糞便SDC2 基因甲基化檢測在結直腸癌早期篩查的臨床價值

王 緣 ，李 蓉 ，陳嬌嬌 ，申艷麗 ，胡鳳娣

（1）昆明醫科大學，云南 昆明 650500;2）昆明醫科大學第三附屬醫院消化腫瘤內科，云南 昆明 650118）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球范圍內常見惡性腫瘤之一，在發達國家中的發病率超過其他癌癥[1]，嚴重威脅著人類身體健康。根據全球癌癥發病率和死亡率的統計，2020 年結直腸癌的發病率和死亡率在所有惡性腫瘤中位居第3和第2[2]。結直腸癌多由腺瘤發展而來，早期多無明顯癥狀，故大多數患者被診斷時已為中期或晚期，錯過臨床治療的最佳時間。有研究表明，通過對高危人群早期篩查可以提高結直腸癌的生存率并降低其死亡率[3]。因此，結直腸癌的早期篩查臨床上具有重要意義。

結直腸癌的早期篩查的主要目的是檢測癌前病變和早期癌癥，進行早期治療，提高患者生存率，因此，結直腸癌早期篩查的方法必須足夠敏感。目前，結直腸癌早期篩查的方法多種多樣，但仍存在一定局限性，患者依從率不高[4]。作為結直腸癌篩查的金標準，結直腸鏡檢查對結腸直腸癌有較高的敏感性和特異性，具有篩查診斷和治療的雙重功能，但結直腸鏡是一項高成本且具有侵入性的檢查，其操作伴隨著一系列的風險消化道出血、腸穿孔等并發癥，嚴重可能致命，不宜用于大規模的結直腸癌普查。同時，患者在結直腸鏡治療前需要進行充分的腸道準備和鎮靜，且已有研究證明腸道準備對結直腸鏡診斷和篩查的效果起著決定性因素[5]，未完成腸道準備而取消結直腸手術的比例高達26.00%[6]。結直腸鏡檢查漏診率較高，漏診主要集中在近端結腸，并且隨著年齡的增高漏診率也在不斷增高[7]。現在，篩查結直腸癌常用的無創技術手段是包括糞便隱血試驗（fecal occult based test，FOBT）和糞便免疫化學檢測（faecal immunochemical test，FIT）。FOBT 易受飲食、藥物以及上消化道出血的影響，FIT 相對FOBT 來說，檢測效率提高，但FIT 對腺瘤不敏感[8]，檢出率低，特異性不高，兩種檢測均容易出現假陰性和假陽性結果，會使一部分人群接受不必要的結直腸鏡檢查，對結直腸癌早期篩查存在明顯的局限性。

對于結直腸癌患者來說，尋找一個無創、便捷且精確性高的早期篩查的手段是非常有必要的。有研究表明非侵入性生物標志物的受檢者接受度高，因此，非侵入性生物標志物的應用可能會提高結直腸癌的早期篩查的參與率[9]。此外，對于結直腸癌高危人群以及希望早期發現結直腸腺瘤的患者來說，精確性高的非侵入性檢測非常具有吸引力。因此，本研究旨在探究糞便SDC2 基因甲基化在結直腸癌早期篩查中的臨床價值，為結直腸癌的早期篩查提供新的理論基礎，提高結直腸癌患者的生存率。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2021 年3 月至2022 年10 月內昆明醫科大學第三附屬醫院門診和住院收治的87 例入組人群的一般臨床資料。其中，男性71 例，女性16 例，年齡為20～85 歲；結直腸正常者41 例，年齡（42.17±13.54）歲；結直腸腺瘤患者21 例，年齡（42.38±14.19）歲；結直腸癌患者25 例，年齡（54.24±11.79）歲。疾病均已經結直腸腸鏡和病理診斷證實。

1.2 納入標準和排除標準

（1）納入標準[10]：健康組：不患有嚴重疾病，遺傳性和家族性疾病，自愿行結直腸鏡檢查；腺瘤組和結直腸癌組均經結直腸鏡確診；腺瘤組：僅患有結直腸腺瘤，除此之外不患有其他腫瘤疾病；結直腸癌組：僅患有結直腸癌，除此之外不患有其他腫瘤疾病；腸癌患者均未行放化療，無抗腫瘤治療史。（2）排除標準：存在免疫系統病者；正在進行其他科學研究的患者。所有研究參與者均知情同意并簽署知情同意書。

1.3 實驗方法

1.3.1 糞便樣本采集收集87 例受檢人群正常飲食情況下的糞便標本，取樣4.5 g 糞便置于糞便收集管中。

1.3.2 糞便SDC2 基因甲基化檢測本研究將嚴格按照人類SDC2 基因甲基化檢測試劑盒的說明書進行了糞便SDC2 基因甲基化的檢測，其主要步驟如下：（1）DNA 提取；（2）亞硫酸鹽轉化；（3）使用Roche LightCycler 480 II 儀器對DNA 樣本進行PCR 擴增；（4）按照試劑盒標準，PCR 使用?actin 作為內參照，試劑盒中提供了陰性和陽性對照，每一次檢測都需要同時檢測陰性和陽性對照。

