）對工藝參數的風險進行量化，評分細則見表1。結合文獻調研和前期研究基礎，對各工藝參數的S、O及D賦值并計算風險優先系數（risk priority number，RPN），RPN＝S×O×D。根據RPN 值高低確定CPPs，每個參數的RPN 值見表2，當RPN 值大于10 時，認定其為都梁方滲漉提取過程中的高風險因素，將被識別為CPPs。由FMEA風險評估結果可知，乙醇體積分數、乙醇用量、滲漉體積流量、浸漬時間的RNP 值較大，因此，選定乙醇體積分數、乙醇用量、滲漉體積流量、浸漬時間為影響都梁方滲漉提取工藝的CPPs。

圖1 都梁方提取工藝參數風險辨識魚骨圖Fig. 1 Fishbone diagram for risk identification of Duliang formula extraction process parameters

表1 都梁方滲漉提取工藝S、O 及D 的評分原則Table 1 Scoring principles of S, O and D in percolation extraction process of Duliang formula

表2 都梁方滲漉提取工藝FMEA 風險評估結果Table 2 FMEA risk assessment results of percolation extraction process in Duliang formula

2.2.2 CQAs 的確定 根據劉昌孝院士[15]提出的質量標志物（quality markers，Q-Marker）概念，基于有效性、特有性、質量傳遞與溯源、可測性和復方配伍的“五原則”，通過文獻研究預測歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯、阿魏酸、Z-藁本內酯、洋川芎內酯A 為都梁方的質量標志物[4,16-20]。同時，考慮中藥提取物的干膏率，最終將6 個成分的提取量（Y1～Y6）和干膏率作為都梁方提取工藝的CQAs。

2.3 都梁方中6 個CQAs 成分含量測定方法的建立

2.3.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯、阿魏酸、Z-藁本內酯、洋川芎內酯A 對照品2.92、1.08、0.46、0.82、7.93、9.20 mg，加入甲醇定容到10 mL，溶解制成質量濃度分別為292、108、46、82、793、920 μg/mL 的混合對照品儲備溶液，混勻備用。

2.3.2 供試品溶液的制備 稱取白芷粗粉40.0 g、川芎粗粉10.0 g，加入一定量一定體積分數的乙醇溶液，以適宜的滲漉速度提取，收集滲漉液，調整體積至500 mL（飲片量0.1 g/mL），混勻，0.22 μm濾膜濾過，即得。

2.3.3 陰性供試品溶液的制備 分別稱取缺白芷、川芎的粗粉，按照“2.3.2”項下方法制備缺白芷和缺川芎陰性供試品溶液。

2.3.4 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相為甲醇-1%醋酸水溶液，梯度洗脫：0～8 min，35%～75%甲醇；8～23 min，75%甲醇；檢測波長為300 nm；柱溫為30 ℃；進樣量10 μL；體積流量1 mL/min。

2.3.5 專屬性試驗 精密移取“2.3.1”項下混合對照品溶液、“2.3.2”項下供試品溶液、“2.3.3”項下陰性供試品溶液各10 μL，按“2.3.4”項下色譜條件進樣測定。結果表明，供試品溶液中歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯、阿魏酸、Z-藁本內酯、洋川芎內酯A分別與對照品色譜峰的保留時間對應一致，各色譜峰均能較好分離（R＞1.5），陰性對照無明顯干擾，色譜圖見圖2。

圖2 6 種成分的混合對照品溶液 (A)、都梁方供試品溶液 (B)、缺白芷陰性樣品 (C)、缺川芎陰性樣品 (D) 的HPLC 圖Fig. 2 HPLC diagrams of six components mixed reference solution (A), Duliang formula sample solution (B), negative sample without Angelicae Dahuricae Radix (C) and negative sample without Chuanxiong Rhizoma (D)

