超聲波輔助提取黃粉蟲中黃酮類物質的工藝優化及黃酮類物質的穩定性

楊盛茹　侯銀臣　張秋雙　潘春梅　李亞博　田腴澍　韓檀楚

摘要： 以黃粉蟲為原料，乙醇為提取劑，黃粉蟲中黃酮類物質的提取率為指標， 采用超聲波輔助-水浴加熱的方法，在單因素（液料比、提取溫度、提取時間、超聲波功率和乙醇體積分數）試驗的基礎上設計響應面試驗進行工藝優化，在不同條件（光照、溫度、pH值、添加強氧化劑、添加還原劑和添加食品添加劑）下分析其穩定性。結果表明，黃粉蟲中黃酮類物質最佳提取條件為：液料比50∶1（ml/g），提取溫度60 ℃，提取時間41 min，超聲波功率400 W，乙醇體積分數76%， 在該工藝條件下黃酮類物質的提取率為0.563 3%。穩定性分析結果表明，黃粉蟲中的黃酮類物質受光照的影響較為明顯，在過酸或過堿條件下會分解，在低含量（質量分數≤0.25%）強氧化劑作用下，黃酮類物質的穩定性良好，在一定范圍內，還原劑亞硫酸鈉與食品添加劑對其穩定性的影響不明顯。研究結果可為黃粉蟲中黃酮資源的開發提供理論依據。

關鍵詞： 黃粉蟲；黃酮類物質；超聲波輔助；穩定性

中圖分類號： S899.9 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）01-0229-09

Study on optimization of ultrasonic assisted extraction process and stability of flavonoids from Tenebrio molitor

YANG Sheng-ru¹， HOU Yin-chen¹， ZHANG Qiu-shuang²， PAN Chun-mei¹， LI Ya-bo¹， TIAN Yu-shu¹，HAN Tan-chu¹

（1.College of Food and Bioengineering Engineering， Henan University of Animal Husbandry and Economy， Zhengzhou 450046， China;2.Henan Province Institute of Veterinary Drug and Feed Control， Zhengzhou 450001， China）

Abstract： Using Tenebrio molitor as raw material， ethanol as extraction agent， the extraction rate of flavonoids in Tenebrio molitor as index， the ultrasonic auxiliary-water bath heating method was adopted. Based on the single factor （liquid-to-material ratio， extraction temperature， extraction time， ultrasonic power and ethanol concentration） experiments， the response surface test was designed to optimize the process. Its stability was analyzed under different conditions （light， temperature， pH， strong oxidants， reducing agents and food additives）. The optimal extraction conditions for flavonoids in mealworm were as follows： liquid-to-material ratio was 50∶1 （ml/g）， extraction temperature was 60 ℃， extraction time was 41 min， ultrasonic power was 400 W， ethanol concentration was 76%. Under these conditions， the extraction rate of flavonoids was 0.563 3%. The results of stability analysis showed that the flavonoids in mealworm were more obviously affected by light， and would decompose under the condition of acid or alkali. Under the action of strong oxidant with low content （≤0.25%）， the stability of flavonoids was good. In a certain range， the effect of reducing agent sodium sulfite and food additives on its stability was not obvious. These results can provide a theoretical basis for the development of flavonoid resources in Tenebrio molitor.

Key words： Tenebrio molitor;flavonoids;ultrasonic assistance;stability

黃酮是自然界中的多酚類化合物，具有抗癌、抗氧化、抑制病菌、降血糖等功效^[1-3]。黃酮類物質分布于高等植物的根、莖、葉、花和果實中^[4-5]，也可由微生物合成^[6]，同時也存在于一些低等植物與昆蟲中。黃粉蟲又叫面包蟲，被廣泛用于制作動物、鳥類、魚的飼料^[7-8]。黃粉蟲屬于食源性昆蟲，其價格低廉，易養殖，繁殖速度快，研究黃粉蟲中的黃酮類物質，可為昆蟲中黃酮類資源的開發提供理論基礎。

