全緣千里光堿脂質體及其凝膠劑的皮膚滲透研究與機制探討

盧玉潔，周珊珊，單鈺君，徐瑩瑩，程碧欣，朱志紅，鄭杭生

浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310053

全緣千里光堿（integerrimine，INT）是從菊科（Compositae）千里光屬SenecioL.的多年生草本植物峨嵋千里光SeneciofaberiHemsl.中提取的一種雙稠吡咯環生物堿，能干擾細胞的有絲分裂而具有抗腫瘤作用，但全身用藥后，對肝臟產生蓄積性的、不可逆的強烈毒性作用[1]。除了在20 世紀70 年代國內臨床上小規模地通過灌注治療膀胱癌[2]外，基本未在臨床推廣使用。徐月紅等[2]與成秉辰[3]的研究證明INT 對皮膚黑色素瘤有抑制作用，徐月紅等[4]首先提出將INT 制成脂質體后皮膚外用用于治療皮膚癌，并申請了專利。脂質體包裹的INT 皮膚應用后可以提高INT 在皮膚局部角質層或表皮類脂內的滯留量，延長滯留時間，減少全身吸收，從而增強抗皮膚癌的效果，降低全身性毒性。

脂質體在皮膚局部用藥與化妝品領域的應用近30 年來受到了人們的廣泛關注，將脂質體分散于水性凝膠基質中制成脂質體凝膠劑是這類制劑的常見應用形式[5-6]。載藥脂質體及其凝膠劑的皮膚藥物滯留與滲透行為的考察對于闡明制劑的經皮吸收特性是必不可少的，同時有助于探討脂質體與凝膠的相互作用、制劑皮膚應用后增效減毒的特性以及制劑的作用機制，故本實驗研究了INT 脂質體及其凝膠劑的藥物離體皮膚滯留與滲透行為。

1 儀器與材料

LC-2130 型高效液相色譜儀、LC-2030 型紫外檢測器，上海天美科學儀器有限公司；TT-8D 型藥物透皮吸收儀，天津市正通科技有限公司；T-25 型高剪切分散儀，德國易卡公司；Emulsi Flex-C5 型高壓均質機，加拿大Avestin 公司；Nicomp 380 CLS型激光散射粒度測定儀，美國Pss 公司；BX51 型光學顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社；透明膠帶，北京市鑫田黎明醫療器械有限公司；TDL-80-2S 型低速離心機，上海安亭科學儀器廠；H-600 型透射電子顯微鏡（TEM），日本HITACHI 株式會社。

INT 原料藥，由上海植華生物工程有限公司從峨眉千里光中提取并純化，質量分數＞90%；INT 化學對照品，自制，由INT 原料藥經重結晶而得，質量分數＞98.0%；Carbopol 934P NF，美國Goodrich公司，批號cc24HBB151；三乙醇胺、尼泊金乙酯、氯仿、氨水、NaCl，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；維生素E，1012 IU，西格瑪奧德里奇公司；乙腈，HPLC 級，德國Merck 公司；甘油，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；膽固醇，注射級，上海艾韋特醫藥科技有限公司；大豆磷脂，注射級，磷脂酰膽堿含量大于70%，上海太偉藥業有限公司；pH 4.0 檸檬酸緩沖液（CBS 4.0），將0.1 mol/L 檸檬酸溶液與0.2 mol/L 磷酸氫二鈉溶液按62∶38 的比例混合配成。HPLC 用水為雙蒸水。

新西蘭大白兔，雄性，體質量（2.5±0.2）kg，清潔級，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供［合格證號SCXK（滬）2013-0016］。所有動物實驗遵循浙江中醫藥大學動物實驗研究中心有關實驗動物管理和使用的規定，均符合3R 原則。

2 方法與結果

2.1 樣品的制備與表征

進行離體皮膚滲透與滯留考察的樣品包括：INT 脂質體、INT 脂質體凝膠劑與INT 普通凝膠劑。

2.1.1 INT 脂質體的制備與表征 按前期研究所得的優化處方與制法[7]制備優化處方脂質體樣品。

處方：按制備1000 g 脂質體混懸液成品計，INT 20.5 g、大豆磷脂60.0 g、膽固醇15.0 g、維生素E 3.0 g、CBS 4.0 900 mL、1 mol/L NaOH 水溶液適量。

