云南德宏州傣族人群CaSR 基因SNP 與含鈣腎結石和高鈣尿的關聯性

李 吉 ，柯坤彬 ，張白羽 ，劉裔道 ，白 晶 ，董 滔 ，王振丞 ，秦德強 ，王夢悅 ，李 顥

（1）昆明醫科大學第一附屬醫院泌尿外科，云南 昆明 650032;2）德宏州人民醫院泌尿外科，云南 德宏 678400;3）芒市人民醫院泌尿外科，云南 德宏 678400）

腎石癥是一種高發病率、高復發率的全球性疾病。我國腎結石的發病率為5.8%左右，復發率高達50%左右，造成了嚴重的社會和經濟負擔[1]。而腎結石中含鈣結石占到80%，其中以草酸鈣結石、磷酸鈣最為常見[2]。含腎結石的發病機制復雜且被認為是一種全身性代謝性疾病[3]。世界衛生組織（WHO）估計，超過90%的人類疾病是由基因引起的[4]。近年來的研究發現腎結石發生和多種因素相關，如種族、地域、環境、飲食、基因遺傳、疾病等多因素導致了結石的易感性[5]。目前研究認為高鈣尿是形成含鈣腎結石最常見和最重要的代謝因素之一，與含鈣腎結石的發生密切相關，尿中鈣鹽的過飽和是含鈣結石形成的確定因素之一[6]，高鈣尿可由腸吸收增強、骨吸收增加或腎小管運輸改變引起[7]。近年來的研究已經發現包括鈣敏感受體（calcium sensing receptor，CaSR）和維生素 D 受體（vitamin D receptor，VDR）、密蛋白家族（claudin，CLDN），骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、降鈣素受體（calcitonin receptor，CTR）等相關基因中的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）與含鈣腎結石形成相關。但這些研究在不同國家、地域和民族研究結果并不完全一致[8?10]。因此認為，不同地域、不同種族腎結石的基因相關性不一定相同。國際國內的研究已經證實鈣敏受體在甲狀旁腺和腎臟組織中高表達，其功能的表達明顯影響鈣的代謝[11]。本研究采取了生活于中國云南省西南部的特有少數民族傣族作為研究對象。在云南德宏的傣族結石發病率較高，部分地方可見“結石村”。而傣族也是緬甸北部、泰國、老撾的主體民族。CaSR 基因3 個SNP位點rs7652589、rs1801725、rs1042636 國際國內都有研究顯示與腎結石或高鈣尿有關[12?13]。因此本研究選擇該中國云南德宏傣族這3 個具有一定代表性的位點進行分析。通過對該區域性民族的CaSR 基因多態性與腎結石和高鈣尿的關聯研究，初步揭示該區域內傣族含鈣腎結石遺傳學特征。

1 資料與方法

1.1 病例資料

選取2021 年8 月至2022 年5 月在云南省德宏州人民醫院和德宏州芒市人民醫院住院手術治療的腎結石者213 例。

2 組患者性別、年齡、BMI、尿pH 等計量資料符合正態分布，應用獨立樣本t檢驗，差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

表1 研究對象一般信息對比分析Tab.1 Comparative analysis of general information of research subjects

1.2 實驗樣本

通過泌尿系CT、腹部平片和手術取石手術記錄等資料作為患者診斷腎結石的依據。手術中獲得的結石通過紅外光譜法對結石成分進行分析，其中尿結石成分為草酸鈣、磷酸鈣或2 者的混合結石的患者160 例，進入實驗組。同時選取在德宏州人民醫院和德宏州芒市人民醫院體檢的當地傣族健康人群作為對照組87 例，泌尿系CT、尿路平片、腹部B 超等檢查排外結石。2 組研究對象均收集靜脈血，結石組收集24 h 尿液，化驗24 h 尿鈣，2 組患者均排除泌尿道感染、腎小管酸中毒、甲旁亢、骨質疏松癥、糖尿病等全身代謝性疾病、腎功能不全或腎衰竭、排外慢性腹瀉等胃腸道疾病、獨腎、高尿酸血癥、低鎂血癥、腫瘤疾病、排外服用氫氯噻嗪類利尿劑、性激素和糖皮質激素等藥物。