目前，國內外對植物中黃酮類物質的研究較多^[9-12]，對昆蟲中黃酮類物質的研究較少，如孫宇辰等^[13]采用甲醇、乙醇、丙酮3種提取劑提取美洲大蠊、中華稻蝗、芫菁3種昆蟲中的黃酮類物質并用其進行了抑菌性測定。傳統的黃酮類物質提取方法是以乙醇作為提取劑，采用回流法提取，對溶劑的需求量較大且效率較低，但是長時間高溫對黃酮類物質的生物活性有不良影響^[14]。近年來，用超聲波輔助法提取植物中的營養成分表現出顯著效果，通過超聲波的機械作用、空化作用及水浴加熱處理能夠彌補傳統提取方法的不足且效率較高。由于目前對于昆蟲中黃酮類物質的研究不多，故本研究使用超聲波輔助-水浴加熱處理，以乙醇溶液作為提取劑提取黃粉蟲中的黃酮類物質，以提取率為指標，在單因素試驗的基礎上設計響應面試驗進行工藝優化，確定最佳提取參數，通過分析不同光照條件、溫度、pH值與添加強氧化劑、還原劑和食品添加劑等條件下提取液中黃酮類物質的穩定性，以期為黃粉蟲活性物質的應用研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃粉蟲，購自愛家寵物水族用品有限公司；蕓香苷（純度≥98%），購自衛輝市眾誠消毒劑有限公司；水楊酸鈉（分析純），購自天津市恒興化學試劑制造有限公司；無水氯化鈣（分析純），購自天津市天力化學試劑有限公司；亞硝酸鈉（分析純），購自天津市天力化學試劑有限公司；硝酸鋁（分析純），購自煙臺市雙雙化工有限公司；硫酸亞鐵（分析純），購自煙臺市雙雙化工有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1900PC雙光束紫外可見分光光度計，購自上海美析儀器有限公司；FA224電子分析天平，購自上海舜宇恒平科學儀器有限公司；Phs-2F pH計，購自上海儀電科學儀器股份有限公司；TG16-WS離心機，購自河南湘儀實驗室儀器開發有限公司；KQ5200E超聲波清洗器，購自寧波新芝生物科技股份有限公司；800Y多功能粉碎機，購自永康市鉑歐五金制品有限公司；HH6數顯恒溫水浴鍋，購自方科儀器（常州）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理 將干燥的黃粉蟲粉碎后用石油醚脫脂，液料比設為8∶1（ml/g），脫脂時間設為4 h，脫脂溫度設為45 ℃。完成脫脂后靜置、分離，將剩余的黃粉蟲粉末干燥、過篩（80目）后低溫保存備用。

1.3.2 黃粉蟲中黃酮類物質的提取 稱取1.0 g脫脂黃粉蟲樣品于錐形瓶中，加入提取劑密封，隨后將錐形瓶放入超聲波儀中央并固定，設置不同的提取條件。

1.3.3 黃粉蟲中黃酮類物質測定波長的確定 取0.2 mg/ml蕓香苷標準溶液并稀釋5倍，取5 ml稀釋液，用堿性顯色法進行顯色，搖勻后反應15 min，設置波長為400～700 nm進行光譜掃描^[15]。

取5.0 g脫脂黃粉蟲樣品于三角瓶中，隨后加入100 ml提取劑，設置提取溫度為60 ℃，提取功率為400 W，超聲波處理時間為40 min，過濾后取5 ml上清液于試管中，用堿性顯色法進行顯色，搖勻后反應15 min，在400～700 nm波長處進行光譜掃描。

1.3.4 黃粉蟲中黃酮類物質含量的測定 蕓香苷標準溶液的配制：參考汪璇等^[16]的方法稱取適量蕓香苷樣品，用80%乙醇溶解后配制一系列濃度的標準溶液，取5 ml標準溶液用堿性顯色法進行顯色，于510 nm處測定吸光度。