制法：將INT、大豆磷脂、膽固醇、維生素E溶于1500 mL CHCl3，置于20 L 圓底燒瓶中，50 r/min、60 ℃下旋轉蒸發除去CHCl3，在圓底燒瓶瓶壁上形成一層干膜，室溫下真空干燥1 d 以除去殘余CHCl3，加入處方量CBS 4.0 進行水化，首先振搖使瓶壁上的膜溶散，接著冰箱4 ℃放置8～10 h，最后以高剪切分散儀進行分散（間歇剪切10 次，每次持續時150 s），即得均勻分散的脂質體混懸液（其pH 值在5.29 左右）。

通過調節外水相pH 值，可以利用內、外相pH值梯度將INT 主動導入內水相，即為pH 值梯度載藥。在室溫、磁力攪拌下，以1 mol/mL NaOH 水溶液適量調節混懸液的pH 值，即得pH 值梯度載藥優化脂質體成品，充氮氣后4 ℃保存，備用。

為了考察脂質體理化參數對其中包載藥物的皮膚滲透與滯留的影響，對優化處方與制法按需要進行適當的調整，制備如下4 份樣品：按優化處方制備脂質體混懸液，但未進行pH 值梯度載藥，所得樣品pH 值較低，包封率較低，且囊泡粒徑較大，記為1 號樣；按優化處方制備的脂質體混懸液，為了便于比較，與本實驗其他考察樣品平行制備，所得樣品pH 值較高，包封率較高，且囊泡粒徑較大，記為2 號樣；按優化處方制備脂質體混懸液，但未進行pH 值梯度載藥，并進行高壓均質（均質次數為8 次，最大壓力為14 MPa）使粒徑減小，所得樣品pH 值較低，包封率較低，且囊泡粒徑較小，記為3 號樣；對3 號樣的制法進行調整，增加pH 值梯度載藥步驟（提高2 個單位的pH 值），所得樣品pH 值較高，包封率較3 號樣高，且囊泡粒徑較小，記為4 號樣。

采用激光散射粒度測定儀測定上述4 份樣品的粒徑、ζ 電位，按前期研究中建立的方法進行藥物含量與包封率的測定[8]，結果見表1。樣品1 測得粒徑為（349.9±198.0）nm，包封率為12.53%，經過高壓均質后的樣品3 粒徑明顯縮小，包封率也相對減小，而采用pH 值梯度載藥制備的樣品2，粒徑為（281.0±49.6）nm，包封率為57.75%，遠高于樣品1 和樣品3。樣品4 采用了pH 值梯度載藥法并經過高壓均質，有部分結晶出現，因此，未進行包封率測定。

表1 4 份不同脂質體樣品的理化性質 (±s, n = 3)Table 1 Physicochemical parameters of four different liposome samples (±s, n = 3)

表1 4 份不同脂質體樣品的理化性質 (±s, n = 3)Table 1 Physicochemical parameters of four different liposome samples (±s, n = 3)

“-”由于脂質體樣品中存在INT 結晶，未進行包封率測定“-” the EE determination wasn’t conducted because of the presence of INT crystal in the liposome sample

樣品號 平均粒徑/nm ζ 電位/mV 樣品形態 INT/(mg·g-1) 包封率/%1 349.9±198.0 1.03 近球形，單、多層共存 19.51 12.53 2 281.0±49.6 1.09 近球形，單、多層共存 18.88 57.75 3 106.1±47.0 0.07 近球形，單層 18.19 7.77 4 118.1±49.3 1.75 近球形，單層，結晶 17.19 -

