BMSCs外泌體來源miR-133a對大鼠脊髓損傷修復的影響

賈祎佳 陸廷盛 姚書眈 楊建文 姬林松 楊再松 羅春山

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是最嚴重的損傷之一。全世界每年25～50萬人受SCI的影響[1]。SCI可引發一系列的并發癥如呼吸問題、自主神經反射異常、痙攣等,嚴重妨礙患者健康及生活質量,亟需新方法解決該問題[2]。骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)具有較強的更新能力及干細胞特性,可用于治療各種疾病[3]。研究發現不同細胞來源的外泌體包含miRNA、蛋白質、脂質等活性物質,具有免疫調節、抑制瘢痕形成、促神經再生等作用,為SCI治療提供廣闊的治療前景[4]。miRNA是一類小的非編碼RNA,通過直接結合基因的3’非翻譯區調節其下游靶基因,在疾病中發揮重要作用,已證實其在脊髓損傷中的表達及功能[5]。但miR-133a作為家族成員之一,研究發現外泌體來源miR-133a可以對受體細胞產生生物學影響,參與去神經支配等病理學變化[6]。但BMSCs外泌體來源miR-133a是否可以介導SCI的發展尚不清楚。本研究探討BMSCs外泌體來源miR-133a對SCI大鼠修復的影響研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及細胞來源:①蘭州大學實驗動物中心提供55只SD清潔級雄性大鼠,體重210～240 g,7周齡,許可證號:SCXK(甘)2018-0002。所有大鼠均喂養在標準鼠籠中,房間溫度(23±2)℃、濕度(50±10)%,12 h光照-12 h黑暗循環,大鼠均自由攝食和飲水。所有程序經機構動物倫理委員會批準。②無錫欣潤生物科技有限公司提供大鼠小膠質細胞(BV-2),細胞置于DMEM/F12培養基中,并加入100 U/ml鏈霉素及青霉素、10%胎牛血清,于CO2培養箱中培養。

1.1.2 實驗試劑及儀器:①廣州銳博生物科技有限公司提供miR-133a抑制劑及抑制劑對照(NC);Roche公司提供TUNEL凋亡試劑盒;賽默飛公司提供雙熒光素酶報告基因試劑盒;Umibio公司提供外泌體提取試劑盒;CST公司提供CD90、CD45抗體;Abcam公司提供Alix、CD63及膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、神經元核抗原(neuronal nuclear antigen,NeuN)、炎性小體3(NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3,NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)-1一抗。②賽默飛公司提供qRT-PCR儀;南京上多川進出口貿易有限公司提供HD-2700透射電鏡;Olympus公司提供CX21顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs分離及鑒定:隨機選取5只SD大鼠,脫頸處死,將其浸泡于質量分數為75%的乙醇溶液中,取出脛骨、股骨,剔除軟組織,暴露骨髓腔,并反復沖洗骨髓腔,沖洗其中的骨髓置于離心管中,離心10 min后制備細胞懸液,調整細胞密度并接種到25 cm2塑料瓶中,置于培養箱中培養。每2天更換1次培養液,同時洗掉未貼壁細胞。待細胞融合達90%時進行傳代培養,取生長至第7代的BMSCs,采用流式細胞儀檢測細胞表面標記物[CD90、CD45]抗體,鑒定BMSCs細胞。

1.2.2 外泌體提取及鑒定:當BMSCs細胞融合度達80%～90%時,以外泌體培養基培養24 h,參照外泌體提取試劑盒說明書獲得外泌體沉淀,無菌PBS重懸,透射電鏡及Western blot分別觀察外泌體的形態特征并對其表面蛋白進行鑒定。

1.2.3 BMSCs轉染:采用Invitrogen Lipofectamine 2000分別將miR-133a抑制劑(85 nmol/L)、NC(60 nmol/L)轉染BMSCs,轉染24 h后,離心取上清液,按照1.2.2方法提取含miR-133a抑制劑、NC的外泌體,并通過qRT-PCR檢測證實未轉染及轉染NC的BMSCs外泌體中miR-133a表達量高于轉染miR-133a抑制劑的BMSCs外泌體,然后用于體內實驗注射。

1.2.4 SCI大鼠的制備及干預:將剩余50只大鼠隨機分為造模組(40只)、假手術組(10只),參照文獻[7]制備SCI大鼠:麻醉所有大鼠,俯臥位固定大鼠,背部剃毛并消毒,找到脊背T10棘突,行縱向約2 cm切口,分離肌肉,去除T10椎板,以暴露脊髓。利用沖擊器快速挫傷損傷,當大鼠出現尾巴翹起并迅速倒下、雙下肢迅速回縮、劇烈抽搐時認為SCI模型制備成功,假手術組僅去除T10椎板。造模組大鼠均符合SCI模型標準,并將其隨機為SCI組、外泌體組、外泌體-NC組、外泌體-miR-133a抑制劑組。其中假手術組、SCI組給予0.9%氯化鈉溶液干預;外泌體組給予鞘內注射100 μg/ml外泌體干預[8],外泌體-NC組、外泌體-miR-133a抑制劑組給予鞘內注射0.2 ml含NC或miR-133a抑制劑的外泌體[9],每周1次,注射4周。

