DATS 調(diào)控VEGF 信號(hào)軸改善URSA 小鼠胎盤血管的形成

宋家美 ，劉 洋 ，史 濤 ，姜方潔 ，陳靜思 ，范 文 ，梁 宇 ，孟昱時(shí)

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科;2）疼痛科，云南 昆明 650101）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是臨床上常見(jiàn)的一種妊娠生殖障礙性疾病。由于不同國(guó)家或地區(qū)經(jīng)濟(jì)狀況及社會(huì)背景的差異性，導(dǎo)致國(guó)際上對(duì)RSA 的定義尚不統(tǒng)一。2012年美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)（American society for reproductive medicine，ASRM）和2018 年歐洲人類生殖與胚胎學(xué)協(xié)會(huì)（European society of human reproduction and embryology，ESHER）將RSA 定義為2 次或2 次以上的妊娠失敗[1?2]；英國(guó)皇家婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會(huì)則將RSA 定義為與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3 次或3 次以上在妊娠24 周前發(fā)生的妊娠丟失[3]；而我國(guó)通常將RSA 定義為與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生2 次及以上在妊娠28 周前的妊娠丟失，包括生化妊娠[4]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，在育齡婦女中，RSA 的發(fā)病率從1%～5%不等[5]，其病因多種多樣，主要與年齡[6]、染色體或基因異常[7]、解剖因素[8]、感染和內(nèi)分泌功能障礙[6,9]等相關(guān)。然而，目前仍有相當(dāng)一部分RSA 患者的病因及其發(fā)病機(jī)制不清楚，臨床將此類患者稱為URSA[4]。

近年來(lái)，隨著我國(guó)醫(yī)療技術(shù)的突飛猛進(jìn)，對(duì)于病因明確的RSA 患者采取針對(duì)性診治措施，如對(duì)反復(fù)出現(xiàn)胚胎染色體異常的RSA 夫婦進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)（preimplantation genetic testing，PGT）、對(duì)子宮機(jī)能不全患者進(jìn)行子宮頸環(huán)扎術(shù)、對(duì)RSA 合并自身免疫性疾病的患者聯(lián)合風(fēng)濕免疫科醫(yī)師進(jìn)行評(píng)估及制定治療方案等均有效改善了RSA 患者的妊娠結(jié)局[9?12]；而對(duì)于URSA 患者而言，目前的治療缺少有效統(tǒng)一的方法，現(xiàn)有的治療方案主要是基于生殖免疫學(xué)理論，針對(duì)母胎界面微環(huán)境的免疫因素進(jìn)行的一些嘗試治療[4]，效果存在爭(zhēng)議[13]。URSA 作為一種病理妊娠不僅使患者承受嚴(yán)重的生理及心理負(fù)擔(dān)，也對(duì)家庭、社會(huì)造成了不良的影響[14]。因此，探索URSA 的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。

目前，國(guó)內(nèi)外已有研究發(fā)現(xiàn)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞合成的H2S 在胎盤血管形成、發(fā)育過(guò)程中有著非常重要的作用，胎盤組織H2S 的減少會(huì)削弱胎盤血管生成，造成胎盤功能障礙，不利于胚胎的著床及其生長(zhǎng)發(fā)育[15?16]。而DATS 作為H2S 的供體，可以有效增加實(shí)驗(yàn)?zāi)肛i胎盤血管的生成[17?18]，從而有效改善肥胖母豬妊娠結(jié)局。然而，對(duì)于DATS 能否改善URSA 小鼠胎盤血管的生成尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)告。基于上述發(fā)現(xiàn)，本研究將通過(guò)構(gòu)建URSA 小鼠模型，探討外源性給予DATS 后，對(duì)其胎盤血管形成產(chǎn)生的影響，并深入探討其可能存在的作用機(jī)制，為今后臨床治療和預(yù)防URSA 提供新的科學(xué)依據(jù)，具有十分重要的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

TRIzol 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，凝膠成像系統(tǒng)、PCR 儀、電泳儀、垂直電泳槽、濕式轉(zhuǎn)膜槽、纖維墊購(gòu)自美國(guó)Bio-RAD 公司，Whatman 濾紙購(gòu)自美國(guó)GE 公司，VEGFA、VEGFR-2 購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司，β-actin 購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，DATS 購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，H2S ELISA 試劑盒購(gòu)自重慶閬闐生物科技有限公司，Phosphate Buffer Saline（PBS）、Servicebio RT First Strand、2XSYBR Green qCR Master mix（High ROX）購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司，微量核酸蛋白定量?jī)x購(gòu)自杭州逐真生物技術(shù)有限公司，RT-qPCR 電泳槽購(gòu)自北京百晶生物技術(shù)有限公司，RIPA 裂解液、PMDF、Tween 20、30%制膠液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