取少量樣品滴于銅網正面，多余樣品液用濾紙吸去，滴加少許2%磷鎢酸溶液后負染2 min，用濾紙吸去多余染液，自然晾干后，在TEM 下觀察并拍攝照片。同時，將少量樣品滴于載玻片上，蓋上載玻片，用濾紙吸去多余液體，放置在光學顯微鏡下觀察并拍攝照片。TEM 與顯微鏡下觀察脂質體的形態，結果見圖1、2。TEM 結果表明，脂質體為類圓形，大小及分布較均勻，顆粒間未有明顯的粘連現象。光學顯微鏡結果可以觀察到，脂質體多層的結構。對比3 個樣品，可以看出，高壓均質后脂質體的粒徑明顯減小，大粒徑脂質體pH 值調節前后的形態無顯著變化，小粒徑脂質體pH 值調高后有藥物結晶析出，在光學顯微鏡下即可觀察到明顯結晶，因此，未進行TEM 拍攝。

圖1 用于離體皮膚滲透試驗的脂質體樣品1 (A)、2 (B)、3 (C) 的透射電鏡圖Fig. 1 TEM images of liposome samples 1 (A), 2 (B), 3 (C) for ex vivo skin permeation test

圖2 用于離體皮膚滲透試驗的脂質體樣品1 (A)、2 (B)、3 (C) 與4 (D) 的顯微鏡照片 (×400)Fig. 2 Microscopic pictures of liposome samples 1 (A), 2 (B), 3 (C) and 4 (D) for ex vivo skin permeation tests (× 400)

2.1.2 INT 脂質體凝膠劑的制備 取優化處方制備的脂質體混懸液，按前期研究所得的處方與制法[7]進行制備。按制備1000 g 脂質體凝膠劑成品計，脂質體混懸液589.3 g、Carbopol 934P 15.0 g、甘油90.0 g、蒸餾水304.5 mL、尼泊金乙酯1.2 g、三乙醇胺適量。取處方量的尼泊金乙酯，加熱溶于處方量的蒸餾水中；取處方量的Carbopol 934P，加入甘油潤濕，加入溶有尼泊金乙酯的蒸餾水，攪拌均勻，即得INT 脂質體凝膠放置數小時，使Carbopol 934P溶脹呈透明均質狀態，慢慢加入脂質體混懸液，邊加邊攪拌，至均勻，以適量三乙醇胺調節至合適稠度，即得。成品凝膠劑中囊泡分散良好，無聚集；與未加入凝膠的脂質體相比，凝膠中的脂質體圓整度降低、多層脂質體略變少、粒徑略減小。測得INT質量分數為11.19 mg/g 的凝膠[7]。

2.1.3 INT 普通凝膠劑的制備及其中INT 含量的測定 按前期研究所得的處方與制法進行制備[9]，經含量測定，凝膠劑中INT 的質量分數為11.31 mg/g的凝膠。

2.2 滲透試驗接收液中藥物INT 的HPLC 測定

2.2.1 色譜條件 參照宋華等[10]建立的色譜條件進行測定。色譜柱為X Terra C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters）；流動相為水-乙腈（70∶30），每1000 毫升流動相中加入冰醋酸1 mL，以氨水將pH 值調至8.6；體積流量0.8 mL/min；檢測波長213 nm；柱溫為室溫。在此條件下，理論塔板數以INT色譜峰計不低于3000。

2.2.2 線性關系考察 以空白滲透試驗接收液配制系列質量濃度INT 對照品溶液，按“2.2.1”項下條件進行分析，將INT 的峰面積（A）對質量濃度（C）進行線性回歸，回歸方程為A＝52 771C＋3310（r＝0.999 9，n＝5），可見，INT 在0.499～9.970 μg/mL 內呈良好的線性關系。

2.2.3 精密度試驗 取“2.2.2”項下的INT 對照品溶液，進行精密度試驗，低、中、高質量濃度的日內精密度分別為1.9%、2.1%、1.5%（n＝5），日間精密度分別為2.2%、2.3%、1.7%（n＝3），符合要求。

2.2.4 加樣回收率試驗 以空白滲透試驗接收液配制低、中、高質量濃度的INT 對照品溶液，進行回收率試驗，結果分別為（101.1±1.3）%、（101.3±1.0）%、（100.6±0.9）%，符合要求。

2.2.5 重復性與穩定性試驗 取12 h的離體皮膚滲透試驗接收液，在0 時間點按“2.2.1”項下條件進行分析，連續進樣5 次，計算RSD，結果為0.8%，說明重復性良好；進而分別在1、2、4、8、12 h 進樣分析，計算不同時間點的RSD，結果為1.2%，說明接收液中的INT 在12 h 內穩定。

