淺析高數值孔徑對STED超分辨顯微成像的影響

時金蒙 張會芳 郝振莉

（黃河水利職業技術學院，河南 開封 475004）

0 前言

STED 超分辨率顯微鏡已被廣泛應用于大氣水體環境物質檢測、生理病理檢測以及生物制劑研制與生產等領域，具有分辨率高、聚焦能力強等優點[1]。對傳統的顯微成像效果影響因素的研究較為成熟，對STED 超分辨率顯微成像影響因素的研究還有較大的提升空間[2]。當前，很多使用者片面認為數值孔徑越大，STED 超分辨率顯微鏡的成像效果一定就越好[3]，未進行更深入的定量定性分析。實際情況并非完全如此，因此，研究高數值孔徑對STED 超分辨率顯微成像的影響具有重要的理論和現實意義。

該文按照從理論到實際的思路，分別對STED 超分辨率顯微鏡的原理、作用以及不同評價指標等進行闡述，從有利影響、不利影響2 個方面論述了高數值孔徑對STED 超分辨率顯微成像的影響，并提出了一種新穎的定量確定高數值孔徑的算法。

1 STED 超分辨率顯微成像

受激輻射損耗（STED）對設備要求相對較高，可以實時拍攝且成像速度快，醫學實踐中常用于活細胞成像追蹤與檢測。

1.1 STED 超分辨率顯微成像的原理和作用

STED 顯微技術作為第一個突破光學衍射極限的遠場顯微成像技術，其基本原理是采用2 束激光同時照射樣品，其中一束激光用來激發熒光分子，使物鏡焦點艾里斑范圍內的熒光分子處于激發態；同時，用另外一束中心光強為0 cd的環形損耗激光與其疊加，使物鏡焦點艾里斑邊沿區域處于激發態的熒光分子通過受激輻射損耗過程返回基態而不自發輻射熒光，因此只有中心區域的熒光分子可以自發輻射熒光，從而獲得超衍射極限的熒光發光點。

1.2 STED 超分辨率顯微成像的評價指標

STED 超分辨率顯微成像技術有多項評價指標，一般是針對物鏡的。

1.2.1 分辨率

顯微鏡的分辨率是最核心的指標，它是指能夠清晰區分2 個物點的最小間距，在有些場合又被稱為鑒別率。物鏡的分辨率與光線波長成正比，與數值孔徑成反比。由于在現實中選擇不同波長光線的可能性不大，因此數值孔徑成為影響分辨率的唯一因素。

1.2.2 焦深

焦深就是焦點深度，是指當用物鏡進行對焦時，在焦點上、下延伸一定范圍，在這個范圍內也是完全意義上的清晰區域，這個延伸范圍的高度就是焦深。焦深概念引入的最大意義就是方便對所觀測物體立體成像清晰度進行定量分析和評價[4]。

1.2.3 景深

當使用物鏡進行對焦時，除了在焦點的上、下進行延伸以外，也可以在左、右部分延伸，左、右清洗區的長度即為景深。通俗來說，景深表示焦點左、右可以延伸到的清晰觀測范圍，這個清晰度不隨圖像的變大而變化[5]。

1.2.4 放大率和有效放大率

放大率是指顯微成像的大小與被觀測物質實際大小的比值，實踐中一般等于目鏡放大倍數與物鏡放大倍數的乘積。由于受到實踐中各種條件的制約，一般達不到理論放大倍數，顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。

1.2.5 覆蓋率

由于顯微鏡蓋玻片的厚度不標準，光線從蓋玻片進入空氣產生折射后的光路發生了變化，從而產生了相差，這就是覆蓋差。國際上規定，蓋玻片的標準厚度為0.17 mm，許可范圍為0.16 mm～0.18 mm[6]。

1.2.6 視場直徑

由于目鏡是圓筒狀的，因此檢測員通過目鏡觀測的物質成像也是圓形背景，大小由目鏡里的視場光闌決定。這個圓形背景的直徑被稱為視場直徑，是表征肉眼能夠觀察到的范圍大小的量值。視場直徑的計算公式為視場直徑=目鏡視場數/物鏡倍率。