1.3 實驗方法

1.3.1 結石成分分析SUN-3G 型智能結石分析儀采用紅外光譜分析法分析患者術后的結石成分，結石成分為草酸鈣、磷酸鈣或兩者的混合結石，其余類型結石排除。

1.3.2 血、尿標本收集收集符合實驗對象血液，靜脈血3～5 mL，使用EDTA 采血管，立即-80 ℃冰箱保存，后續進行基因監測。清晨新鮮尿測pH 值，收集符合實驗對象尿液從受檢前1 d 清晨8 點開始留取24 h 尿液，尿液中加入濃鹽酸10 mL防腐和防止鈣鹽沉積，收集至第2 天清晨8 點，以測量24 h 尿鈣和尿磷。

1.3.3 提取和擴增DNA引物序列相關信息，見表2。

表2 引物設計Tab.2 Primer design

Sanger 測序：PCR 產物切膠純化，將樣品點入事先準備好的1%的純化膠中，電泳儀電壓設定160 V 接上接頭正負極恒壓電泳40～60 min，開始電泳后要觀察純化膠槽正負極有氣泡冒出后，定時。將膠塊放入凝膠成像儀器中采集圖像。在長波365 nm 紫外透射儀下，用手術刀切下目的條帶，切取的膠塊質量應小于3 g，將其放入對應的板孔號中。

純化板配平4000 r/min 離心1 min，加入500 μL Buffer GL，蓋上封口膜，65 ℃水浴12～15 min。將96 孔板卡入磁力架中，磁吸30 s，將磁力架和樣品正反輕微顛倒3 次，再次靜置磁吸1 min，反復純化。洗脫后2 μL 樣品+6 μL 0.5X 溴酚藍混合后點入0.8%的鑒定膠中，300 V 電泳12 min。對照純化前后膠圖，根據PCR 定量標準在PCR 記錄表上標注每孔模板濃度并稀釋至指定濃度。BDT 反應操作，查看是否是目標程序（96 ℃4 min→96 ℃ 10 s→50 ℃ 5 s→60 ℃ 3 min→4 ℃ ∞），升溫是否正常。反應純化后上測序儀，從測序儀上拷貝出數據，通過 Sequencing Analysis 5.2 分析峰圖數據。

1.4 統計學處理

所有數據采用SPSS 軟件包進行分析，基因型、等位基因頻率等采用直接計數法計算。各組間基因型及等位基因頻率、純合基因和純合及雜合型等比較分析采用四格表χ2檢驗，計量資料以（均數±標準差）表示，各組間數據的比較采用t檢驗或方差分析。以P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 電泳檢測結果

將擴增好的PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳（2 μL 樣品+6 μL 溴酚藍），300 V 電壓下12 min，獲取鑒定膠圖，通過膠圖確定目的條帶大小。觀察結果：主帶明亮，無雜帶，PCR 產物達到較好純度。見圖1、圖2。

圖1 CaSR 基因rs7652589 的16 個標本電泳圖Fig.1 CaSR gene locus rs7652589 sixteen specimens electrophoretogram

圖2 CaSR 基因rs1042636 和rs1801725 位點16 個標本電泳結果Fig.2 CaSR gene locus rs1042636 and rs1801725 sixteen specimens electrophoretogram

2.2 測序結果

CaSR 基因rs1042636 位點結果，見圖3；rs1801725 位點結果，見圖4；rs7652589 位點結果，見圖5。

圖3 CaSR 基因rs1042636 位點各基因型測序峰圖Fig.3 CaSR gene locus rs1042636 genotype sequencing peak map

