利用小RNA深度測序技術鑒定江蘇鹽城辣椒病毒種類

趙小慧　劉沖　郁凱　鐘明娟　鄭佳秋　邢錦城

摘要： 2019年6月江蘇省鹽城市發生了較為嚴重的辣椒病毒病，危害癥狀表現為植株重度矮化、葉片黃化、蕨葉甚至畸形。將采集的11株疑似感染病毒的辣椒植株葉片研磨成漿液，再用其摩擦接種本氏煙植株，發現用其中3株辣椒的葉片漿液摩擦接種本氏煙植株后，本氏煙植株出現病毒侵染的典型癥狀，初步判斷這些辣椒被病毒感染，但不能確定其種類和歸屬。為了進一步明確辣椒感染的病毒類型，將3株辣椒樣品混成2份樣品利用小RNA深度測序技術和生物信息學分析法進行檢測，結果發現樣品1被蠶豆萎蔫病毒2號（Broad bean wilt virus 2，BBWV2）、苜蓿花葉病毒（Alfalfa mosaic virus， AMV）和辣椒脈斑駁病毒（Chilli veinal mottle virus， ChiVMV）3種病毒復合侵染，從樣品2中檢測到BBWV2 1種病毒，通過RT-PCR檢測驗證了這一結果的可靠性。最后利用RT-PCR方法對田間采集的11份辣椒樣品和接種的本氏煙植株進行毒源鑒定，其中2株辣椒樣品及其接種的本氏煙葉片上鑒定出了BBWV2、ChiVMV和AMV，這3種病毒侵染辣椒在江蘇省均為首次發現。研究結果為對江蘇省辣椒構成潛在嚴重威脅的病毒的早期診斷和及時防控提供了參考。

關鍵詞： 辣椒；小RNA深度測序；病毒病

中圖分類號： S436.418.1⁺2 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）01-0037-07

Identification of viruses from peppers in Yancheng， Jiangsu province by small RNA deep sequencing

ZHAO Xiao-hui¹， LIU Chong¹， YU Kai¹， ZHONG Ming-juan²， ZHENG Jia-qiu¹， XING Jin-cheng¹

（1.Institute of Agricultural Sciences in the Coastal District of Jiangsu Province， Yancheng 224002， China;2.Zhucheng Agricultural and Rural Bureau， Zhucheng 262200， China）

Abstract： In June 2019， an incidence of relatively serious pepper virus disease was reported in Yancheng City， Jiangsu province. The symptoms included plant dwarf stature， yellowing and deformities of pepper leaves. Eleven strains collected from pepper leaves infected with suspected virus were inoculated into Nicotiana benthamiana leaves by surface rubbing and it was found that three strains of peppers had typical symptoms of virus infection after surface inoculation of N. benthamiana. It was preliminarily suggested that these peppers were infected by a virus with unknown identity. In order to further clarify the virus type， two samples obtained by mixing three pepper standard samples were detected by small RNA deep sequencing technology and bioinformatics analysis. It was found that sample 1 was co-infected by

broad bean wilt virus 2 （BBWV2）， alfalfa mosaic virus （AMV） and chilli veinal mottle virus （ChiVMV）. One virus of BBWV2 was detected in sample 2， and RT-PCR detection verified the reliability of the results. Finally， 11 pepper samples collected from the field and inoculated N. benthamiana were identified by RT-PCR. This is the first report of BBWV2， ChiVMV and AMV viruses infecting peppers in Jiangsu. The current study acts as a base line for early diagnosis and timely prevention and control of novel viral strains that pose a potential threat to peppers in Jiangsu province.