2 高數值孔徑對STED 超分辨率顯微成像的影響

STED 超分辨率顯微成像器械繼承了傳統顯微鏡的一般原理，因此在高數值孔徑下具有許多優勢。

2.1 數值孔徑與顯微成像的關系

顯微鏡結構及成像原理如圖1 所示（195 mm 的物象距離是我國相關標準規定的）。

圖1 顯微鏡結構及成像原理示意圖

對物體的放大倍數取決于目鏡放大倍數與物鏡放大倍數的乘積，對顯微鏡來說，目鏡放大倍數是根據需要由調節旋鈕進行自動調節的，而物鏡放大倍數需要根據不同數值孔徑的選擇進行調整。通常情況下，數值孔徑越大，物鏡放大倍數越高，相應的顯微鏡整體放大倍數也越高。

數值孔徑NA是透鏡與被檢物體之間介質的折射率n和孔徑角2α半數的正弦的乘積，如公式（1）所示。孔徑角又稱鏡口角，是透鏡光軸上的物體點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度。

2.2 高數值孔徑對STED 超分辨率顯微成像的正面影響

2.2.1 分辨率與數值孔徑之間基本上呈正相關

對傳統光學成像顯微鏡來說，數值孔徑越大，分辨率越高，在目鏡中顯示的物體形象就越清晰。對STED 超分辨率顯微鏡來說，被螺旋相位板整形的激光束經過高數值孔徑透鏡聚焦后，數值孔徑會影響損耗光聚焦光斑的光強分布。不同的數值孔徑會對損耗光聚焦光斑光強分布和半高寬度造成不同的影響，隨著數值孔徑的增大，半高寬度逐漸變小，最后趨于飽和。一般來說，當數值孔徑增大時，STED 顯微鏡的分辨率會提高，但是不能證明數值孔徑越大，STED 顯微鏡的分辨率就越大。

由于STED 顯微鏡分辨率與受激光照光強有統計學意義，而光強大小直接與損耗光聚焦光斑半高寬有統計學意義[7]，因此在模擬試驗中，通過設置不同的數值孔徑來比較數值孔徑和損耗光聚焦光斑的半高寬之間的關系，該文計算了8 個不同數值孔徑對應的半高寬度，結果見表1。

對STED 超分辨率顯微鏡來說，數值孔徑突破了光的衍射限制，最高可以達到1.4 mm，由于該文研究的是高數值孔徑下STED 超分辨率顯微成像技術的影響，因此最低設定在普通顯微鏡數值孔徑較大區間的起始點0.7 mm。對數值孔徑在0.7 mm 以下的情況來說，該文的研究對其意義不大，因此表1 中未列出相關數據。

2.2.2 高數值孔徑下STED 超分辨率顯微成像視野更寬闊

光線顯示的波狀延伸效果被稱為衍射。這就是為什么即便是使用無像差的高效能鏡頭也會以圓盤形狀的圖樣延伸而不是在單點匯聚。數值孔徑指示沒有光學像差的鏡頭的聚光限制或衍射限制，這個概念被認為來自光的波狀表現。這種圓盤形狀的波稱為愛裏斑（Airy Disk）[8]。愛裏斑（Airy Disk） 的半徑r（寬度）如公式（2）所示。

式中：λ為光的波長；NA為數值孔徑。

通過公式（2）得出的值稱為解析度。數值孔徑越大，愛裏斑 （Airy Disk） 的半徑就越小；這表明數值孔徑越大，影像就越清晰，這也是評估鏡頭的通用標準。

2.3 高數值孔徑對STED 超分辨率顯微成像的不利影響分析

在高數值孔徑為STED 超分辨率顯微成像帶來很多益處的同時，也會產生一定的負面影響。

2.3.1 數值孔徑過高

數值孔徑過高會出現焦深和景深過小的現象。與傳統光學顯微成像技術一樣，STED 超分辨率顯微成像技術的焦深與數值孔徑的平方成反比，數值孔徑越大，焦深越小。焦深小，允許的模糊圈就小，需要在實際檢測與拍攝過程中物距（攝距）減少，鏡頭焦距變短，光圈變大，會影響物體的觀測、拍攝范圍。焦深大， 可以看到被檢物體的全層，而焦深小，則只能看到被檢物體的1 個薄層。

雖然景深與焦深是不同的概念，但是數值孔徑越大，景深也越小。一般來說，景深與焦深是呈正相關的，但是景深并不是越大越好。因為低倍物鏡的景深較大，所以當低倍物鏡照相時會面臨困難。由于STED 超分辨率顯微鏡一半都具有較大的放大倍數，因此在其工作范圍內，景深過小不利于細微圖像的鑒別。