URSA 模型小鼠購(gòu)自北京唯尚立德生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK（京）2021-0010。出現(xiàn)陰道栓的母鼠視為妊娠 0.5 d。

1.3 給藥和實(shí)驗(yàn)分組

將16 只URSA 妊娠母鼠隨機(jī)分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，每組8 只小鼠。參照文獻(xiàn)進(jìn)行給藥[17]。對(duì)照組在常規(guī)飼喂日糧的基礎(chǔ)上同時(shí)給予200 μL PBS 進(jìn)行灌注、實(shí)驗(yàn)組在常規(guī)飼喂日糧的基礎(chǔ)上同時(shí)給予200 μL DATS 與PBS 的混懸液進(jìn)行灌注。2 組小鼠每天灌注1 次，總共灌注17 次，在妊娠18.5 d 上午8:30 開(kāi)始禁食，禁食6 h 后行頸椎脫臼處死法處死孕鼠并檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。

1.4 亞甲藍(lán)分光光度法測(cè)定鼠胎盤組織中H2S 水平

按照0.1 g 鼠胎盤組織加1 mL 磷酸鉀緩沖液的比例進(jìn)行冰浴勻漿。勻漿液離心（12000 r/min 10 min，4 ℃），取 0.8 mL 上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。再加入 0.15 mL 提取液二，漩渦震蕩30 s，離心（12000 r/min 10 min，4 ℃）后取上清置于冰上待測(cè)。用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于665 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)H2S 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出鼠胎盤組織勻漿中H2S 水平，H2S 含量以單位質(zhì)量鼠胎盤組織中H2S 的量（nmol/g）表示。

1.5 RT-qPCR 檢測(cè)胎盤組 織中CD31、VEGFA和VEGFR2 的相對(duì)表達(dá)量

課題組首先在pubmed 上查詢對(duì)應(yīng)物種的目的基因mRNA 序列，以CDS 序列設(shè)計(jì)引物。應(yīng)用軟件設(shè)計(jì)Q-PCR 引物（表1）。其次進(jìn)行總RNA的提取，取適量的胎盤組織于離心管中，加入1 mL 的Trizol Reagent 裂解液，研磨胎盤組織成勻漿狀態(tài)。將樣品放在4 ℃靜置裂解15 min，收集細(xì)胞至EP 管中。向各EP 管中加入200 μL 氯仿，上下顛倒混勻至乳化，室溫放置15 min；在4 ℃低溫離心機(jī)中12000 r/min 離心15 min；小心吸取上層水相，轉(zhuǎn)移到新的EP 管中；然后向各管中加入500 μL 異丙醇，4 ℃放置15 min；在4 ℃低溫離心機(jī)中12000 r/min 離心15 min；棄上清，各EP 管中加入1 mL 75%乙醇，輕柔晃動(dòng)洗滌沉淀；在4 ℃低溫離心機(jī)中7 500 r/min 離心5 min，棄上清；沉淀在室溫下放置約2 min 風(fēng)干；根據(jù)RNA 沉淀的量適當(dāng)加入20 μL～50 μL 的RNasefree 的H2O，溶解RNA。用槍反復(fù)吹打后，吸取2 μL 總RNA 樣品在微量核酸蛋白定量?jī)x中測(cè)其濃度以及純度。按照合成20 μL cDNA 需要總RNA 樣品為2 μg 計(jì)算所需總RNA 的體積計(jì)算，公式如下：逆轉(zhuǎn)錄中所需總RNA 的體積量A=2 μg/測(cè)得的RNA 濃度。采用二步法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄完成后，所得cDNA 以貝塔-actin作為內(nèi)參進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)。最后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q-PCR）進(jìn)行CD31 的檢測(cè)，Q-PCR 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行分析，其中實(shí)驗(yàn)結(jié)果 >1，表示與對(duì)照組相比，該樣本的該基因表達(dá)升高；實(shí)驗(yàn)激發(fā) <1，表示與對(duì)照組相比，該樣本的該基因表達(dá)降低，而2-△△Ct=2-[（Ct 實(shí)驗(yàn)組目的基因-Ct 實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因）-（Ct 對(duì)照組目的基因-Ct 對(duì)照組內(nèi)參基因）]，見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.6 Western blot 檢測(cè)胎盤組織中VEGFA、VEGFR2 的蛋白表達(dá)水平