圖4 CaSR 基因rs1801725 位點各基因型測序峰圖Fig.4 CaSR gene locus rs11801725 genotype sequencing peak map

圖5 CaSR 基因rs7652589 位點各基因型測序峰圖Fig.5 CaSR gene locus rs7652589 genotype sequencing peak map

2.3 分析結果

2 個實驗組人群CaSR 的3 個SNP 位點中，rs1042636、rs1801725、rs7652589 符合哈迪-溫伯格平衡定律（P>0.05）。說明這3 個位點在該人群中基因遺傳平衡，3 個位點的數據來自同一蒙德爾群體，見表3。

表3 哈迪-溫伯格平衡檢驗結果Tab.3 Hardy-Weinberg test

2 個實驗組等位基因型、基因型和單倍型分析。等位基因型頻數分析結果表明，3 個CaSR 位點2 組間的分布差異均無統計學意義（P>0.05）。CaSR 基因上的rs7652589 位點的基因型頻數分布差異具有統計學意義（P<0.05），見表4。

表4 等位基因型頻數分析Tab.4 Allelic frequency analysis

Major allele 純合型與其他基因型頻數比較分析結果表明，CaSR 基因上的rs7652589 的純合基因型與其他基因型頻數2 組間的分布差異均具有統計學意義（P<0.05）。Major allele 純合型及雜合型與其他基因型頻數比較分析中可見患者TT 基因型為零，見表5。

表5 純合型與其他基因型頻數分析Tab.5 Homozygous and other genotypes frequency analysis

2.4 連鎖不平衡和單倍體分析

單體型分析對應基因位點及位置，見表6。

表6 單體型分析對應基因位點及位置Tab.6 Haploid analysis corresponding loci and positions

連鎖不平衡分析結果顯示，rs1801725 與rs7652589 的D'=1 >0.8，rs1801725、rs7652589、rs1042636 的3 個位點r2 均 <0.8，見表7、表8。3 個位點4 種單倍型分析，見表9。

表7 SNP 位點連鎖不平衡分析結果（D'）Tab.7 Analysis results of linkage disequilibrium at SNP loci（D'）

表8 SNP 位點連鎖不平衡分析結果（r^2）Tab.8 Analysis results of linkage disequilibrium at SNP loci（r^2）

表9 2 組CaSR 基因SNP 位點的單倍型分析結果[n（%）]Tab.9 Haploid analysis results of two sets of CaSR gene SNP loci [n（%）]

2 組實驗者低高鈣尿發病率的對比分析，差異有統計學意義（P<0.05）。高鈣尿的界定值為24 h 尿鈣排泄男性 >300 mg/d，女性 >250 mg/d，見表10。

表10 2 組實驗對象高鈣尿平均值、高鈣尿發病率對比分析表[n（%）/ ]Tab.10 Comparative analysis of average hypercalciuria and incidence rate of hypercalciuria between two groups [n（%）/ ]

表10 2 組實驗對象高鈣尿平均值、高鈣尿發病率對比分析表[n（%）/ ]Tab.10 Comparative analysis of average hypercalciuria and incidence rate of hypercalciuria between two groups [n（%）/ ]

*P <0.05。

結石組的CaSR 各基因型與24h 尿鈣含量的對比分析。160 例結石患者中高鈣尿患者為57 例，占35.6%。rs1042636 位點的GG 型基因者的24 h尿鈣值與AA、AG 基因型者對比，差異有統計學意義（P<0.05），rs7652589 位點的GG 型基因者的24 h 尿鈣值與AA 型基因者對比，差異有統計學意義（P<0.05），見表11。

表11 結石組各基因型與24 h 尿鈣值對比分析（ ）Tab.11 Comparative analysis of different genotypes and 24-hour urinary calcium levels in the stone group（）

表11 結石組各基因型與24 h 尿鈣值對比分析（ ）Tab.11 Comparative analysis of different genotypes and 24-hour urinary calcium levels in the stone group（）