圖2 中焦深為點B與點C連線，景深為點B'與點C'連線。雖然焦深和景深所代表的意義完全不同，但是可以通俗的理解為焦點實際上不是一個點，而是一個矩形區域范圍，其中矩形的長度為景深，矩形的高度為焦深，兩者都是表征焦點區域范圍大小的重要指標。

圖2 同一圖像焦深和景深位置關系示意圖

如果不同焦深和景深的圖像不需要進行放大后觀察很小范圍內的圖像具體效果，那么基本上沒有太大區別，如果需要放大一定倍數，那么圖像放大后的顯示質量會存在明顯的差異。以南加利福尼亞大學圖像庫的狒狒圖像為例，放大相同倍數后，所產生的變化具體如圖3 所示。

圖3 不同焦深和景深情況圖像baboon 對比示意圖

圖3 是將焦深和景深不同的512×512 八位灰度圖像baboon 在MATLAB 軟件中放大3 倍之后的顯示效果，圖片格式均為JPG。圖3（a）的焦深和景深較大，圖3（b）的焦深和景深較小，通過肉眼可以明顯看到圖3（a）比圖3（b）更清晰。具體到顯微成像中，當需要觀察很小區域圖像的具體細節時，需要通過調節目鏡旋鈕放大倍數進行觀看，因此需要更大的焦深和景深，此時如果數值孔徑過大，反而不利于提高觀測精度。

2.3.2 高數值孔徑處在一定區間內

高數值孔徑處在一定區間內會導致受激輻射光強下降。從理論上來說，由于STED 損耗光為環狀光束且其中心強度為0 cd，因此環狀損耗光越強，由第一束激發光激發的熒光分子所占的區域就越小，其橫向分辨率就越高。根據第2.1 節的分析可知，當數值孔徑為0.7 mm～1.1 mm 時，損耗光半高寬度變窄，受激輻射光強下降的影響，光的通透力變弱，造成在此區間內分辨率降低，同時三維層析能力降低。根據第3.1 節的分析可知，顯微成像技術的焦深景深不斷減少，當需要精準觀測某一較小范圍內的情況且需要對所要觀測的圖像進行放大時，會出現圖像模糊不清的情況。另外，由于數值孔徑的變大會導致觀測者必須將物距變小，因此工作距離也相應縮短。綜上所述，高數值孔徑給視場寬度和工作距離帶來了一定的負面影響。

3 基于遺傳算法的高數值孔徑對STED 超分辨率顯微成像的效果優化

3.1 遺傳算法適用性分析

根據第2 節的分析可知，高數值孔徑對STED 超分辨率顯微成像具有有利影響和不利影響。在當前國內外的研究中多采用定性分析，缺乏定量分析，究竟數值孔徑為多大時能夠達到最好的綜合效果，需要根據建立模型使用優化算法進行局部尋優與全局尋優，最終達到收斂的效果，以此確定的自變量值就是數值孔徑具體的取值。實際中常用的優化算法包括遺傳算法、粒子群算法、蟻群算法以及模擬退火算法等，該文以遺傳算法為例，將高數值孔徑對STED 超分辨率顯微成像的分析由定性拓展到定量層面。

遺傳算法包括3 個基本操作，分別是選擇、交叉和變異。選擇是指在進化的每代中，根據適應度函數計算個體的適應度，選擇最佳個體及其代表的解。交叉是為了避免出現“早熟”現象，事先確定一個較小概率，每代中使用偽隨機數發生器產生一個隨機數，當隨機數小于交叉概率時，對2個個體編碼進行交叉操作（隨機選取交叉位）。變異是根據變異概率隨機反轉某一位的二進制值，一般選取的變異概率要明顯小于交叉概率，其原因是如果變異概率很大，算法就類似于獨立的隨機算法，失去了遺傳尋優的意義。