2.3.6 線性關系考察 取“2.3.1”項下混合對照品儲備溶液，用甲醇制得系列質量濃度的混合對照品溶液，按“2.3.4”項下色譜條件分別測定不同質量濃度下歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯、阿魏酸、Z-藁本內酯、洋川芎內酯A 的色譜峰峰面積，以對照品溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），分別對歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯、阿魏酸、Z-藁本內酯、洋川芎內酯A 質量濃度進行線性回歸，得到回歸方程分別為歐前胡素Y＝453.58X－0.761 8，R2＝0.999 8；異歐前胡素Y＝458.36X－0.084 1，R2＝0.999 8；佛手柑內酯Y＝539.26X－0.049 1，R2＝0.999 8；阿魏酸Y＝728.41X－0.453 9，R2＝0.999 9；Z-藁本內酯Y＝200.75X＋0.082 1，R2＝0.999 7；洋川芎內酯AY＝64.306X－0.764 3，R2＝0.999 5。結果表明，歐前胡素在18.250～292.000 μg/mL，異歐前胡素在6.750～108.000 μg/mL，佛手柑內酯在 2.875 ～46.000 μg/mL，阿魏酸在5.125～82.000 μg/mL，Z-藁本內酯在49.612～793.800 μg/mL，洋川芎內酯A 在57.500～920.000 μg/mL 與峰面積線性關系良好。

2.3.7 精密度試驗 取“2.3.2”項下供試品溶液1份，按“2.3.4”項下色譜條件連續進樣6 次，分別計算歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯、阿魏酸、Z-藁本內酯、洋川芎內酯A 的峰面積RSD 值為0.64%、0.74%、0.69%、0.48%、0.65%、0.63%，結果表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩定性試驗 取“2.3.2”項下供試品溶液1份，按“2.3.4”項下色譜條件分別在制備后0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，分別計算歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯、阿魏酸、Z-藁本內酯、洋川芎內酯A 的峰面積RSD 值為1.06%、0.95%、1.11%、0.96%、1.09%、1.23%，結果表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.9 重復性試驗 依據“2.3.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.3.4”項下色譜條件進行測定，分別計算歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯、阿魏酸、Z-藁本內酯、洋川芎內酯A 質量分數的RSD 值為1.29%、1.60%、1.42%、1.59%、1.18%、1.17%，結果表明方法重復性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗 依據“2.3.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，分別加入與供試品溶液中相應成分含量約1∶1 的對照品溶液，按“2.3.4”項下色譜條件進行測定，計算得到供試品溶液中歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯、阿魏酸、Z-藁本內酯、洋川芎內酯A 的平均加樣回收率分別為102.09%、102.69%、101.20%、107.67%、105.69%、104.13%，RSD 分別為3.48%、4.06%、1.49%、1.79%、1.18%、1.60%，符合試驗要求。

2.3.11 樣品測定 按照“2.3.2”項方法制備供試品溶液，按照“2.3.4”項色譜條件進行測定，計算各指標成分的含量（各指標成分質量/總投藥量）。

2.4 干膏率的測定

按干燥失重法進行測定，精密量取都梁方滲漉液25 mL 于已恒定質量的蒸發皿中，水浴蒸干，于105 ℃電熱鼓風干燥箱中干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速稱定質量，再于105 ℃干燥1 h，冷卻稱定質量，反復干燥至恒定質量（即±0.3 mg），計算干膏得率。

m為25 mL 提取液中干浸膏質量，V為提取液總體積，M為總投藥量

2.5 CPPs 與CQAs 的相關性研究

2.5.1 Box-Behnken 實驗設計與結果 為探討都梁方醇提工藝中CPPs［乙醇體積分數（A）、乙醇用量（B）、滲漉體積流量（C）、浸漬時間（D）］與CQAs［歐前胡素（Y1）、異歐前胡素（Y2）、佛手柑內酯（Y3）、阿魏酸（Y4）、Z-藁本內酯（Y5）、洋川芎內酯A（Y6）含量和干膏率］的相關性，設計4 因素3 水平的Box-Behnken 實驗，Box-Behnken 實驗設計與響應值見表3。

表3 都梁方滲漉提取工藝Box-Behnken 響應面實驗設計及結果Table 3 Box-Behnken response surface experimental design and results of Duliang formula percolation extraction process