樣液中黃酮類物質含量的測定。取5 ml定容后的黃酮類物質提取液，使其顯色后于510 nm處測定吸光度。黃酮類物質提取率（T）的計算公式如下：

T=c×V×n×1 000/m×100%

式中：c為黃酮提取液質量濃度（mg/ml）；V為黃酮提取液的體積（ml）；n為稀釋倍數；m為脫脂樣品質量（g）。

1.4 黃粉蟲中黃酮類物質提取的單因素試驗

稱取1.0 g脫脂黃粉蟲樣品于錐形瓶中，重復5次，在不同液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1，ml/g）下加入不同體積分數（70%、75%、80％、85%、90%）乙醇溶液，在不同溫度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃）、不同超聲波功率（300 W、350 W、400 W、450 W、500 W）下分別提取10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，每隔10 min振蕩1次錐形瓶，直至物料與提取劑混合均勻，過濾并取上清液定容至100 ml。取5 ml定容后的溶液，用堿性顯色法使黃酮類物質顯色后測定510 nm處的吸光度，研究不同提取因素對黃粉蟲中黃酮類物質提取率的影響。

1.5 響應面試驗

以黃酮類物質提取率為響應值，在單因素試驗結果的基礎上選取對黃酮類物質提取率影響顯著的因素，設計響應面試驗優化工藝參數，因素與水平的設置見表1。

1.6 黃粉蟲中黃酮類物質的穩定性

1.6.1 光照時間對黃粉蟲中黃酮類物質穩定性的影響 取100 ml潔凈的容量瓶，向其中加入黃酮類物質提取液至刻度處，分別在室內光、室外自然光及室內避光環境下放置，連續6 d每天各取5 ml提取液，測定其在510 nm處的吸光度。

1.6.2 溫度對黃粉蟲中黃酮類物質穩定性的影響 取9支潔凈試管，加入10 ml黃酮類物質提取液，封口后分別置于20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃水浴鍋中避光放置1 h，取出后用80%乙醇溶液定容至10 ml，各取5 ml待測。

1.6.3 酸堿度對黃粉蟲中黃酮類物質穩定性的影響 取6個潔凈的錐形瓶（容量為25 ml），各加入10 ml黃酮類物質提取液，調節pH值為1、3、5、7、9、11，在室溫下避光放置1 h，各取5 ml待測。

1.6.4 強氧化劑H₂O₂對黃粉蟲中黃酮類物質穩定性的影響 分別配制質量分數0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的H₂O₂溶液。取6支潔凈的試管，分別加入10 ml黃酮類物質提取液，再加入1 ml不同質量分數的過氧化氫溶液，搖勻，室溫避光1 h后各取5 ml待測。

1.6.5 還原物對黃粉蟲中黃酮類物質穩定性的影響 分別配制質量分數為0、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的Na₂SO₃溶液。取6支潔凈試管，各加入10 ml提取液，再分別加入1 ml不同質量分數的Na₂SO₃溶液，搖勻，避光靜置1 h后，各取5 ml待測。

1.6.6 食品添加劑對黃粉蟲中黃酮類物質穩定性的影響 分別配制質量分數為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的蔗糖、葡萄糖溶液及質量分數為0、0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%的山梨酸鉀、苯甲酸鈉溶液，取24支潔凈的試管，分別加入10 ml提取液，再分別向每6支試管中各加入1 ml上述配制好的不同質量分數的蔗糖溶液、葡萄糖溶液、山梨酸鉀溶液、苯甲酸鈉溶液，搖勻后避光反應1 h，各取5 ml待測。

1.7 數據處理與分析

用Excel 2013整理數據，用Origin 8.0、Design Expert 8.0、IBM SPSS Statistics 26.0作圖及進行統計分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 黃粉蟲中黃酮類物質檢測波長的確定

由圖1可知，蕓香苷標準溶液、黃酮類物質提取液在510 nm處均出現吸收峰，可以確定提取液中含有黃酮類物質，因此檢測波長設為510 nm。

2.2 蕓香苷標準曲線

按照繪制蕓香苷標準曲線的方法，配制一系列濃度梯度的蕓香苷標準溶液，用堿性顯色法使其顯色，測得OD₅10為0.019、0.443、0.679、0.939、1.171。以蕓香苷標準溶液濃度為橫坐標（x）、吸光度為縱坐標（Y）繪制標準曲線，此標準曲線的線性回歸方程為Y=11.910 0x-0.024 8，R²=0.998 5，線性關系良好。