收集2 組鼠胎盤組織，提取總蛋白，并根據(jù)BCA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定蛋白濃度，將變性后的蛋白溶液進(jìn)行上樣后行SDS－PAGE 凝膠電泳分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后使用封閉液（含5%脫脂牛奶的TBST 溶液）室溫封閉PVDF 膜1.5 h 后，加入一抗孵育（稀釋比例參照抗體說(shuō)明書(shū)），然后與封閉好的PVDF 膜在4 ℃條件下過(guò)夜，加入二抗孵育，封閉液稀釋相應(yīng)的二抗（稀釋比例參照抗體說(shuō)明書(shū)），室溫下孵育PVDF 膜1.5 h 后使用ECL 進(jìn)行顯色，并進(jìn)行分析和檢測(cè)灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 9.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗(yàn)對(duì)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性分析。采用單因素方差分析對(duì)2 組之間的差異進(jìn)行比較分析，數(shù)據(jù)以平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SEM）表示，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DATS 對(duì)URSA 鼠胎盤組織中H2S 的含量的影響

為了研究DATS 能否影響URSA 鼠胎盤組織中H2S 的含量，課題組采用亞甲藍(lán)分光光度法檢測(cè)正常飼養(yǎng)的URSA 鼠胎盤組織和添加DATS 飼養(yǎng)的URSA 鼠胎盤組織中H2S 的含量表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組胎盤組織中H2S 含量（529.182 4±99.748 9）nmol/g 相比，實(shí)驗(yàn)組胎盤組織中H2S 的含量（777.492 2±72.975 9）nmol/g 顯著升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見(jiàn)圖1 。

圖1 2 組胎盤組織中H2S 含量比較Fig.1 Comparison of H2S content in two groups of placental tissue

2.2 DATS 對(duì)URSA 鼠胎盤組織中CD31 蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

為了研究DATS 對(duì)胎盤組織中CD31 表達(dá)的影響情況，課題組分別對(duì)2 組鼠胎盤組織中的CD31基因進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增后對(duì)2 組鼠胎盤組織中的CD31 蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組（0.0020±0.0004）比較，實(shí)驗(yàn)組（0.0042±0.0006）胎盤組織中CD31 的mRNA 表達(dá)水平顯著升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見(jiàn)圖2。

圖2 2 組胎盤組織中CD31 的蛋白相對(duì)表達(dá)量分析Fig.2 Analysis of the relative expression level of CD31 protein between two groups of placental tissues

2.3 DATS 對(duì)URSA 鼠胎盤組織中VEGFA 與VEGFR2 蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

為了進(jìn)一步了解DATS 對(duì)胎盤組織中血管生成因子VEGFA 及VEGFR2 的影響，課題組對(duì)2 組小鼠胎盤組織中的VEGFA 及VEGFR2 的mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果表明，與對(duì)照組（0.5200±0.0946）相比，實(shí)驗(yàn)組（0.7073±0.0677）胎盤組織中VEGFA 的mRNA 表達(dá)水平顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；與對(duì)照組（0.3984±0.047）相比，實(shí)驗(yàn)組（0.7304±0.1262）胎盤組織中VEGFR2 的mRNA 表達(dá)水平也顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見(jiàn)圖3。

圖3 2 組胎盤組織中VEGFA 及VEGFR2 的蛋白相對(duì)表達(dá)量分析Fig.3 Analysis of the relative expression levels of VEGFA and VEGFR2 proteins between two groups of placental tissue

3 討論

URSA 作為一種婦科常見(jiàn)病，目前病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚，治療手段及效果均不理想，已逐漸成為全球范圍內(nèi)婦產(chǎn)科醫(yī)師急需解決的生育難題[19]。URSA 患者的不良妊娠結(jié)局多發(fā)生于妊娠早期[20]，而妊娠本身涉及一個(gè)復(fù)雜、多因素調(diào)控的生理過(guò)程，良好的胎盤血管形成、發(fā)育及分布是維持正常胎盤功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是成功妊娠的基礎(chǔ)[21]。已有研究顯示胎盤血管發(fā)育異常可使母胎之間的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)受阻，最終導(dǎo)致胚胎著床失敗[22]。因此，良好的胎盤血管形成不僅影響胎盤自身的血流灌注，而且直接影響胚胎的著床與發(fā)育。