2.2.6 色譜峰的專屬性 對照空白接收液、含藥滲透試驗接收液與對照品溶液的色譜圖表明，空白接收液對測定無干擾，方法專屬性符合要求。

2.3 皮膚中滯留藥物的HPLC 測定

2.3.1 色譜條件 參照陳思思等[11]建立的色譜條件進行測定。除將流動相改為乙睛-水（23∶77），并用氨水調節其pH 值為7.1 之外，其余同“2.2.1”項下。

2.3.2 皮膚樣品的預處理與HPLC 分析 取待測皮膚樣品，置于13 mm×65 mm 的有柄研磨器中，加入2 mL 氨水作為研磨介質進行研磨，直至將皮膚磨成均勻的漿狀，再加入1 mL 氨水，渦旋混合15 s，用醋酸乙酯提取3 次，各次醋酸乙酯的用量分別為3、2、2 mL，每次提取渦旋30 s、2500 r/min 離心5 min，合并各次醋酸乙酯提取液，氮氣吹干，以乙腈-水（1∶1）混合液200 μL 溶解殘渣后，吸取20 μL 進樣進行HPLC 分析。

2.3.3 色譜峰的專屬性 取離體皮膚滲透實驗中藥物應用720 min 后的皮膚半塊、等面積空白皮膚、等面積空白皮膚加一定量的INT 對照品溶液，分別按上述方法進行樣品預處理與HPLC 分析，色譜圖見圖3-A～C，由圖可見，INT 的出峰時間在10.7 min，皮膚中的內源性成分對INT 的含量測定無干擾，方法專屬性符合要求。

圖3 HPLC 測定皮膚中INT 的色譜峰專屬性試驗色譜圖Fig. 3 Chromatographic peak specificity test chromatograms for determination of INT in skin by HPLC

2.3.4 線性關系考察 取空白皮膚1 cm2，加入不同體積的一定質量濃度INT 對照品水溶液（其中INT 總藥量依次為0.525、2.100、4.200、10.500、15.750、21.000、31.500 μg）。按上述方法對樣品進行預處理與HPLC 分析，進樣后記錄INT 對應的峰面積（A），將峰面積對INT 總量（m）進行線性回歸，回歸方程為A＝203 992m－24 120（r＝0.999 8，n＝7），可見，INT 在0.525～31.500 μg 內呈良好的線性關系。另外，經測定本法的最低檢測限為0.05 μg（S/N≥3）。

2.3.5 回收率、精密度與提取回收率試驗 取空白皮膚1 cm2，加入不同體積的一定質量濃度INT 對照品水溶液（其中INT 總藥量依次為0.525、4.200、31.500 μg）。按“2.3.2”項下方法對樣品進行預處理，并按“2.3.1”項下方法進行HPLC 分析，記錄INT對應的峰面積，各個加藥量的空白皮膚樣品分別在1 d 內連續測定5 份，求得日內精密度，并由標準曲線計算相對回收率，各個加藥量的空白皮膚樣品分別在5 d 各測1 份，求得日間精密度，結果見表2。可見，方法精密度與準確性良好。

表2 日內、日間精密度與相對回收率試驗結果 (n = 5)Table 2 Within-day and inter-day precision and relative recovery (n = 5)

另將INT 對照品水溶液直接進樣，測得相應峰面積，以此為參照，計算空白皮膚中3 種不同加藥量（分別為0.525、4.200、31.500 μg）樣品的提取回收率分別為79.97%、82.09%、78.48%，平均值為80.18%，符合生物樣本含量測定中對提取回收率的要求。

2.4 離體皮膚的制備

取健康新西蘭大白兔（體質量2.5～3.0 kg），剪去耳背部的毛。以過量乙醚麻醉致死后，取下耳背部的皮膚，除去皮下組織，洗凈，在生理鹽水中浸泡后展平，夾在兩玻璃板間，塑料袋密封包裝后置于冰箱低溫保存，備用。