*P <0.05。

3 討論

尿石癥是泌尿系統最常見的疾病之一[14]。腎結石的發病率有逐年增加的趨勢，女性和兒童的發病率有所增加[15]，因此，腎結石的發生與復發機制越來越受到關注。含鈣腎結石在腎結石中占80%，它的發生常合并一些代謝紊亂[16]，因此對含鈣腎結石與高鈣尿的相關基因研究顯得格外重要。高鈣尿是含鈣腎結石患者最常見的代謝異常，在含鈣腎結石患者中占30%～60%。在亞洲發病率最高的地區是南亞、東南亞和西亞，草酸鈣是結石的主要成分，發病率和復發率呈上升趨勢[17]。筆者前期的一些研究已經證實了中國白族、彝族腎結石與低枸櫞酸尿和高鈣尿中的遺傳相關性[18?19]。傣族為中國西南邊境的少數民族，人口130 萬，且為緬甸、泰國、老撾的主體民族之一，在南亞和東南亞廣泛分布，他們居住的地方多經濟欠發達，腎結石的發病率較高。在我國還沒有針對這一區域這一民族的腎結石相關研究，國際上也只有泰國有少量關于泰國整體人群的結石與維生素25（OH）D 的研究[20?21]。國際上的一些關于雙胞胎、家庭和兒童相關腎結石方面的遺傳研究已經證實了含腎結石的遺傳相關性和易感性[22?24]。因此本研究選取了中國西南部這一特有的區域民族進行含鈣腎結石和高鈣尿相關的基因研究，傣族的飲食習慣和居住環境較類似，對中國該民族聚居的邊境區域甚至東南亞部分地區少數民族的腎結石病因學研究有重要意義。

鈣敏感受體主要在甲狀旁腺和腎小管中高表達[25]。CaSR 通過表達細胞感知血鈣水平的變化來調節甲狀旁腺激素（PTH）分泌和尿鈣排泄從而維持血鈣的正常水平[26?27]。在腎臟中，CaSR 在近曲小管的頂膜、粗升支的基底外側膜和遠曲小管基底外側膜上表達[28]。CaSR 的激活可能通過抑制鈣敏感性鉀通道活性，降低腎小管鈣的重吸收，而導致高鈣尿癥[29]。CaSR 能結合多種配體，與多種G 蛋白相互作用發揮其影響[30]。

一些國際上的研究提示CaSR 基因調控區rs7652589 和rs1501899 位點的次要等位基因與患者的腎結石發生和易感性相關[12]。關于CaSR 基因第7 外顯子的rs1801725、rs1042636 和rs1801726基因位點多態性和腎結石的研究，也發現一些相關性，但結果并不一致[10,31?32]。這也提示了在不同地域不同種族群體不同的CaSR 多態性和含鈣腎結石風險相關性存在顯著差異。本研究選取了在CASR 的羧基末端尾部的2 個常見基因多態性，rs1801725，rs1042636 和位于人類3 號染色體啟動子1 的TATA 盒上游13 kbp 處的rs7652589[33]共3 個具有代表性的多態性位點作為研究對象。國外有研究估計在無單基因腎結石患者中，估計腎結石的遺傳率 >45%，高鈣尿的遺傳率 >50%[21，34]。高鈣尿通常被認為是含鈣腎結石最常見的代謝危險因素，腎結石和骨質疏松是其主要的2 個表現[35?36]。本研究采用的高鈣尿定義為：24 h 尿鈣排泄男性 >300 mg/d（>7.45 mmol/d），女性 >250 mg/d（>6.24 mmol/d）[37]。