2.3 單因素試驗結果與分析

2.3.1 液料比對黃粉蟲中黃酮類物質提取率的影響 由圖2可知，在超聲波作用下，隨著乙醇體積增加，黃酮類物質的提取率先升高后降低。適當的液料比有利于細胞破碎和胞內物質的釋放^[17]，當液料比為50∶1（ml/g）時，黃酮類物質的溶出量達到最大值，當黃酮類物質溶出達到平衡狀態時，溶出量不再增加。繼續增大提取劑體積會使溶劑分子與黃酮類物質分子運動提前達到平衡，最終使提取液中的黃酮類物質含量減少。提高液料比會浪費溶劑，增加成本，經單因素方差分析，確定最佳提取液料比為50∶1（ml/g）。

2.3.2 提取溫度對黃粉蟲中黃酮類物質提取率的影響 由圖3可知，當溫度為40～60 ℃時，隨著溫度升高，黃酮類物質的提取率整體表現為上升趨勢，當溫度高于60 ℃時，黃酮類物質的溶出量逐漸減少，可能是在一定溫度范圍內黃酮類物質分子隨著溫度升高表現出運動逐漸加劇，使得溶出量增加，但是當溫度過高時，會破壞黃酮類物質的分子結構，影響其穩定性，同時高溫條件下其他醇溶性物質更易溶出，從而影響黃酮類物質的含量^[18-19]。單因素方差分析結果說明，溫度對黃酮類物質提取率的影響不顯著（P=0.057＞0.05）。

2.3.3 超聲波提取時間對黃粉蟲中黃酮類物質提取率的影響 由圖4可知，當超聲波處理時間為10～50 min時，黃粉蟲中黃酮類物質的提取率先升高后降低。可能由于當提取時間較短時，大量黃酮類物質未及時溶出，當提取時間達到40 min時，由于超聲波產生的劇烈振動使黃粉蟲表面物質被破壞，黃酮類物質加速溶出，提取率上升；但在超聲波作用下，提取時間較長會導致多糖等雜質溶出、黃酮類物質降解^[20-21]，從而影響黃酮類物質提取率。經單因素試驗分析，確定最佳提取時間是40 min。

2.3.4 乙醇體積分數對黃粉蟲中黃酮類物質提取率的影響 由圖5可以看出，當乙醇體積分數為70%～90%時，黃粉蟲中黃酮類物質的提取率先升高后降低，以75%乙醇溶液作為提取劑時，黃粉蟲中黃酮類物質的溶出量最大。若乙醇體積分數過高，溶劑極性過大，會使醇溶性物質（如黃酮苷元）及脂溶性雜質（如色素）的溶出量增大^[22-23]，從而影響黃酮類物質在溶劑中的溶解，最終影響黃酮類物質的溶出量。經單因素方差分析，確定提取黃粉蟲中黃酮類物質的最佳乙醇體積分數為75%。

2.3.5 超聲波功率對黃粉蟲中黃酮類物質提取率的影響 由圖6可知，黃酮類物質提取率隨著超聲波功率的增加大致呈現先升高后降低的趨勢。隨著超聲波功率逐漸增大，超聲波對細胞的破碎作用增強，有利于黃酮類物質溶出^[24]。當超聲波功率大于400 W時，可能由于功率過高會影響黃酮類化合物的穩定性，從而使得提取率逐漸降低^[25]。經單因素方差分析，認為超聲波功率對黃酮類物質提取率的影響不顯著（P=0.11＞0.05）。

2.4 響應面試驗設計與結果

2.4.1 黃粉蟲中黃酮類物質提取率回歸模型的建立與分析 以黃粉蟲中黃酮類物質提取率為響應值，通過單因素試驗選取對提取率影響顯著的3個因素（液料比、提取時間、乙醇體積分數），設計3因素3水平響應面試驗，共設17個試驗點，試驗結果見表2。

使用響應面分析軟件，以液料比（A）、乙醇體積分數（B）、提取時間（C）為自變量，黃酮類物質提取率為因變量，通過響應面分析、二次多項擬合，得到預測模型如下：

黃酮類物質提取率=0.570 0+0.005 7A+0.038 0B+0.024 0C-0.026 0AB-0.018 0AC-0.021 0BC-0.110 0A²-0.084 0B²-0.083 0C²