Key words： pepper;small RNA deep sequencing;viral disease

辣椒（Capsicum annum L．）是中國極為重要的一種蔬菜作物，其種植面積和產值在各類蔬菜中位列第一，是中國第一大蔬菜作物^[1]。辣椒病毒病是辣椒上常發生的災害性病害之一，其發病癥狀主要表現為辣椒植株整體矮化以及花葉、蕨葉、黃化、頂枯、壞死和畸形等，對辣椒生產造成了嚴重影響，通常情況下使產量損失30%～70%，嚴重時可致絕收^[2]。截至2022年4月，中國報道的自然侵染辣椒的植物病毒已有37種，包括黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、辣椒輕斑駁病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）、蠶豆萎蔫病毒2號（Broad bean wilt virus 2，BBWV2）在內的33種病毒^[3]以及煙草蝕紋病毒（Tobacco etch virus，TEV）^[4]、瓜類褪綠黃化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）^[5]、西瓜銀色斑駁病毒（Watermelon silver mottle virus，WSMoV）^[6]、小米椒內源RNA病毒1（Capsicum frutescens endornavirus 1，CFEV 1）^[7]。總體而言，雖然中國不同地區侵染辣椒的病毒種類各有差異，但CMV和TMV仍是目前全國范圍內辣椒上分布最廣且危害最重的病毒^[3，8]。近年來，隨著江蘇省辣椒種植面積的不斷擴大，病毒病的發生也愈發嚴重。目前，已有關于危害江蘇省辣椒的主要病毒種類、分布和復合侵染類型等的報道。吳淑華等^[9]采用RT-PCR檢測技術首次在江蘇南京的辣椒植株上發現了PMMoV；喬俊卿等^[10]在江蘇淮安的設施辣椒病樣上檢測到PMMoV和辣椒隱癥病毒（Pepper cryptic virus，PCV）；劉勇等^[3]采用血清學、分子生物學等檢測方法對中國31個省（市、自治區）主要蔬菜作物的病毒病樣品進行鑒定，發現PMMoV是危害江蘇辣椒生產的主要病毒；吳賀等^[5]采用RT-PCR方法在蘇南五地（市）的辣椒樣品上檢測出9種病毒，其中PMMoV的檢出率最高，番茄黃化曲葉病病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）的檢出率次之，兩者均是危害這些地區辣椒的主要病毒；于海龍等^[4]對中國16個省（市、自治區）的辣椒病樣進行血清學檢測，結果在江蘇省采集的1個辣椒樣品中鑒定出PMMoV、TMV和番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）3種病毒。由此可見，PMMoV為侵染江蘇省辣椒的優勢種，發生最為普遍，但在省內各地區，因耕作制度、種植品種及氣候環境等因素不同，辣椒上發現的病毒種類和危害程度也不同，這為江蘇省辣椒的安全生產帶來不少挑戰。

鹽城市地處蘇北沿海，光溫資源豐富，是江蘇省優質辣椒的生產基地。近年來，當地因辣椒連作導致病毒病頻發，嚴重損害了蘇北辣椒的產量、外觀品質和產業健康發展。因此，迫切需要對危害鹽城地區辣椒的病毒種類進行調查，為當地病毒病的防控和抗病育種提供指導。本研究采用生物學方法及小RNA深度測序結合RT-PCR驗證方法對侵染鹽城辣椒的病毒進行鑒定，以期為江蘇省辣椒病毒病的預防和綜合防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

于2019年6月從鹽城南洋試驗場的設施辣椒大棚中采集葉片表現為黃化、蕨葉、畸形等癥狀的疑似感染病毒病的辣椒樣品11株，在田間記錄品種編號和發病癥狀，采集病株后裝入自封袋中帶回實驗室，集中拍照后保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離物的摩擦接種 將辣椒葉片放入預冷消毒的研缽中，加入適量磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH7.5），用研棒充分研磨葉片成漿液；在待接種的5～6葉期本氏煙葉片上均勻噴灑600目的金剛砂，用研棒蘸取適量葉片漿液輕輕摩擦葉片，每株摩擦接種3張葉片（植株頂端葉不摩擦接種），以接種緩沖液作為對照；接種的本氏煙用噴壺在其葉片上噴水后置于光照培養箱中培養，3 d后開始觀察系統葉的發病癥狀。