1.2.5 BBB評估大鼠脊髓損傷程度:干預結束后,采用BBB評分對大鼠脊髓損傷程度進行評估[10],將各組大鼠置于清潔平臺上,自由活動5 min,同時由2名未參加該實驗研究的觀察者記錄大鼠軀干及前、后肢運動情況,BBB評分越低,大鼠脊髓損傷越嚴重。

1.2.6 HE染色檢測大鼠脊髓組織形態學變化:麻醉大鼠,分離脊髓組織,常規脫蠟、包埋、切片后蘇木精-伊紅染色,于顯微鏡下觀察脊髓組織形態學變化。

1.2.7 TUNEL染色檢測大鼠脊髓組織細胞凋亡變化:提取適量脊髓組織,包埋、切片。脫蠟切片與稀釋蛋白酶K在37℃下孵育30 min,然后用4%多聚甲醛固定。清洗后,將切片固于0.3% H2O2-甲醛溶液中,加入Triton X-100在冰上孵育。按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書制備TUNEL反應混合物。將切片與TUNEL反應混合物一起孵育,熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡變化。

1.2.8 RT-PCR檢測脊髓組織中miR-133a表達水平:用TRIzol試劑提取組織中總RNA,逆轉錄試劑盒進行逆轉錄,SYBR Premix試劑盒進行定量PCR,miR-133a引物序列正向:5’-ATAAGAATGCGGCCGCATTCCAAA CTAGCAGCACTA-3’,反向:5’-AGCTTTGTTTAAACTT AACCATTCTAGCTTTTCC-3’,U6引物序列正向,5’-CTTCGGGCAGCACATATACT-3’,反向:5’-AAAATATG GAACGCTTCACG-3’。采用2-△△Ct確定miR-133a的相對表達水平。

1.2.9 Western blot檢測脊髓組織中相關通路蛋白表達:取適量組織,加入RIPA裂解緩沖液裂解總蛋白裂解,離心收集上清液,并用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。通過10% SDS-PAGE分離,轉膜,并用各種一抗(Alix、CD63、GFAP、NeuN、NLRP3、caspase-1)進行探測。然后將膜與二抗一起孵育,以-actin為內參,Image J軟件評估蛋白質表達水平。

1.2.10 雙熒光素酶實驗檢驗miR-133a、NLRP3關系:采用Lipofectamine 3000將含有NLRP3的3’UTR片段的野生(WT)或突變(MUT)載體與模擬物陰性對照(mimics NC)或miR-133a模擬物(miR-133a mimics)共轉染到BV-2細胞中。48 h后收獲細胞,測量熒光素酶活性。

1.3 統計學分析 應用SPSS 21.0統計軟件。采用單因素方差分析多組間比較,進一步行SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs鑒定:流式細胞儀鑒定結果顯示細胞中CD90,CD45表達率分別為98.07%、0.09%。見圖1。

圖1 BMSCs的鑒定

2.2 BMSCs外泌體鑒定 透射電鏡觀察到外泌體為近似球形的囊泡,外部包繞雙層膜,且外泌體中Alix、CD63呈陽性表達。見圖2、3。

圖2 透射電鏡觀察BMSCs外泌體(比例尺=0.1 μm)

圖3 Western blot檢測BMSCs外泌體Alix、CD63表達

2.3 5組大鼠BBB評分 SCI組較假手術組BBB評分顯著降低(P<0.05);外泌體組較SCI組BBB評分顯著增加(P<0.05);外泌體-miR-133a抑制劑組較外泌體-NC組BBB評分顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠BBB評分比較 n=10,分,

2.4 5組大鼠脊髓組織細胞凋亡變化 SCI組較假手術組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05);外泌體組較SCI組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05);外泌體-miR-133a抑制劑組較外泌體-NC組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。見表2,圖4。

表2 5組大鼠脊髓組織中細胞凋亡率比較 n=10,%,

圖4 TUNEL染色觀察細胞凋亡變化(TUNEL染色×400)

2.5 5組大鼠脊髓組織形態學變化 假手術組大鼠脊髓組織無明顯變化;SCI組脊髓組織表現為結構破壞嚴重,有大量膠質瘢痕、空洞形成;外泌體組、外泌體-NC組脊髓結構緊密,損傷部位趨于正常;外泌體-miR-133a抑制劑組膠質瘢痕、空洞依然清晰可見。見圖5。