2.5.2 綜合評價指標權重的確立

（1）層次分析（analytic hierarchy process，AHP）法：AHP 是主觀確定權重的方法[21]。現代研究表明，歐前胡素、異歐前胡素是君藥白芷中重要的香豆素類成分，具有鎮痛作用，是其關鍵藥效物質；阿魏酸、Z-藁本內酯是臣藥川芎發揮活血止痛的關鍵藥效成分。故根據都梁方藥味君臣配伍、各成分藥效作用的重要性以及各成分含量的多少，將這6 種指標成分及干膏率作為權重指標予以量化，即將7 項指標分成7 個層次，并確定各指標的優先順序：歐前胡素＝異歐前胡素＞佛手柑內酯＞阿魏酸＝Z-藁本內酯＞洋川芎內酯A＝干膏率，以此構成成對比較的判斷優先矩陣，并獲得各項指標的相對評分，指標成對比較的判斷優先矩陣見表4。根據表4 評分結果，AHP 法計算得到歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯、阿魏酸、Z-藁本內酯、洋川芎內酯A含量及干膏率7 項指標權重系數分別為0.304 5、0.304 5、0.152 2、0.076 1、0.076 1、0.052 8、0.038 1，一致性比例因子（CR＝CI/RI，其中，CR 為隨機一致性比率，CI 為一致性指標，RI 為平均隨機一致性指標）＝0.037/1.36＝0.027＜0.10，即指標成對比較判斷矩陣具有滿意的一致性，權重系數有效[22]。

表4 AHP 法指標成對比較的判斷優先矩陣Table 4 Judgment priority matrix of AHP index comparison in pairs

（2）基于指標相關性的權重確定方法（criteria importance through intercriteria correlation，CRITIC）法：中藥復方在提取過程中配伍的變化及成分間的相互作用致使各指標性成分對復方總體提取效果的貢獻不同，主觀確定其權重系數有失偏頗。CRITIC法是一種以評價指標間的對比強度及沖突性作為基礎綜合衡量的客觀賦權分析法，對比強度以標準差的形式來表現，即標準差的大小表明在同一指標內，各方法取值差距的大小；而各指標間的沖突性是以指標之間的相關性為基礎。故CRITIC 法既考慮了指標變異大小對權重的影響，又考慮了各指標間的沖突性。采用CRITIC 法計算各指標權重系數，首先需要對數據進行標準化處理，即評價指標值＝(實測值－最小值)/(最大值－最小值)×100，用SPSS 在線統計軟件處理無量綱化數據，計算得到歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯、阿魏酸、Z-藁本內酯、洋川芎內酯A 含量及干膏率7 項指標權重系數分別為0.127 8、0.212 9、0.090 0、0.130 6、0.213 5、0.097 4、0.127 9。

（3）AHP-CRITIC 混合加權法：根據都梁方功能主治及君臣佐使的分析，AHP 法量化了評價指標兩兩間比較判斷的優先信息，得到了以主觀信息為基礎的權重系數（ωAHP），基本體現了都梁方各指標的主次順序及君臣佐使的順序；同時采用CRITIC法求得相應指標的客觀權重系數（ωCRITIC），這不僅考慮到了各樣本數據的變異性及指標間的相關性對賦權的影響，而且避免了主觀賦權存在的偏頗。但評價權重既要注重客觀又要不失主觀，故而將二者結合起來，計算綜合權重系數（ω復合），即ω復合ij＝ωAHPijωCRITICij/∑ωAHPijωCRITICij，以期評價結果更加客觀、真實[23]。通過計算得歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯、阿魏酸、Z-藁本內酯、洋川芎內酯A含量及干膏率7 項指標的綜合權重系數分別為0.254 2、0.423 4、0.089 5、0.064 9、0.106 1、0.033 6、0.028 2。

（4）綜合評價結果的比較：分別采用經AHP法、CRITIC 法及AHP-CRITIC 混合加權法分析得到的權重系數對實驗結果進行綜合評分比較，結果見表5。通過相關系數分析，AHP 法與CRITIC 法之間的相關系數為0.933，AHP 法與AHP-CRITIC混合加權法的相關系數為0.997，CRITIC 法與AHPCRITIC 混合加權法之間的相關系數為0.921，三者相關性顯著（P＜0.05），說明3 種權重法得到的評分結果具有一致性。從權重系數分析，CRITIC 法與AHP 法的相關系數為0.289，相關性不顯著（P＝0.529＞0.05），說明二者所反映信息不具有疊加性。相比之下，AHP-CRITIC 混合加權法是從主觀和客觀2 個方面加以考慮，所體現的信息量也就更為全面[24]，所得綜合評分結果更為科學、合理、更接近實際情況，因此本研究采用AHP-CRITIC 法計算綜合評分。