1.2.2 小RNA深度測序 將在本氏煙上癥狀表現嚴重且復雜的3株辣椒樣品混成2份樣品后送至青島百邁客生物公司進行小RNA測序。參照TRIzol試劑盒（Invitrogen）的說明書提取2份樣品總RNA，用Nanodrop 2000對提取的RNA進行質量濃度和純度的測定，用Agilent 2100對RNA樣本進行完整性分析。當測定質量濃度≥250 ng/μl，體積≥10 μl，OD260/280≥1.8，OD260/230≥1.0，RIN值≥8.0時，認為樣品檢測合格，將檢測合格的樣品通過VAHTSTM small RNA Library Prep Kit for Illumina（諾唯贊，NR801-02）構建文庫，構建好的文庫再用Illumina novaseq 6000進行小RNA測序分析。

1.2.3 原始數據的處理與分析 除去含有接頭序列、低質量序列、短于18個或長于35個核苷酸的序列，獲得有效測序序列（Clean reads）；用Bowtie軟件將Clean reads分別與各數據庫中的序列進行比對，過濾核糖體RNA（rRNA）、轉運RNA（tRNA）、核內小RNA（snRNA）、核仁小RNA（snoRNA）等ncRNA及重復序列，剩余未比對到的小RNA（sRNA）通過velvet軟件進行拼接，獲得能組裝病毒RNA的較長重疊群（Contigs）；通過與病毒核苷酸數據庫、蛋白質數據庫進行BLAST比對，對獲得的Contigs進行分類注釋，以明確感染病毒的信息。

1.2.4 PCR/RT-PCR驗證 為了驗證小RNA深度測序結果的準確性，對于每種注釋的病毒，分別根據小RNA深度測序得到的拼接序列和GenBank中與拼接序列同源性最高的病毒基因序列的保守區域設計2對特異性引物。所有引物通過DNAman 7.0和DNAstar 5.01軟件設計，引物由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成。另外參照文獻[3]和[11]分別合成辣椒上常見的2種病毒（CMV和TMV）的2對特異性引物（表1）。分別按照植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen）和植物總RNA提取試劑盒（Foregene）的說明書提取用于小RNA深度測序的2份病樣葉片的總DNA、總RNA，以總RNA為模板，XT176（5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGA￣G￣T￣A￣C￣T￣T￣T￣T￣T￣T￣T￣T￣T￣TTTTTTTTT-3′）和XT269（5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGNNNNNN-3′，N=A/G/C/T）為引物，參照反轉錄酶M-MLV（Promega，USA）的說明書合成cDNA，以合成的cDNA和提取的DNA為模板，用上述設計的引物和Taq Plus DNA聚合酶[生工生物工程（上海）股份有限公司]進行PCR擴增。擴增結束后，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳擴增產物，在紫外燈下發現目的條帶后割膠回收，將回收的擴增片段連接到pMD19-T simple載體（TaKaRa）上，并用該載體轉化大腸桿菌DH5α感受態，之后選取3個經菌落PCR篩選到的陽性克隆，送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。獲得的序列用DNASTAR 5.0軟件的Seqman程序進行拼接處理，得到的擴增片段序列在美國國家生物技術信息中心（NCBI）網站中利用BLASTn檢索進行在線比對分析。最后依據RT-PCR擴增效果和序列比對結果驗證小RNA深度測序的準確性并篩選出用于檢測后續樣品中病毒的引物，進一步應用篩選出的引物對采集的所有辣椒病樣和接種的本氏煙進行RT-PCR檢測，根據檢測結果明確侵染江蘇鹽城辣椒的病毒類型。

2 結果與分析

2.1 田間辣椒發病情況

于2019年6月對江蘇鹽城南洋試驗場設施大棚內的辣椒進行病害調查，發現部分辣椒植株疑似感染病毒病，主要表現為植株整體矮小、上部葉輕度花葉或蕨葉，同時還有不同程度的黃化癥狀混發（圖1），采集的樣品信息見表2。