圖5 觀察脊髓組織形態學變化(HE染色×100)

2.6 5組大鼠脊髓組織中miR-133a表達 SCI組較假手術組miR-133a表達顯著降低(P<0.05);外泌體組較SCI組miR-133a表達顯著增加(P<0.05);外泌體-miR-133a抑制劑組較外泌體-NC組miR-133a表達顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 5組大鼠脊髓組織中miR-133a表達比較 n=10,

2.7 5組大鼠脊髓組織中相關蛋白表達 SCI組較假手術組GFAP、NLRP3、caspase-1表達顯著增加,NeuN表達顯著降低(P<0.05);外泌體組較SCI組GFAP、NLRP3、caspase-1表達顯著降低,NeuN表達顯著增加(P<0.05);外泌體-miR-133a抑制劑組較外泌體-NC組GFAP、NLRP3、caspase-1表達顯著增加,NeuN表達顯著降低(P<0.05)。見圖6,表4。

表4 5組大鼠脊髓組織中GFAP、NeuN、NLRP3、caspase-1表達比較 n=10,

圖6 Western blot檢測脊髓組織GFAP、NeuN、NLRP3、caspase-1蛋白表達;A 假手術組;B SCI組;C 外泌體組;D 外泌體-NC組;E 外泌體-miR-133a抑制劑組

2.8 miR-133a、NLRP3關系驗證 Online數據庫顯示miR-133a、NLRP3存在結合位點。miR-133a mimics+NLRP3 WT組熒光素酶相對活性較mimics NC+NLRP3 WT組顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖7,表5。

表5 4組細胞熒光素酶相對活性比較 n=6,

圖7 Online數據庫預測miR-133a、NLRP3的結合位點

3 討論

SCI是破壞性的中樞神經系統疾病,伴有運動、感覺和自主神經功能障礙[11]。SCI的治療是基礎科學及臨床研究的難點,需研究更有效的治療方案[12]。

BMSCs外泌體可以替代細胞治療,發揮細胞生物學功能,具有無成瘤性、免疫原性更低等優勢[13]。Liu等[14]研究發現BMSCs外泌體顯著增強人臍靜脈內皮細胞增殖、遷移和血管生成,抑制炎癥、A1神經毒性星形膠質細胞的活化,是治療創傷性SCI的有效策略。靜脈輸注BMSCs外泌體可以特異性靶向SCI損傷部位的M2型巨噬細胞,改善非免疫抑制大鼠挫傷性SCI后的功能恢復[15]。本研究通過分離大鼠脛骨、股骨獲得BMSCs細胞,經鑒定后從中得到BMSCs外泌體,并通過電鏡觀察及外泌體標記分子(Alix、CD63)的檢測確定為BMSCs外泌體,并用于后續實驗治療。本研究中,與假手術組大鼠比較,SCI大鼠BBB評分、NeuN表達顯著降低,細胞凋亡率、GFAP、caspase-1表達顯著增加,但SCI大鼠經BMSCs外泌體干預后,均可逆轉上述指標,表明BMSCs外泌體減少SCI大鼠中空洞、膠質瘢痕的形成,促進脊髓損傷修復。

BMSCs外泌體通過遞送特定的miRNAs對靶細胞發揮生物學功能。在創傷性SCI研究中[16],低氧預處理的BMSCs外泌體來源miR-216a-5p通過改變小膠質細胞M1/M2極化進而進行損傷修復。miR-133a屬于BMSCs外泌體中的一種miRNA,研究表明BMSC-Exo分泌的miR-133a可以改善病毒性心肌炎大鼠上皮間質轉化、心肌纖維化[17]。Online數據庫顯示miR-133a、NLRP3存在結合位點。Dai等[18]研究證明抑制NLRP3炎癥小體的激活,改善了脊髓損傷后運動功能、保護神經元,為SCI發生后的炎癥反應提供臨床治療方案。本研究發現NLRP3為miR-133a的下游靶標,且SCI大鼠脊髓組織中miR-133a表達降低,NLRP3表達增加,表明miR-133a低表達可能參與SCI的發生。但研究還發現經BMSCs外泌體干預后,miR-133a表達增加,NLRP3表達下降,進一步促進脊髓損傷修復,表明BMSCs外泌體來源miR-133a,可改善SCI大鼠損傷。為進一步驗證該結論,實驗以si miR-133a進行回復實驗,但抑制miR-133a表達逆轉了BMSCs外泌體對SCI大鼠的修復作用。

綜上所述,BMSCs外泌體來源miR-133a,可能通過靶向抑制NLRP3表達,促進SCI大鼠的損傷修復,為臨床治療提供新方案。