2.5 離體皮膚滲透

2.5.1 實驗過程 采用Franz 擴散池進行實驗[12]。取冰凍兔耳耳背皮膚，室溫放置解凍，剪取合適大小（約1.4 cm×1.4 cm）的正方形皮膚樣品，適當拉力下展平，固定于供給池與接收池的磨口對接處，角質層面向供給池，有效滲透面積為0.785 cm2（按擴散池內口直徑1.00 cm 計算得到）。

分別將成品INT 脂質體凝膠劑0.25 g、優化脂質體混懸液0.15 g 與INT 普通凝膠劑0.25 g 均勻地涂布于皮膚角質層上，實驗中供給池保持非封閉狀態。接收池中加入6.0 mL 生理鹽水（用煮沸適當時間放冷后的蒸餾水配制）作為接收液，37 ℃恒溫水浴浸沒接收池，400 r/min 定速攪拌接收液，于15、30、60、120、180、240、360、480、600、720 min從接收液中取樣0.25 mL，同時向接收池中補加等量同溫的生理鹽水。

從所取樣品液中吸取20 μL 進樣，HPLC 測定其中藥物濃度。考慮取樣藥物損失，計算各時間點的累積藥物透過量，將透過量對時間作圖，由透過量曲線后段的直線部分求算藥物穩態滲透速率。每個樣品平行測定4 份。不同理化參數的4 份脂質體樣品同上法測定，投藥量均為0.15 g。

2.5.2 實驗結果 不同樣品中INT 透過皮膚的穩態滲透速率見表3，由于所有樣品中藥物滲透速率均較小，因此測量值的相對誤差均較大，再加上皮膚本身的差異，所以表中的數據波動較大。從表中可以看出，這些樣品總的特征是透過量小，其中脂質體凝膠劑的穩態滲透速率為（1.863±1.668）μg/(h·cm2)，證明它具有減毒的特性。

表3 不同樣品中INT 的穩態滲透速率 (±s, n = 4)Table 3 Steady state permeation rate of INT in different samples (±s, n = 4)

表3 不同樣品中INT 的穩態滲透速率 (±s, n = 4)Table 3 Steady state permeation rate of INT in different samples (±s, n = 4)

樣品名稱 穩態滲透速率/(μg·h-1·cm-2)脂質體凝膠劑 1.863±1.668優化脂質體 12.753±15.504普通凝膠劑 0.340±0.388脂質體樣品1 0.825±0.591脂質體樣品2 9.994±10.204脂質體樣品3 4.689±4.380脂質體樣品4 6.504±3.143

比較表3 中的數據可以發現，穩態滲透速率上存在大小關系如下：優化脂質體＞脂質體凝膠劑＞普通凝膠劑［經方差分析，F＝2.26＜F1-0.05(2,9)＝4.26，無顯著性差異］；不同理化參數的脂質體的透過速率之間的大小關系如下：樣品2＞樣品4＞樣品3＞樣品1［經方差分析，F＝1.75＜F1-0.05(3,12)＝3.49，無顯著性差異］。

2.6 離體皮膚滯留

2.6.1 實驗過程 同“2.5.1”項下操作，720 min 后從擴散池之間取下皮膚，將皮膚表面殘存的藥物用水清洗掉，用吸水紙吸干皮膚表面。將皮膚展平于玻璃板上，將有效擴散皮膚部分切成同樣大小的兩半，其中一半用透明膠帶在角質層側粘貼并剝離30次以去除皮膚的角質層[15]，將兩半皮膚分別按“2.3”項下方法測定INT 含量。每個樣品平行測定4 份。

2.6.2 不同樣品中INT 的皮膚滯留 不同樣品應用后皮膚中INT 的滯留量測定結果見表4，去角質層的皮膚中的滯留量測定結果見表5，根據以上數據，進一步求得角質層藥物滯留量占全皮中藥物滯留量的百分比，結果見表6。

表4 不同樣品應用12 h 后全皮膚中INT 的滯留量 (±s,n = 4)Table 4 Deposited amount of INT in whole skin 12 h after application of different samples (±s, n = 4)

表4 不同樣品應用12 h 后全皮膚中INT 的滯留量 (±s,n = 4)Table 4 Deposited amount of INT in whole skin 12 h after application of different samples (±s, n = 4)