表5 AHP、CRITIC、AHP-CRITIC 3 種賦權法的綜合評分結果Table 5 Comprehensive scoring results of AHP, CRITIC and AHP-CRITIC three weighting methods

2.5.3 CQAs 的回歸模型及方差分析結果 利用Design-Expert.V8.0.6 軟件對AHP-CRITIC 綜合評分結果進行2 次多元回歸擬合，得到4 個自變量的2次多元回歸模型，其回歸方程：綜合評分＝89.31＋6.93 A＋4.37 B－0.67 C－1.64 D－0.79 AB＋0.45 AC＋0.47 AD－0.75 BC－0.07 BD＋3.15 CD－7.89 A2－2.75 B2＋0.88 C2＋1.43 D2，回歸模型方差分析結果見表6。

表6 Box-Behnken 響應面實驗的方差分析結果Table 6 Analysis of variance results of Box-Behnken response surface experiment

根據方差分析結果，2 次多元模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P＝0.103 9＞0.05），說明該模型具有統計學意義，可用于表示各因素與響應值之間的關系。方程的擬合相關系數R2＝0.933 8，Radj2＝0.867 7，變異系數（CV）＝3.10%，表明模型擬合效果良好，因此，可用此模型進行預測和分析。提取工藝考察的4 個因素中，乙醇體積分數A（P＜0.000 1）和乙醇用量B（P＜0.000 1）為極顯著項，滲漉體積流量C（P＝0.399 8）以及浸漬時間D（P＝0.051 5）為不顯著項；二次項中，A2（P＜0.000 1）和B2（P＝0.019 7）為顯著項，C2（P＝0.412 6）和D2（P＝0.193 0）為不顯著項，表明所選因素與響應值并非簡單的線性關系；交互項CD（P＝0.033 2）顯著，其交互作用不明顯。根據各因素F值大小，各因素對綜合評分的影響為A＞B＞D＞C。

通過軟件繪制各因素對都梁方滲漉提取工藝綜合評分影響的3D 響應面圖，如圖3 所示。乙醇體積分數（A）、乙醇用量（B）對都梁方滲漉提取工藝綜合評分影響較大，形成的3D 響應面曲線圖較陡峭。從圖的顏色變化可以初步判定，變化趨勢增加，其顏色也呈加深趨勢，顏色越接近紅色表明綜合評分越高。運用Design-Expert.V8.0.6 軟件優化所得的都梁方滲漉提取最佳工藝的預測值為乙醇體積分數51.48%，乙醇用量7.98 倍，滲漉體積流量為3.00 mL/min、浸漬時間為12.02 h，在此條件下歐前胡素為1.577 2 mg/g，異歐前胡素為0.568 9 mg/g，佛手柑內酯為0.144 2 mg/g，阿魏酸為0.377 1 mg/g，Z-藁本內酯為3.244 4 mg/g，洋川芎內酯A 3.081 9 mg/g，干膏率為20.190 6%，綜合評分為97.728 9分。結合實際，響應面實驗中所得提取工藝參數最優值為乙醇體積分數52%，乙醇用量8 倍，滲漉體積流量為3 mL/min、浸漬時間為12 h。

圖3 4 因素對綜合評分的響應面圖Fig. 3 Response surface of four factors to comprehensive score

2.6 設計空間的建立

由于工業生產中最佳提取條件具有一定的局限性，故根據Box-Behnken 實驗所得結果，設定綜合評分≥88 分為優化目標，建立設計空間，為工業生產確定提取條件范圍，以滿足生產的實際需要。由于根據模型建立的設計空間是一個動態的設計空間，乙醇體積分數、乙醇用量、滲漉體積流量、浸漬時間都是調節設計空間的因素，任一因素的改變都會造成設計空間范圍的波動。故有必要協調4 個因素之間的關系以獲得較好的實驗結果。但是平面設計空間僅能體現2 個因素，故選擇滲漉體積流量、浸漬時間為固定因素，構建影響顯著的乙醇體積分數、溶劑用量的設計空間。