由表3可知，回歸模型的P＜0.000 1，說明使用超聲波輔助提取黃粉蟲中黃酮類物質的回歸模型極顯著。失擬項P值為0.183 2，說明操作中出現的誤差在可控范圍，實際值與模擬值接近，差異不明顯。根據P值大小，推測對黃酮類物質提取率影響因素的顯著性表現為：乙醇體積分數影響最顯著，其次是提取時間，最后是液料比。

2.4.2 黃粉蟲中黃酮類物質提取率的響應面分析 在選取的3個因素中，固定1個因素，通過分析其余2個因素變化對黃粉蟲中黃酮類物質提取率的影響，得到的響應面圖可以直觀反映其余2個因素對提取率的影響，并且確定最佳提取條件范圍。

圖7中的a₁、b₁、c₁等高線圖呈橢圓形，等高線分布密集， 對應曲面較為陡峭， 說明液料比和乙醇體積分數、液料比和提取時間、提取時間和乙醇體積分數之間的交互作用明顯， 對響應值（黃酮類物質提取率）的影響顯著， 與表3內容一致。

2.4.3 最佳提取工藝參數的驗證 利用響應面分析試驗，得出影響黃粉蟲中黃酮類物質提取的3個因子對應的最佳提取工藝：液料比49.91∶1.00（ml/g），乙醇體積分數76%，超聲波提取時間41.16 min，通過響應面分析得到的預測提取率為0.570 6%。經綜合考慮，將最佳工藝條件修改為液料比50∶1（ml/g），乙醇體積分數76%，超聲波提取時間41 min。通過3次平行試驗，得到黃粉蟲中黃酮類物質的平均提取率為0.563 3%±0.050 0%，與模型計算值接近，表明響應面模型預測的準確性良好，該分析法可用于優化黃粉蟲中黃酮類物質的提取工藝優化。

2.5 黃粉蟲中黃酮類物質的穩定性

2.5.1 光照對黃粉蟲中黃酮類物質穩定性的影響 如圖8所示，日光對黃粉蟲中黃酮類物質穩定性的影響較大，經過6 d的光照，黃粉蟲中黃酮類物質明顯減少，可能由于日光中的紫外線等引起黃酮類物質的降解與異構化，導致黃酮類物質含量減少。室內自然光與避光條件對黃酮類物質的影響不是很明顯，但是室內自然光中可能存在少量紫外線，使得黃酮類物質發生變化，黃酮類化合物放置較長時間會引起降解，因此如果要較長時間保存黃酮類物質，應選擇避光條件。

a.乙醇體積分數與液料比;b.液料比與超聲波處理時間;c.超聲波處理時間與乙醇體積分數;下標1、2分別為響應面圖和等高線圖。

2.5.2 溫度對黃粉蟲中黃酮類物質穩定性的影響 由圖9可知，當溫度升高時，黃酮類化合物含量逐漸降低，在5 ℃避光冷藏時，提取液中的黃酮類物質相對于其他溫度都比較穩定。在加熱條件下，黃粉蟲中的黃酮類物質在20～60 ℃范圍相對較穩定，當溫度在80 ℃以上時，黃酮類物質含量減少的速度加快，可能由于溫度過高會使黃酮類物質的分解速度加快。由此可見，黃酮類物質在保存過程中應采用低溫條件，在加工過程中當溫度過高時應加入一定的保護劑。

2.5.3 pH值對黃粉蟲中黃酮類物質穩定性的影響 黃酮類物質中的苯環結構中含有酚羥基，通常情況下呈現弱酸性。由圖10可以看出，當pH值為6時，吸光度最大，黃酮類物質最穩定，在過酸或過堿條件下，溶液的黃色加深，吸光度降低，說明黃酮類物質含量下降得明顯，因此黃酮類物質在加工過程中應避免過酸或過堿條件，或者在加工過程中加入適當保護劑。