與優化脂質體比較：*P＜0.05 ****P＜0.000 1；與脂質體樣品1 比較：##P＜0.01*P ＜ 0.05 ****P ＜ 0.000 1 vs optimized liposome; ##P ＜ 0.01 vs liposome sample 1

樣品名稱 滯留量/(μg·cm-2)脂質體凝膠劑 35.99±8.35*優化脂質體 53.35±8.88普通凝膠劑 20.61±5.06****脂質體樣品1 33.50±9.03脂質體樣品2 58.40±9.35##脂質體樣品3 47.56±8.08脂質體樣品4 49.05±8.52

表5 不同樣品應用12 h 后角質層下皮膚中INT 的滯留量(±s, n = 4)Table 5 Deposited amount of INT in skin beneath stratum corneum 12 h after application of different samples (±s,n = 4)

表5 不同樣品應用12 h 后角質層下皮膚中INT 的滯留量(±s, n = 4)Table 5 Deposited amount of INT in skin beneath stratum corneum 12 h after application of different samples (±s,n = 4)

與優化脂質體比較：**P＜0.01**P ＜ 0.01 vs optimized liposomes

樣品名稱 滯留量/(μg·cm-2)脂質體凝膠劑 14.373±3.079優化脂質體 21.146±5.066普通凝膠劑 8.334±2.915**脂質體樣品1 12.766±4.412脂質體樣品2 19.580±3.990脂質體樣品3 16.102±5.402脂質體樣品4 15.770±3.714

表6 不同樣品應用12 h 后在角質層中INT 的滯留量占全皮的百分比 (±s, n = 4)Table 6 Percentage of deposited amount of INT in stratum corneum to that in whole skin 12 h after application of different samples (±s, n = 4)

表6 不同樣品應用12 h 后在角質層中INT 的滯留量占全皮的百分比 (±s, n = 4)Table 6 Percentage of deposited amount of INT in stratum corneum to that in whole skin 12 h after application of different samples (±s, n = 4)

樣品名稱 占比/%脂質體凝膠劑 59.37±6.99優化脂質體 58.87±15.90普通凝膠劑 60.45±6.84脂質體樣品1 61.32±13.27脂質體樣品2 66.11±7.46脂質體樣品3 66.80±5.73脂質體樣品4 67.85±5.46

由表4 可以看出，不同制劑應用12 h 后皮膚中滯留量的大小關系如下：優化脂質體混懸液＞脂質體凝膠劑＞普通凝膠劑（2.59∶1.75∶1）。對表4 中制劑①脂質體凝膠劑、制劑②優化脂質體混懸液與制劑③普通凝膠劑應用后皮膚中藥物滯留量進行方差分析，結果表明，不同制劑對藥物皮膚滯留量有極顯著的影響［F＝18.48＞F1-0.01(2,9)＝8.02］。兩兩間多重比較的結果表明，制劑②與③之間有極顯著性差異（P＜0.000 1，q1-0.01＝5.43），①與②之間有顯著性差異（P＜0.05，q1-0.05＝3.95），①與③之間無顯著性差異。另外，對表4 中脂質體樣品1～4 應用12 h 后皮膚中的藥物滯留量進行方差分析，結果表明，脂質體理化參數不同對藥物皮膚滯留量有顯著的影響［F＝5.51＞F1-0.05(3,12)＝3.49］。兩兩間多重比較的結果表明，樣品1 與2 之間有極顯著性差異（P＜0.01，q1-0.01＝5.50），其余兩兩之間均無顯著性差異（P＞0.05，q1-0.05＝4.20）。樣品2 為經過pH 值主動載藥的大粒徑脂質體，包封率最高，上述實驗結果證明高包封率脂質體有利于INT 的皮膚轉運。