結合實際，分別選擇滿足優化目標的滲漉體積流量4、3 mL/min 和浸漬時間12、24 h 為固定水平，建立都梁方提取工藝參數的設計空間。由于模型的預測值與真實值存在一定差異，使設計空間的邊界具有不確定性，因此在定義設計空間參數時加入置信水平α＝0.05 的置信區間，對設計空間進行優化，通過Overlay plot 展示，黃色部分即為設計空間，結果見圖4。實際生產過程中，考慮到對滲漉液質量進行控制的難易程度以及適用于工業化大生產，因此最終確定操作空間為乙醇體積分數50%～55%、乙醇用量為8～10 倍、滲漉體積流量為3～4 mL/min、浸漬時間為12～24 h。

圖4 都梁方提取工藝設計空間圖Fig. 4 Space diagram of extraction process design of Duliang formula

2.7 控制空間的驗證

為了驗證所建立模型的有效性以及設計空間的可靠性，隨機選取設計空間4 個點進行驗證，其中1～2 號在空間內，3 號在置信區間，4 號在空間外，實驗條件的選取見表7，驗證結果見表8。結果顯示，實際值與預測值之間的偏差均小于5%，可見模型具有良好的預測能力；設計空間及置信區間內實驗點綜合評分均達到要求，而設計空間外的點均不達要求，表明在設計空間內操作能保證提取工藝的穩定可靠。

表7 設計空間驗證試驗點的選取Table 7 Selection of verification test sites in design space

表8 設計空間驗證試驗結果Table 8 Results of space verification test

3 討論

3.1 提取方法的選擇與確定

國家藥品監督管理局藥品審評中心發布的《中藥復方制劑生產工藝研究指導原則（試行）》[25]中，明確指出中藥復方制劑生產工藝研究應基于“質量源于設計”的理念以及體現復方整體質量特性。目前，QbD 理念在中藥提取工藝優化[26]、中藥制備及制劑優化[27-28]、中藥分離純化[29]中研究較多，旨在提高工藝穩健性和產品質量可控性，故本研究采用QbD 理念優化都梁方提取工藝。都梁方由白芷、川芎2 味組成，其中白芷主要藥效成分為香豆素、揮發油等[30]，川芎主要藥效成分為揮發油、有機酸、生物堿等[18]。白芷香豆素雖可溶于沸水，但其中歐前胡素和異歐前胡素受熱不穩定，前者易發生Claisen 烯丙基重排，生成別歐前胡素，即使在真空中加熱也會如此[31]，故長時間較高溫度的提取不利于香豆素類成分的提取。滲漉法是一種動態浸出方法，提取率高，一般在常溫下進行，尤為適用于熱不穩定成分的提取，在中藥生產中應用廣泛。有學者認為借鑒QbD 理念對滲漉工藝進行優化，是今后的發展趨勢[32]。因此，本研究采用乙醇滲漉法提取都梁方，能較好地保留其有效成分，充分發揮其臨床療效。

關于乙醇體積分數的選擇，前期單因素實驗發現6 個指標成分含量均在50%乙醇處出現極大值。在30%～90%乙醇時，阿魏酸提取量在50%乙醇處取得最優水平，而后隨著乙醇體積分數的升高其含量逐漸降低；歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯、Z-藁本內酯、洋川芎內酯A 這5 個成分含量隨著乙醇體積分數的變化趨勢整體一致，在30%～50%乙醇時均隨著乙醇體積分數的升高而升高，在50%乙醇處取得較優水平，而后隨著乙醇體積分數的升高其含量先降低后升高，在90%乙醇處的含量非常接近于50%乙醇水平。可能是以50%乙醇為提取溶媒時，提取液中成分豐富、各成分間產生“助溶”現象。故本研究以50%乙醇為0 水平進行響應面優化。

3.2 CQAs 的選擇及綜合評價指標的賦權

本研究基于劉昌孝院士提出的中藥質量標志物（Q-Marker）的有效性、特有性、質量傳遞與溯源、可測性和復方配伍“五原則”，進行CQAs 的篩選。“有效”是Q-Marker 的核心要素。研究表明，香豆素類成分是治療偏頭痛的藥效物質基礎[16-17]，歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯為君藥白芷中香豆素類成分，具有鎮痛抗炎的作用，能明顯降低偏頭痛模型大鼠血和腦中一氧化氮水平。Z-藁本內酯、洋川芎內酯A 為臣藥川芎中苯酚類成分，具有擴血管、鎮痛等藥理作用[18]。阿魏酸也來源于臣藥川芎，具有抗凝血、抗炎鎮痛等作用[19]。