3.2 算法的設計和實現

3.2.1 確定適應度函數

確定適應度函數的整體思路是兼顧第2.2 節的有利影響和第2.3 節的不利影響，因此應是2 個函數的和。由于是研究數值孔徑對成像的影響，因此自變量只有1 個值，代表STED 高分辨率顯微成像設備的數值孔徑寬度或者叫做直徑（用d來表示）。第一個函數是adv（d），其中又包括2 個小函數s（d）和r（d），分別代表分辨率和視野寬度隨數值孔徑的變化曲線，合起來代表有利影響。第二個函數是disadv（d），其中又包括3 個小函數x（d）、y（d）和z（d），分別代表焦深、景深和激光輻射光強隨數值孔徑變化的曲線，合起來代表不利影響。實踐中根據不同的應用需求來確定每個分函數對應的不同權值。因此適應度函數如公式（3）所示。

式中：?1～?5為5 個不同的權值。。

3.2.2 確定步長及權值每個分函數的數值

隨數值孔徑的變化不是簡單的線性關系，甚至不是單調關系，因此無法簡單計算得出最優解。通過確定合適步長，使自變量d在較大量數值之間進行變化，通過不斷的確定局部最優解來不斷逼近全局最優解。隨著納米科技的不斷發展和成熟應用，理論上該算法可以達到納米級別，即計算最優解的結果精確到納米。但實際考慮到顯微成像設備制造技術尚未達到納米級別且必須為算法效率考慮，盡量降低在普通計算機上算法耗用的時間，因此步長以10-3量級為宜。

權值的確定需要根據實際使用過程中每個評價指標的重要性排序來綜合確定，是一個客觀與主觀相結合的靈活變化的量。權值可以采取普通形式，也可以采取歸一化的形式。為了更方便進行對比，同時為其他智能優化算法預留接口，該文采取歸一化的權值確定方式。同時注意權值務必使適應度函數不能是單調函數，否則最優值必然出現在邊界上，失去了尋優的意義。

3.2.3 算法的流程

算法流程如下：1） 隨機產生初始種群，個體數目一定，每個個體為染色體的基因編碼。2） 由編碼得到數值孔徑大小，按照第2.2 節、第2.3 節的內容計算每個小函量值，采用公式（3）計算適應度函數。3） 每代進行最優化選擇，使用輪盤賭策略確定個體的適應度，并判斷是否符合優化準則，如果符合，就輸出最佳個體及其代表的最優解，結束計算，否則轉向第三步。記累計概率為PPi，Pi為個體的選擇概率，如公式（4）所示。共輪轉NP次，每次輪轉時隨機產生位于區間（0，1）內的隨機數r，當PPi-1≤PPi時，選擇個體i。因此，個體的適應值越大，其選擇概率越大。4） 根據適應度選擇再生個體，適應度高的個體被選中的概率高，適應度低的個體可能被淘汰。5） 按照一定的交叉概率和交叉方法生成新的個體。6） 按照一定的變異概率和變異方法生成新的個體。7） 由交叉和變異產生新一代的種群，返回到第二步。

3.3 算法性能分析

選用具體的權值和步長進行算法驗證。硬件平臺為Intel Core i5-5200U（2.20 GHz），4G 內存，軟件平臺為Windows 10（64 位）操作系統，Matlab2016Rb 軟件。主要驗證算法的收斂性、時空性和有效性。步長設定為0.001，權值分別為0.50、0.10、0.25、0.10 和0.05。采用第3.1 節、第3.2 節的內容進行全局尋優，重復10 次，每次均取得了收斂，自變量的平均值為1.178，平均使用時間為25.234 s。由于分辨率在該算例中的權值最大，因此在實踐中對數值孔徑最接近1.178 的顯微成像設備和其他設備進行對比，發現分辨率在肉眼感知上明顯比其他設備高。綜上所述，該算法具有較好的收斂性和有效性，空間占用較小，但是算法耗費時間略高，需要在下步的研究中進行改進。

4 結語

該文按照從理論到實際的思路，從有利方面和不利方面2 個部分分析了高數值孔徑對STED 超分辨率顯微成像的影響。總體來看，高數值孔徑下STED 超分辨率顯微成像效果更好，但是也會出現很多不利的方面。該文提出了一種新穎的對高數值孔徑進行定量確定的算法，使用遺傳尋優的方法達到全局收斂。在下步的研究工作中，要著重從拓展算法的角度選擇合適的智能算法，根據不同評價指標所占比重的不同，制定完善的目標函數，通過不斷訓練達到收斂的自變量值，自動確定數值孔徑的最優數值，不斷提高STED 超分辨率顯微鏡數值孔徑選取的智能化、便捷化水平，并不斷提高算法的時空性能。