H2S 作為細(xì)胞內(nèi)普遍存在的第二信使，對(duì)胎盤血管生成和胎兒發(fā)育具有重要的價(jià)值[18]。動(dòng)物研究顯示通過(guò)抑制小鼠H2S 的生成后，可顯著抑制胎盤迷宮組織血管生成，導(dǎo)致小鼠胎兒體重的顯著降低，而在給予外源性H2S 后則可顯著緩解胎盤血管的發(fā)育異常及胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩（intrauterine growth retardation，IUGR）的發(fā)生[15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)H2S 可通過(guò)調(diào)控胎盤血管的生成及滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力，重構(gòu)子宮螺旋動(dòng)脈，直接影響胎盤的發(fā)育與胚胎的著床[15]，若上述調(diào)控出現(xiàn)異常，可導(dǎo)致胎盤早剝、胚胎停止發(fā)育及IUGR 等不良妊娠結(jié)局的發(fā)生[23]。在血管生成事件中，H2S 可通過(guò)多種途徑調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成[24]，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及成管[25]。然而，對(duì)于H2S 能否改善URSA 小鼠胎盤血管的生成及其可能存在的作用機(jī)制目前尚不清楚。因此，課題組首先通過(guò)構(gòu)建URSA 小鼠模型，通過(guò)外源性給予H2S 的供體DATS 后，觀察URSA 小鼠胎盤組織中H2S 水平的變化。研究結(jié)果顯示：添加DATS 飼養(yǎng)的URSA 小鼠胎盤組織中H2S 的水平顯著高于未添加組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。說(shuō)明通過(guò)外源性給予DATS 后，可以顯著提高胎盤組織中的H2S 水平。為今后臨床使用外源性H2S 補(bǔ)充胎盤組織中的H2S 水平提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

在血管生成過(guò)程中，CD31 與VEGF 發(fā)揮著非常重要的作用[26]。其中，CD31 作為內(nèi)皮細(xì)胞和血管細(xì)胞的表面分子標(biāo)志[27]，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞連接與細(xì)胞遷移，參與微血管的生成與崩解[28]。為了探討外源性H2S 供體DATS 是否對(duì)胎盤組織中的CD31 的mRNA 表達(dá)水平存在影響，本研究通過(guò)檢測(cè)DATS 處理后的URSA 小鼠胎盤組織中的CD31 的mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組胎盤組織中CD31 的mRNA 表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。說(shuō)明外源性H2S 供體DATS 能夠有效促進(jìn)URSA 小鼠胎盤血管的生成。這一結(jié)果與Smink AM 等[29]發(fā)現(xiàn)H2S 可顯著增加與誘導(dǎo)血管生成相關(guān)因子（如CD31、VEGF）的表達(dá)，從而促進(jìn)血管的生成的研究結(jié)果一致。VEGF 家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGFR-1、VEGFR-2 等，主要通過(guò)調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移能力，促進(jìn)血管形成與成熟[18]。VEGF 的異常表達(dá)可引起血管生成異常，并導(dǎo)致胚胎著床失敗[30]。現(xiàn)有研究顯示VEGFA是 VEGF/VEGFR 信號(hào)通路中最主要的調(diào)節(jié)因子，而VEGFR-2 作為 VEGFA 的主要受體，可介導(dǎo)VEGFA 的大部分下游分子的血管生成作用[31]。VEGFA/VEGFR-2 信號(hào)通路可通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)血管生成相關(guān)的下游信號(hào)通路刺激血管的生成[31]。為了探討H2S 對(duì)VEGFA/VEGFR-2 信號(hào)通路的影響，本研究通過(guò)檢測(cè)H2S 的供體DATS 處理后的URSA 小鼠胎盤組織中的VEGFA 及VEGFR2 的mRNA 表達(dá)水平，研究結(jié)果顯示：添加DATS 飼養(yǎng)的URSA 小鼠胎盤組織中VEGFA 及VEGFR2的mRNA 表達(dá)水平顯著均顯著高于未添加組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。說(shuō)明外源性H2S，DATS 能夠有效促進(jìn)URSA 小鼠胎盤組織中VEGFA 與VEGFR2 的mRNA 表達(dá)水平。這與Miaomiao Wang 等發(fā)現(xiàn)外源性H2S 的供體DATS可通過(guò)提高小鼠胎盤組織中 VEGFA 與VEGFR2的活性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成有關(guān)的研究結(jié)果一致[18]。

綜上所述，H2S 是調(diào)節(jié)血管生成的重要信號(hào)分子。在URSA 小鼠妊娠期間給予DATS 可顯著改善胎盤組織中的血管生成，其機(jī)制可能與H2S促進(jìn)胎盤組織中CD31、VEGF 的表達(dá)，并通過(guò)激活其VEGFA/VEGFR2 信號(hào)通路相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)可能為URSA 的治療提供了一個(gè)新的潛在的治療靶點(diǎn)，并為臨床應(yīng)用提供參考。