從表5 可以看出，不同制劑皮膚應用12 h 后，在角質層下皮膚中的滯留量的大小關系如下：優化脂質體混懸液＞脂質體凝膠劑＞普通凝膠劑（2.54∶1.72∶1）。對表5 中制劑①脂質體凝膠劑、制劑②優化脂質體混懸液與制劑③普通凝膠劑應用12 h 后角質層下皮膚中的藥物滯留量進行方差分析，結果表明，不同制劑對角質層以下皮膚中藥物滯留量有極顯著的影響［F＝11.30＞F1-0.01(2,9)＝8.02］。兩兩間多重比較的結果表明，制劑①與②，①與③之間均無顯著性差異（P＞0.05，q1-0.05＝3.95）；②與③之間有極顯著性差異（P＜0.01，q1-0.01＝5.43）。對比表4 與表5 中還可以看出，3 種制劑應用后在角質層下皮膚中的滯留量的大小比例關系與在全皮中滯留量的大小比例關系基本一致。

對表6 中制劑①脂質體凝膠劑、制劑②優化脂質體混懸液與制劑③普通凝膠劑應用12 h后角質層藥物滯留量占全皮中藥物滯留量的百分數進行方差分析，結果表明，不同制劑對角質層藥物滯留量占全皮中的百分比均無顯著性影響［F＝0.024＜＜F1-0.05(2,9)＝4.26］。占比均在60%左右，表明進入皮膚的藥物在角質層中的分布較下層皮膚多一些。

3 討論

本實驗建立了一種皮膚中INT 含量測定的HPLC 方法，該法準確，精密。測定中皮膚前處理采用物理研磨法進行皮膚勻漿，而未使用強烈腐蝕性的化學物質（如高氯酸[13]等），有利于待測成分的穩定。多數報道表明，實驗動物中家兔皮膚的滲透性最大，故很難作為藥物人體透皮吸收預測的模型，而正是由于吸收快的性質，家兔可以用來指示藥物的皮膚毒性[14]。故本實驗采用家兔皮膚作為滲透試驗皮膚。此外，有文獻報道[15]用硫化鈉溶液處理皮膚以脫去皮膚上的毛，但硫化鈉可能對皮膚結構產生影響，故本實驗未采用。

離體皮膚滲透實驗的結果表明，普通凝膠劑、脂質體與脂質體凝膠劑的皮膚透過量均較小，透過速率上大小關系為優化脂質體＞脂質體凝膠劑＞普通凝膠劑；不同理化參數的脂質體的透過速率之間的大小關系為pH 值梯度載藥的大粒徑脂質體＞pH值梯度載藥的小粒徑脂質體＞未經pH 值梯度載藥的小粒徑脂質體＞未經pH 值梯度載藥的大粒徑脂質體。

由此可以推測，脂質體對藥物透過皮膚的轉運有一定促進作用，而這種作用的前提是脂質體與皮膚直接接觸，故脂質體混懸液的藥物滲透速率最大，脂質體凝膠劑中由于凝膠限制了脂質體與皮膚的相互作用，所以藥物轉運速率明顯下降，而普通凝膠劑缺乏這種作用，故藥物滲透速率最小。按照透析袋中釋放實驗的結果，凝膠劑與脂質體凝膠劑藥物釋放較快，可以推測，兩者應用于皮膚后可以在皮膚表面產生較高的游離藥物濃度，而脂質體混懸液在皮膚表面產生的游離藥物濃度較低[9]，然而，離體皮膚滲透的結果卻表明前兩者藥物皮膚滲透速率較脂質體混懸液明顯低，由此進一步證明了脂質體對藥物轉運的促進作用。

關于脂質體促進藥物皮膚轉運有如下4 種可能的機制[16-27]。第一，通過脂質體的脂質雙分子層與皮膚脂質融合直接將脂質雙分子層中的藥物轉運到皮膚，第二，藥物由脂質體的脂質雙分子層分配到皮膚角質層脂質，第三，脂質體擾亂皮膚角質層中的脂質的有序排列使游離藥物的皮膚滲透增加，第四，脂質體以整體的形式進入皮膚來實現藥物的皮膚轉運。大量的研究[17-18,20,25-26]已將第4 種機制否定，即，膠態脂質體不能進入完整的皮膚。對照優化脂質體、脂質體凝膠劑、普通凝膠劑的皮膚滲透速率，不能對INT 脂質體促進藥物皮膚轉運的機制作出明確的推測，可能是前3 種機制兼有或其中某1 種或2 種。對比不同理化參數的脂質體的透過速率可以看出，進行pH 值梯度載藥的脂質體的透過速率較大，其中大粒徑的脂質體較小粒徑的脂質體透過速率大。因為提高外水相pH 值之后，藥物包封率提高；大粒徑脂質體因為包封體積大，所以包封率高，這2 點都有利于增加通過脂質體與皮膚相互作用提高的藥物進入皮膚的量，這一結果進一步支持了脂質體促進藥物皮膚轉運的結論，同時可以探明其機制主要為前2 種，因為如果是第3 種機制，藥物皮膚轉運量與脂質體的藥物包封率不會有很大關系。