2.2 病毒分離物的摩擦接種

分別用采集的11株辣椒葉片漿液摩擦接種5～6葉期的指示植物本氏煙植株，對照用磷酸緩沖液接種，對接種后的本氏煙植株進行觀察并記錄癥狀。如圖2所示，3株辣椒葉片漿液接種后，本氏煙植株出現病毒侵染的典型癥狀，其中用辣椒品系19068-1、19068-3的葉片漿液接種本氏煙植株6 d后，葉片表現出輕微卷曲、花葉等癥狀，隨后出現黃綠相間的花葉、扭曲，嚴重的產生畸形，整個植株矮縮、黃化直至壞死；用辣椒品系19068-5的葉片漿液接種本氏煙植株6 d后，出現蕨葉、花葉等癥狀，之后癥狀加重，但是植株長勢良好；用其余樣品葉片漿液接種的本氏煙植株發病癥狀不明顯，而對照植株則生長正常。上述感病本氏煙植株的癥狀均由病毒病侵染造成，說明辣椒品系19068-1、19068-3和19068-5疑似被病毒感染，但是需要進一步分析來明確病毒的種類和來源。

2.3 小RNA深度測序結果分析

為了進一步確定危害鹽城地區辣椒的病毒類型，將上述3株疑似被病毒侵染的田間辣椒樣品混成2份樣品用于小RNA深度序列測定，其中19068-1、19068-3混為1份，編號為Pe-1，19068-5單獨為1份，編號為Pe-2。測序后從Pe-1中獲得14 032 995條原始測序序列 （Raw read），去除冗余測序序列（Read），得到12 298 498條Clean read，再過濾后剩余11 139 129條Read，對過濾后獲得的序列進行拼接，共得到1 829個Contig，對獲得的Contig進行分類注釋，結果發現Pe-1中包含BBWV2、苜蓿花葉病毒（Alfalfa mosaic virus，AMV）、辣椒脈斑駁病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）和煙草脈明病毒（Tobacco vein clearing virus，TVCV）等4種病毒。測序后從Pe-2中獲得18 076 432條Raw read，去除冗余Read后得到12 994 439條Clean read，再過濾后剩余10 713 241條Read，對過濾后獲得的序列進行拼接，共得到2 847個Contig，對獲得的Contig進行分類注釋，結果發現Pe-2中包含BBWV2、蠶豆萎蔫病毒1號（Broad bean wilt virus 1，BBWV1）、甘薯明脈病毒（Sweet potato vein clearing virus，SPVCV）等3種病毒。上述注釋的病毒中，SPVCV為環狀DNA病毒，其余病毒為RNA病毒。測序的具體結果見表3。

2.4 PCR/RT-PCR驗證和檢測

為了驗證小RNA深度測序結果的準確性，以用于小RNA深度測序的2份辣椒病樣葉片DNA/RNA為模板，用方法1.2.4設計的引物分別對注釋到的SPVCV病毒進行PCR驗證，對其余病毒進行RT-PCR驗證。結果顯示，3種注釋到的病毒（BBWV2、ChiVMV和AMV）均篩選到1對特異性較好的引物（表1），且在相應的辣椒樣品中擴增到了預期大小的條帶（圖3）。將得到的目的條帶回收純化、克隆測序后進行序列比對分析，發現從樣品Pe-1、Pe-2中擴增的BBWV2片段的核苷酸序列完全一致，兩者與NCBI中BBWV2分離物XJ14-3（登錄號：FN985164.1）的核苷酸序列一致性最高，為94.49%；從樣品Pe-1中擴增的ChiVMV核苷酸序列與NCBI中ChiVMV分離物Korea（登錄號：AM909717.1）具有最高的核苷酸序列相似度（97.39%）；而從Pe-1樣品中擴增得到的AMV核苷酸序列與AMV分離物ER1（登錄號：KX579896.2）的核苷酸序列相似度也高達98.32%。以上結果說明，Pe-1樣品中存在BBWV2、ChiVMV和AMV 3種病毒，Pe-2樣品中存在BBWV2 1種病毒，BBWV2、ChiVMV和AMV侵染辣椒均為江蘇省首次報道。在小RNA深度測序注釋到的病毒中，有3種病毒TVCV、BBWV1和SPVCV未通過PCR/RT-PCR驗證，推測由于病樣中這些病毒的豐度過低或是在處理數據過程中因缺少相關信息而造成結果匹配度差，從而影響檢測效果。另外，在2份辣椒病樣中也未檢測到辣椒上常見的TMV、CMV 2種病毒，此結果進一步說明RT-PCR驗證結果與小RNA深度測序結果存在一致性。