2.5.4 強氧化劑對黃粉蟲中黃酮類物質穩定性的影響 由圖11可以看出，加入H₂O₂后，黃酮類物質提取液的吸光度與對照相比略低，但是總體所受影響不大。在低質量分數H₂O₂溶液作用下，黃酮類物質依然很穩定，但是當H₂O₂質量分數過大時，黃酮類物質就會加速氧化，當H₂O₂質量分數小于0.25%時，黃酮類物質的抗氧化效果較好。黃粉蟲中的黃酮類物質在分離純化后經過進一步加工可以作為很好的抗氧化劑，但是黃酮類化合物在保存時應盡量避免接觸強氧化劑。

2.5.5 還原劑對黃粉蟲中黃酮類物質穩定性的影響 由圖12可以看出，隨著亞硫酸鈉質量分數的增加，黃酮類物質提取液的吸光度無明顯變化，說明黃粉蟲中的黃酮類物質在加工和存放過程中對還原劑具有良好的穩定性，受還原劑的影響不大。

2.5.6 食品添加劑對黃粉蟲中黃酮類物質穩定性的影響 由圖13可以看出，隨著食品添加劑葡萄糖、蔗糖質量分數的增加，黃粉蟲中黃酮類物質提取液的OD₅10變化不明顯，說明葡萄糖、蔗糖這2種甜味劑對黃酮類物質的穩定性影響不明顯，在食品加工過程中可以使用這2種甜味劑。由圖14可以看出，隨著防腐劑質量分數的增加，黃粉蟲中黃酮類物質提取液的OD₅10變化不大，說明山梨酸鉀、苯甲酸鈉對黃酮類物質的穩定性影響不大。由此可見，黃酮類物質在含食品添加劑的食品中可以穩定存在，即黃粉蟲中的黃酮類物質可以用于食品的深加工。

3 討論

超聲波輔助提取黃粉蟲中黃酮類物質主要是利用超聲波產生的強烈振動、粉碎和空化作用來破壞細胞結構，更易于將黃酮類物質提取到溶劑中，該方法具有簡單、高效等特點^[26-27]。在試驗范圍內，黃酮類物質提取率隨著超聲波功率、超聲波處理時間、乙醇體積分數的增加整體呈現出先升高后降低的趨勢，可能由于超聲波功率過大會破壞黃酮類化合物的結構^[25]，超聲波處理時間較長會造成多糖等雜質溶出^[20]，乙醇體積分數過高時會使醇溶性物質（如黃酮苷元）及脂溶性雜質（如色素）的溶出量增大^[22-23]，最終會影響黃酮類物質的提取率。田建華等^[28]從沙棘果渣中提取總黃酮，以乙醇為溶劑，以超聲波為輔助，發現超聲波功率、超聲波處理時間、乙醇體積分數等對總黃酮提取率的影響均呈現出相同的變化趨勢，但因原料不同，確定的工藝參數有區別。

日光、室內自然光可能由于紫外線使黃酮類物質降解與異構化，低溫條件下黃酮類物質比較穩定，在溫度為80 ℃以上時，分解加快，與秦生華等^[29]關于黃酮類物質對紫外線敏感、黃酮類物質應低溫保存的研究結果一致。pH值過高或過低均會影響黃酮類物質的穩定性，當pH值為6時，黃酮類物質最穩定，黃瓊等^[30]研究洛神花總黃酮時得出，在pH值為3.0～6.0其穩定性最好。葡萄糖與蔗糖，山梨酸鉀和苯甲酸鈉對黃酮類物質穩定性的影響不大，與馮靖等^[31]關于苯甲酸鈉、蔗糖對銀杏葉黃酮穩定性影響不大的研究結果一致。

4 結論

在單因素試驗基礎上， 通過響應面試驗優化得到黃粉蟲中黃酮類物質最佳提取條件為：液料比50∶1（ml/g）、提取溫度60 ℃、提取時間41 min、超聲波功率400 W、乙醇體積分數76%， 此時提取率為0.563 3%，與預測值接近。黃酮類物質的穩定性研究結果表明，光照、高溫、過酸、過堿與強氧化劑對黃酮類物質有一定影響，還原劑與食品添加劑在適用范圍內對黃粉蟲中黃酮類物質的穩定性影響不大。

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（責任編輯：徐 艷）