由表4 可知，不同制劑應用12 h 以后皮膚藥物滯留量的大小關系如下：優化脂質體＞脂質體凝膠劑＞普通凝膠劑（2.59∶1.75∶1）。由此推斷，通過脂質體與皮膚的相互作用可以促進藥物進入皮膚，然而，凝膠在一定程度上阻礙脂質體與皮膚的相互作用的發生，從而減小了脂質體促進藥物進入皮膚的作用。但是，從實際制劑應用的方便和制劑的穩定性方面考慮，脂質體凝膠劑是有利的。使用體溫溶膠化的凝膠或者觸變膠有望將單純脂質體在皮膚滯留方面的優勢與脂質體凝膠劑在應用方便、提高脂質體穩定性等方面的優勢集中在一起。

由表5 可知，不同制劑皮膚應用12 h 后，在角質層以下皮膚中的滯留量的大小關系如下：優化脂質體＞脂質體凝膠劑＞普通凝膠劑（2.54∶1.72∶1）。3 種制劑應用后在角質層以下皮膚中的滯留量的大小比例關系與在全皮中滯留量的大小比例關系基本一致，并且，角質層藥物滯留量占全皮中藥物滯留量的百分數無顯著差異，均在60%左右，由此推斷，脂質體的皮膚藥物轉運機制是角質層與脂質體的脂質之間直接分配，而不是脂質融合，因為如果有融合機制存在，脂質體應用后的皮膚角質層的藥物濃度會顯著增大，上述比例關系的一致性就不大可能了。因此，脂質體與皮膚的相互作用僅局限于皮膚的角質層的表面，進入角質層的藥物向皮膚更深層次的轉運完全與藥物自身的性質有關，而與脂質體無關。此外，對表5 中脂質體樣品1～4 應用12 h 以后角質層以下皮膚中的藥物滯留量進行方差分析，結果表明，脂質體理化參數不同對角質層以下皮膚藥物滯留量無顯著性的影響［F＝1.59＜＜F1-0.05(3,12)＝3.49］。按上述進入角質層的藥物向皮膚更深層轉運為自主過程，僅與藥物本身性質有關，所以根據不同理化性質的脂質體應用后在全皮中的滯留量不同，可以推斷在角質層下皮膚中的滯留量也是不同，但是由于這一層中藥物滯留量較小，所以統計結果未顯現顯著性差異。

樣品2 為經過pH 值主動載藥的大粒徑脂質體，包封率最高，上述實驗結果證明這種脂質體最有利于INT 的皮膚轉運。前面已有推斷，脂質體與皮膚之間的直接藥物分配是INT 脂質體促進藥物進入皮膚的機制，包封率高的脂質體可以將更多的藥物運送到角質層也支持了這一推斷。其他，1 號樣為未進行pH 值梯度載藥的大粒徑脂質體，由于包封率低，皮膚藥物滯留量明顯較少；3 號樣為未進行pH值梯度載藥的小粒徑脂質體，包封率也較低，但其皮膚滯留量較1 號樣有所增加，這可能是因為小粒徑脂質體在促進藥物進入皮膚方面存在著其他的機制（如通過毛囊轉運）；4 號樣為經過pH 值梯度載藥的小粒徑脂質體，由于包封容積小，有藥物結晶存在，該樣品產生相對較高的皮膚滯留量一方面可能是因為單獨脂質體上載藥量較高（脂質體內、外水相藥物濃度均已達到飽和），另一方面可能也是由于其他機制的存在。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突