為確定田間采集的11株辣椒樣品和實驗室接種本氏煙上攜帶病毒的情況，用上述篩選得出的擴增3種病毒效果較好的引物及TMV、CMV特異性引物對上述樣品進行RT-PCR 檢測。結果顯示，辣椒品系19068-5確實被BBWV2單獨侵染，19068-1、19068-3均被BBWV2、ChiVMV和AMV復合侵染，其余樣品中未檢測到病毒（表4）。此外，接種的本氏煙植株病葉上均擴增到相應片段，表明接種上述辣椒病樣葉片漿液后，本氏煙植株上也存在相應的病毒。

3 討論

辣椒作為中國一種重要的蔬菜作物，極易受到病毒感染。目前用于檢測和鑒定辣椒病毒病的方法有很多，常規的主要包括生物學檢測^[12]、電鏡觀察檢測^[13-14]、血清學檢測^{[2，4，15-18]}和分子生物學檢測^[19-21]等，這些方法都在辣椒病毒種類鑒定方面得以成功應用，但是在發現未知病毒方面還存在一定局限性。新興的小RNA深度測序技術豐富了病毒種類的鑒定方法，它可以同時檢測出多種RNA或DNA病毒，還能發掘新的病毒種類，已被廣泛用于辣椒病毒的鑒定^[7，22-24]。2019年6月在對江蘇鹽城南洋試驗場設施辣椒進行病害調查時，發現多株葉片表現黃化、蕨葉等疑似感染病毒病的辣椒植株，但是設施大棚內辣椒的一些生理性病害或藥害可能干擾辣椒病樣采集的準確性。因此，本研究首先利用生物學檢測法對采集的11株疑似感染病毒的辣椒植株樣品進行初步分析，結果發現，用其中3株辣椒病葉漿液摩擦接種的本氏煙植株出現了病毒病侵染的典型癥狀，初步判斷這些辣椒被病毒感染，但還不能確定其種類和歸屬。為進一步明確辣椒感染的病毒類型，用小RNA深度測序技術和生物信息學分析方法對這3株辣椒樣品混成的2份樣品進行檢測，結果發現，樣品1被BBWV2、AMV和ChiVMV 3種病毒復合侵染，樣品2只感染了BBWV2 1種病毒，RT-PCR檢測驗證了這一結果的可靠性。最后利用RT-PCR法對田間采集的11株辣椒樣品和接種的本氏煙植株進行毒源鑒定，發現從上述3株辣椒樣品和其接種的本氏煙植株葉片上均鑒定到了相應病毒，而在其他8株辣椒樣品中未發現任何病毒。當然，此結果并不能完全排除這8株辣椒樣品中存在一些其他或未知病毒的可能性，這還有待進一步研究。上述結果表明，不同病毒檢測方法各有特點，在實際生產過程中如將多種方法結合起來使用，或許能夠建立一套快速、準確、靈敏、高效的辣椒病毒檢測體系。