1.4 診斷標準

在樣本質量合格的條件下以SDC2 基因甲基化循環閾值（cycle threshold，Ct）為準，Ct 值≤38為陽性結果；Ct 值 >38 時為陰性結果。

1.5 統計學處理

本研究采用SPSS 29.0 統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用方差分析；計數資料以例數及占比表示，組間比較采用卡方檢驗。受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC curve）判斷診斷靈敏度和特異度，通過曲線下面積（area under the curve，AUC）判斷診斷效果。P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 SDC2 基因甲基化檢測結果

本研究中，健康組、腺瘤組與結直腸癌組3組之間的性別無明顯差異（P=0.113）；但組間年齡具有統計學意義（P=0.001），結直腸癌組的發病年齡相對較晚；并且SDC2 基因甲基化的陽性表達與結直腸腺瘤及癌變具有相關性，見表1。與健康組相比，SDC2 基因甲基化在結直腸腺瘤和結直腸癌中均顯著高表達，在結直腸癌中高表達尤為顯著，Ct 值差異具有統計學意義（P<0.001），見表2。在受檢人群中，SDC2 基因甲基化檢測在腺瘤組和結直腸癌兩組人群糞便樣本中的陽性率分別為57.14%（12/21）和84.00%（21/25），SDC2基因甲基化檢測結直腸癌的陽性率明顯高于檢測結直腸腺瘤的陽性率，差異具有統計學意義（P=0.044），見表3。故隨著疾病的進展，SDC2 基因甲基化的水平不斷加深，檢測的陽性率也在不斷提高。

表1 87 例入組人群的一般臨床資料（）Tab.1 General clinical information of the 87 enrolled cases（）

表1 87 例入組人群的一般臨床資料（）Tab.1 General clinical information of the 87 enrolled cases（）

*P <0.05。

表2 糞便SDC2 基因甲基化在結直腸腺瘤和結直腸癌中的表達情況比較（）Tab.2 Comparison of fecal SDC2 gene methylation expression in colorectal adenoma and colorectal cancer（）

表2 糞便SDC2 基因甲基化在結直腸腺瘤和結直腸癌中的表達情況比較（）Tab.2 Comparison of fecal SDC2 gene methylation expression in colorectal adenoma and colorectal cancer（）

*P <0.05。

表3 糞便SDC2 基因甲基化檢測結直腸腺瘤和結直腸癌的陽性率[（n）%]Tab.3 Positive fecal SDC2 gene methylation for detection of colorectal adenoma and colorectal cancer [（n）%]

2.2 SDC2 基因甲基化早期診斷結直腸癌的靈敏度和特異度

在糞便標本基因檢測中，SDC2 基因甲基化檢測在結直腸腺瘤和結直腸癌的曲線下面積（AUC）分別為0.715、0.918，靈敏度分別為57.14%、88.00%，特異度分別為95.12%、92.68%，差異有統計學意義（P=0.010，P<0.001），見表4。本研究也分別繪制了結直腸腺瘤（圖1）和結直腸癌（圖2）的ROC 曲線。上述數據表明糞便SDC2 基因甲基化在結直腸腺瘤和結直腸癌診斷上準確性均較高，隨著疾病的進展，SDC2 基因甲基化的水平不斷加深，檢測的準確性也在不斷提高。

圖1 糞便SDC2 基因甲基化檢測結直腸腺瘤的ROC曲線Fig.1 ROC curve of fecal SDC2 gene methylation for detection of colorectal adenoma

圖2 糞便SDC2 基因甲基化檢測結直腸癌的ROC 曲線Fig.2 ROC curve of fecal SDC2 gene methylation for detection of colorectal cancer

表4 糞便SDC2 基因甲基化在結直腸腺瘤和結直腸癌中的診斷價值Tab.4 Diagnostic value of fecal SDC2 gene methylation in colorectal adenoma and colorectal cancer

3 討論

通為最具侵襲性的惡性腫瘤之一，結直腸癌的發生發展是一個緩慢的過程，大多從良性或非癌形式開始。目前有研究認為結直腸癌發病可能與生活方式、環境壓力等因素有關[11]，其早期多無明顯癥狀，隨著腫瘤的不斷發展，當其出現明顯癥狀時，結直腸癌大多已經進入中晚期，錯過了最佳臨床治療時間，預后不良。同時，隨著經濟不斷地發展，我國飲食習慣逐漸西方化，結直腸癌的總體發病率呈現上升趨勢[12]。結直腸癌的早期篩查加上適當干預能降低結直腸癌發病率，提高患者生存率，并改善患者預后。