本研究中的 3 個 SNP 位點 rs7652589、rs1801725、rs1042636 的群體基因型符合Hardy-Weinberg 平衡（P>0.05），說明該研究群體來源于同一個孟德爾群體，這是進一步討論位點間是否有統計學差異的遺傳學基礎。3 個位點等位基因頻率分布比較分析均無統計學意義（P>0.05），且G 為次要等位基因，這一結果與國外國內一些研究并不一致[11，33]。意大利的相關研究顯示rs7652589（G >A）次要等位基因與意大利患者的腎結石相關，并可能增加原發性甲狀旁腺功能亢進（PHPT）患者產生腎結石的易感性[11]。波蘭相關研究提示rs7652589 的A 等位基因是波蘭血液透析患者發生腎結石的危險等位基因[12]。這可能因樣本量不足所導致或該民族在這3 個位點等位基因頻數分布特點，有待進一步研究證實。而在基因型頻數分析中rs7652589 位點的分布差異具有統計學意義（P<0.05），這說明CaSR 在該位點與云南傣族人群腎結石的發生具有密切關系。其中，筆者發現云南德宏傣族人群中rs1801725 位點并沒有一個TT 型基因，這有可能是樣本量不足所致，但也不排除該位點確是該民族一個顯著特點。TT 或GG 型基因都有可能是該民族的結石保護基因或易感基因，這需要后期進一步擴大樣本量研究及與其他民族對比分析。Major allele 純合型與其他基因型頻數比較分析結果表明，CaSR基因上的rs7652589 的純合基因型與其他基因型頻數2 組間的分布差異均具有統計顯著性（P<0.05），而純合及雜合與其他基因型對比中rs7652589 位點的結果（P=0.828）。綜合判斷認為，CaSR 的rs7652589 基因位點的AA 純合型基因與云南傣族人群結石發生具有統計學意義。

在CaSR 的3 個SNP 位點位于2 個染色體上，將SNP 位點進行連鎖不平衡和單倍體分析，分析結果顯示CaSR 的rs7652589、rs1801725、rs1042636位點在云南德宏傣族人群中并沒有連鎖不平衡，因此筆者認為研究的3 個鈣敏位點各等位基因相互沒有明顯影響或干擾。

結石組的CaSR 各基因型與24 h 尿鈣含量的對比分析。160 例結石患者中高鈣尿患者為57 例，占35.6%。rs1042636 位點的GG 型基因者的24 h尿鈣值與AA 基和AG 因型者對比，差異具有統計學意義（P<0.05），這與國際國內的一些前期研究結果相符[30]。rs7652589 位點的GG 型基因者的24 h 尿鈣值與AA 型基因者對比，差異具有統計學意義（P<0.05）。因此rs1042636、rs7652589位點的基因多態性與患者的高鈣尿發生密切相關，筆者推斷rs7652589 位點的GG 型基因與患者高鈣尿和含鈣腎結石有相關性，在中國傣族人群中高鈣尿與含鈣腎結石的發生可能有相關性。

然而，本研究仍存在一些局限性，樣本量較小降低了數據對比差異和說服力，本研究缺乏同一民族不同國家人群的對比分析，和同一地區不同民族的對比分析。本研究雖然選擇了同一地區同一少數民族這一群體進行研究，盡量降低了環境和飲食等因素的干擾，但結石病因復雜，鈣敏受體影響疾病較多，對腎結石的發生有影響的鈣敏受體較多，希望后續的研究能夠加大樣本量、擴大鈣敏受體位點和尿液其他生化指標對比分析，甚至可以進行全基因組測序研究。從而找出傣族人群特征性的結石風險因素和基因風險。

綜上所述，筆者推斷在中國云南德宏傣族人群中CaSR 基因上的rs7652589 位點多態性與含鈣腎結石和高鈣尿的發生有關，rs7652589 位點GG型基因可能是該民族發生高鈣尿后導致含鈣腎結石的候選基因。rs1042636 位點的GG 型基因與傣族高鈣尿發生相關。rs1801725 位點的TT 基因零表達，是否是該民族一個特有特點有待進一步研究。