在自然界中，植物經常受到2種或多種病毒的復合侵染，這種復合侵染往往會引發病毒的協生作用，導致寄主產生比單獨一種病毒侵染更為嚴重的癥狀^[25]。本研究涉及的病毒中，ChiVMV是馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的一個成員。據報道，ChiVMV侵染煙草后主要引起褪綠、黃化、花葉、皰斑和葉緣下卷等典型癥狀^[26]；而AMV作為雀麥花葉病毒科（Bromovirus）苜蓿花葉病毒屬（AIfamovirus）的典型成員，有研究結果證實其感染本氏煙后會出現系統性斑駁花葉、明脈癥狀^[27]。在本研究中，屬于豇豆花葉病毒科（Comoviriadae）蠶豆病毒屬（Fabavirus）典型種的BBWV2單獨侵染本氏煙后表現的癥狀為花葉、蕨葉，植物長勢較正常，而ChiVMV、AMV和BBWV2 3種病毒復合侵染本氏煙卻產生了協生作用，引起了極嚴重的壞死癥狀。在以往的研究中，作為馬鈴薯X病毒屬典型種的馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX）分別與馬鈴薯Y病毒屬成員的馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）或TEV^[28]、李痘病毒（Plum pox virus，PPV）^[29]、煙草脈帶花葉病毒（Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV）^[25]復合侵染本氏煙時均能產生類似的系統壞死癥狀。從本研究結果可以看出，病毒復合侵染寄主引起的協生作用在自然界普遍存在，它不僅能導致植物病害癥狀加重，增加病毒種類鑒定的難度，甚至能造成毀滅性損害，危害程度不容忽視。

值得注意的是，本研究測到的BBWV2、ChiVMV、AMV 3種病毒侵染辣椒在江蘇省均為首次報道。BBWV2的寄主范圍十分廣泛，可侵染包括辣椒、大豆、黃瓜、菠菜、煙草、白術在內的44科植物，目前BBWV2侵染在國內多地辣椒上均有大面積發生，且有逐年加重的趨勢，對各地辣椒產業的健康發展造成重大影響^[3，30]。而ChiVMV也能侵染辣椒、南瓜、番茄、煙草、茄子、曼陀羅等多種農作物，是一種危害非常嚴重的病毒，迄今ChiVMV已蔓延至中國廣東、陜西、四川、云南等十幾個省（區），嚴重威脅各地辣椒的安全生產^[31]。BBWV2、ChiVMV均可通過蚜蟲以半持久性方式進行傳播和汁液接觸方式進行傳播，因此建議要做好鹽城地區辣椒相關病毒病的調查工作，發現病株后及時鏟除，加強傳播介體蚜蟲的防控，以阻止由2類病毒擴散蔓延而造成的嚴重損失。AMV能侵染豆科牧草、豌豆、菜豆、大豆、辣椒、煙草等多種植物，其中豆科牧草苜蓿是AMV最常見的寄主^[32]，而AMV侵染辣椒的頻率在中國并不高，只是偶爾發生且分布不廣泛^[3]。AMV由各種蚜蟲以非持久的方式傳播，還可通過汁液接觸、花粉和種子進行傳播，由于AMV隨種苗進行遠距離傳播的風險較大，因此在辣椒引種過程中要慎重，選用優質健康種苗。此外，在田間避免創傷性農事操作，及時清除病殘體，嚴格控制傳播介體，選育抗病毒辣椒品種等方法，都可對此病毒進行有效防控。

近年來，隨著江蘇鹽城地區設施辣椒種植面積的逐年擴大，辣椒病毒病發生也不斷加重，嚴重影響了當地辣椒的產量和品質。本研究對江蘇鹽城地區辣椒病毒進行了初步檢測，研究結果為對江蘇省辣椒構成威脅的病毒的早期診斷和及時防控提供了依據。后期將進一步加大感染病毒病辣椒樣品的采集和鑒定力度，對辣椒上的優勢病毒、分布及其危害情況進行系統且全面的調查和鑒定，為辣椒病毒病的綜合防控和抗病育種方向提供更有力的指導。

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（責任編輯：徐 艷）