從質量傳遞與溯源的角度，血中的效應成分是質量傳遞體系的最終環節，也是中藥Q-Marker 確定的重要依據。有研究對都梁丸的入血成分進行分析研究[20]，通過對照品鑒別出歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯、阿魏酸、藁本內酯、洋川芎內酯A 等原型入血成分，表明這6 個成分都可入血，可作為都梁方質量控制的重要參考。復方配伍方面，有研究發現川芎作為臣藥可以促進君藥白芷中香豆素類化合物歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯等的吸收，同時減緩其在體內的消除速率，提高其生物利用度[4]。最后，這6 個成分均具有可測性。因而選擇這6 個成分作為Q-Marker 進行含量控制。

在加權評分方面，歐前胡素、異歐前胡素為都梁滴丸和都梁軟膠囊在《中國藥典》2020 年版的含量測定指標成分，且都梁方滲漉液中佛手柑內酯含量低于歐前胡素、異歐前胡素，故AHP 法賦權時君藥白芷中3 個指標成分的優先順序為歐前胡素＝異歐前胡素＞佛手柑內酯。Z-藁本內酯含量高且鎮痛作用較強，阿魏酸為偏頭痛藥效成分之一，且為川芎在《中國藥典》2020 年版的質量評價指標成分，故AHP 法賦權時臣藥川芎中3 個指標成分的優先順序為阿魏酸＝Z-藁本內酯＞洋川芎內酯A。同時，根據中藥制劑特性，將干膏率納入質量評價體系。

3.3 設計空間的建立

QbD 理念的核心在于設計空間的建立。常規中藥提取工藝多采用單因素實驗結合正交實驗優選出最佳的工藝參數，并采取固定的提取工藝參數進行生產，易導致不同批次或同一批次間質量波動范圍較大。設計空間的構建則是基于風險思維確定CPPs 的可接受范圍，在設計空間范圍內可根據生產設備條件、原料藥材的質量以及不同的環境對工藝參數進行靈活調節，保證中間體、最終產品的質量穩定性。本研究在定義設計空間參數時加入置信水平α＝0.05 的置信區間，建立顯著影響因素A、B 的設計空間，分別固定另2 個因素。當固定滲漉體積流量在5 mL/min 時，在浸漬時間12～20 h 過程中設計空間面積隨浸泡時間增加的變化幅度明顯，而浸泡時間20～36 h 過程中，設計空間面積隨浸泡時間增加的變化幅度較緩和。當固定滲漉體積流量在4 mL/min 時，在浸漬時間12～24 h 過程中設計空間面積隨浸泡時間增加的變化幅度較緩和；當固定滲漉體積流量在3 mL/min 時，在浸漬時間16～20 h 過程中設計空間面積隨浸泡時間增加的變化幅度較緩和。

以綜合評分88 分為下限，發現Box-Behnken 實驗中滿足條件的以滲漉體積流量4、3 mL/min 為絕大多數，浸漬時間12、24 h 為絕大多數，另外在實際實驗中滲漉體積流量為5 mL/min 不易控制，滲漉提取工藝參數中的浸漬時間多數為12～48 h[32]。故選擇滲漉體積流量4、3 mL/min，浸漬時間12、24 h 分別構建A、B 的設計空間，確定A、B 的操作空間分別為50%～55%、8～10 倍。同時，選擇A、B為固定因素，分別以A 為50%、55%和B 為8 倍、10 倍為固定水平，構建影響不顯著的滲漉體積流量和浸漬時間的設計空間，結果表明浸漬時間在12～24 h 均可滿足優化目標。故結合實際確定最佳提取工藝范圍為乙醇體積分數50%～55%、乙醇用量為8～10 倍、滲漉體積流量為3～4 mL/min、浸漬時間為12～24 h。驗證實驗結果與預測值符合良好，表明在設計空間內操作能保證都梁方滲漉提取液質量的均一可控；設計空間法運用于都梁方滲漉提取工藝穩定可行，為實際大生產中工藝參數的篩選提供思路。

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