目前常見的結直腸癌早期篩查的方法各有利弊，人群篩查的依從性均不高[13]。作為結直腸癌檢測的金標準，結直腸鏡檢查被廣泛應用于結直腸癌的早期篩查中，但由于其侵入性強，價格昂貴[14]以及有一定的穿孔和出血風險，存在一定漏診率，導致患者依從率較低。FOBT 因其成本低和非侵入性成為應用較為廣泛的結直腸癌篩查技術，但由于該檢測方法通常收到較多混雜因素的影響，單獨使用FOBT 在結直腸癌篩查中靈敏度和特異度均較低。FIT 在現階段是具有高成本效益的一種非侵入性結直腸癌篩查的方法，相較于FOBT 來說受到食物和藥物的影響較小，所需糞便樣本量較少，但FIT 對結直腸腺瘤和結直腸癌的檢出率均低于結直腸鏡檢查[15]，對結直腸癌早期篩查的效果一般。因此，迫切需要更方便、精確且無創的診斷方法來進行結直腸癌的早期篩查。隨著表觀遺傳學的不斷發展，作為重要表觀遺傳修飾過程之一的DNA 甲基化在結直腸癌中的臨床價值得到重視。有研究表明在新型非侵入性方法中，檢測DNA 甲基化異常水平的變化更適用于臨床[16]，并且DNA 甲基化具有高穩定性利于檢測，因此檢測生物標志物DNA 甲基化的異常水平變化被認為是診斷癌癥的理想方法。

DNA 甲基化是一個以s-腺苷甲硫氨酸（SAM）為甲基供體，并在DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的作用下，將甲基添加到特定堿基的過程。已有研究證明DNA 甲基化水平異常變化是癌癥發生的標志，啟動子區域的高甲基化使腫瘤抑制基因啟動子處于整體低甲基化和局部高甲基化進而使抑癌基因失活，提高腫瘤發生率[17]。并且糞便DNA 甲基化水平改變與結直腸癌的發生、發展有著密切關系，該水平變化常發生在結直腸癌早期[18]。在臨床上，堿性的腸道環境被認為可以促進腫瘤DNA 的保留，并能更好的確保糞便DNA 的質量更好。因此，檢測糞便樣本中異常的DNA 甲基化水平是早期篩查結直腸癌的理想方法。

黏結蛋白聚糖2（SDC2）是一類跨膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖，通過調節細胞與環境之間的相互作用，編碼SDC2 蛋白，影響細胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進腫瘤的發生發展[19]。近期有研究顯示SDC2 基因甲基化是結直腸癌中一個新的表觀遺傳標志物[20]，同時證明結直腸癌的病變部位、浸潤深度、病變轉移部位、病理分期等臨床特征與SDC2 基因甲基化無關[21]，這表明SDC2基因甲基化水平在結直腸癌發生、發展過程中的改變很有可能早于其組織病理學改變。同時，有研究表明在結直腸癌的早期篩查中檢測糞便中的SDC2 基因甲基化水平具有較高的臨床價值[22]。

通過對比糞便SDC2 基因在結直腸腺瘤和結直腸癌中的甲基化水平，本研究發現在患者出現癌前病變（結直腸腺瘤）時，DNA 甲基化水平已經發生改變，并且隨著癌變進程SDC2 甲基化水平不斷加深。同時，本研究證明SDC2 基因甲基化在診斷結直腸腺瘤和結直腸癌中均具有較高的特異度，并且隨著疾病逐漸演變，SDC2 基因甲基化診斷的靈敏度也在不斷升高，對結直腸癌的早期篩查具有很高的臨床價值。

Syed A R 等[23]通過使用全國性數據庫Explorys進行基于人群的隊列分析，篩選出2012 年1 月至2016 年12 月所有具有活躍電子病歷且診斷為結直腸癌的患者，其中共有68 860 名患者被確診為結直腸癌，其中5 710 例（8.3%）年齡在25～50歲之間，63 010 例（91.50%）年齡大于50 歲，排除年齡小于25 歲的140 例，證明年齡與結直腸癌發病率有一定關系；并且該研究通過對比早發型結直腸癌隊列（25～49 歲）和對照組（25～49 歲內未診斷為結直腸癌者）發現男性和結直腸癌風險增加有關。本研究通過對樣本的一般資料進行統計分析后發現健康組、腺瘤組與結直腸癌3 組之間的性別無明顯差異，但組間年齡有統計學差異，結直腸癌組中當患者年齡超過44 歲時，結直腸癌發病率更高。

綜上所述，糞便SDC2 基因甲基化檢測是一種基于糞便樣本的無創、便利、快捷的新型技術，在結直腸癌早期篩查中有著較高的特異度，并且隨著癌變進程靈敏度不斷升高，因此能更好地發現和追蹤癌前病變，具有很高的臨床價值。因此，糞便SDC2 基因甲基化在結直腸癌的早期篩查中是一個非常重要的指標，具有良好的臨床應用前景。然而，本研究設計還是具有一定局限性，如樣本量小，樣本來源單一等。因此，未來仍需要增加樣本量進行大量的研究，進一步證實糞便SDC2 基因甲基化在結直腸癌早期篩查中的臨床價值。