一測多評法同時測定丹參配方顆粒中7個酚酸類成分

鄺敏，嚴玉晶，林嘉明，汪梅，黃醒鵬，李玲，張正（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點試驗室，廣東 佛山 528244）

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，性微寒，味苦，具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰的功效。臨床上常用于胸痹心痛、膠腹脅痛、癥痕積聚、熱痹疼痛、心煩不眠、月經不調、痛經經閉、瘡瘍腫痛[1]。丹參含有二萜類、三萜類、酚酸類、黃酮類及生物堿類等化合物，其中脂溶性二萜類與水溶性酚酸類化合物是丹參的主要活性成分[2]。現代研究表明，酚酸類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗高血壓、抗動脈粥樣硬化、保護心肌細胞和抗胃潰瘍等藥理作用[3-8]。

丹參配方顆粒是在中醫藥理論指導下，用符合藥典標準的丹參飲片經現代工業水提、分離、濃縮、干燥、制粒而成的中藥產品；其性味、歸經、功效與丹參飲片一致，不含糖、防腐劑和其他賦形劑。用其代替丹參飲片供臨床配方使用，既保持了丹參飲片的藥性藥效，又具有免煎煮、易于調劑、方便服用等優點。中藥有效成分復雜多樣，單一指標成分評價難以準確反映中藥內在質量，具有一定的局限性。而多指標質量評價模式需要的對照品種類繁多，且部分對照品存在難分離、造價高、穩定性差等問題。王智民等[9]提出的一測多評（quantitative analysis of multicomponents by single-marker，QAMS）法是利用一種相對易得、廉價的對照品作為內參物，同時實現多個同類型化合物含量測定的多指標質量控制方法。該方法克服了對照品緊缺、檢測成本高等困難，適合中藥多指標質量評價檢測。丹參配方顆粒作為中藥新劑型在現代臨床被廣泛使用，但目前針對丹參配方顆粒整體質量控制的研究較少。因此，本試驗采用QASM法同時測定丹參配方顆粒中丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B的含量，以期為提高丹參配方顆粒整體質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Waters Arc型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Agilent 1290型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；XP26型百萬分之一天平、ME204E型萬分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Milli-Q Direct型超純水系統（德國Merck公司）；KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

對照品原兒茶醛（批號：110810-201909，純度：99.6%）、咖啡酸（批號：110885-201703，純度：99.7%）、迷迭香酸（批號：111871-202007，純度：98.1%）、丹酚酸B（批號：111562-201917，純度：96.6%）（中國食品藥品檢定研究院）；丹參素（批號：DSTDD001501，純度：98.79%，成都樂美天醫藥科技有限公司）；紫草酸（批號：wkq21031202，純度：99.31%，四川省維克奇生物科技有限公司）；丹酚酸E（批號：040169-202203，純度：97.75%，上海鴻永生物科技有限公司）。甲醇、乙腈為色譜純（德國Merck股份有限公司）；磷酸為色譜純（天津市科密歐化學試劑有限公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。12批丹參配方顆粒（編號：DS-1～DS-12）均由廣東一方制藥有限公司制備。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Xselect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，10%～20%A；15～40 min，20%～25%A；40～50 min，25%～30%A；50～51 min，30%～10%A；51～56 min，10%A）；流速：1.2 mL·min－1；柱溫：25℃；檢測波長：286 nm；進樣量：10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

分別取丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B對照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成質量濃度分別為50.699、10.558、2.161、11.300、19.777、20.100、108.540 μg·mL－1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取丹參配方顆粒適量，研細，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇100 mL，稱重，超聲處理（功率140 W，頻率42 kHz）30 min，取出，放冷，再稱重，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 分別精密吸取空白溶劑、混合對照品溶液及供試品溶液（編號DS-2），按“2.1”項下色譜條件進樣測定，結果見圖1。可見，供試品溶液色譜在與對照品溶液色譜相應的保留時間處具有相同的色譜峰，且空白溶劑無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 專屬性試驗HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of specific test

2.4.2 線性關系考察 分別精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、10 mL，置10 mL量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列質量濃度的混合對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以對照品溶液質量濃度（μg·mL－1）為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，結果見表1。可知7個成分在相應質量濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

表1 7個成分的線性關系考察結果Tab 1 Linearity of 7 components

2.4.3 精密度考察 分別精密吸取混合對照品溶液（丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B質量濃度分別為50.325、10.933、2.089、12.132、20.014、20.256、110.587 μg·mL－1）1.0、5.0、10 mL，置10 mL量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成低、中、高濃度的混合對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件分別連續進樣6次，計算色譜峰峰面積RSD，測定日內精密度；分別連續進樣6次，連續測定3 d，計算色譜峰峰面積RSD，測定日間精密度；結果7個成分低、中、高質量濃度日內精密度RSD在0.38%～2.1%，日間精密度RSD在1.2%～3.7%，表明方法日內精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗 取丹參配方顆粒（編號DS-2），精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在0、4、8、12、24、48 h進樣測定，計算得丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.43%、0.52%、1.3%、0.80%、1.2%、1.1%、0.28%，表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

2.4.5 重復性試驗 取丹參配方顆粒（編號DS-2），精密稱定，平行6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定。計算得丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B含量的RSD分別為1.5%、0.92%、2.3%、0.59%、2.3%、1.5%、0.60%，表明方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收試驗 取已知含有量的丹參配方顆粒（編號DS-2）適量，精密稱取9份，每份約0.1 g，置具塞錐形瓶中，分為3組，每組分別精密加入相當于含有量50%、100%、150%的混合對照品溶液，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算得到丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的平均加樣回收率均在97.50%～105.59%，RSD均小于5.0%，表明該方法準確度良好。

2.5 QAMS法的建立

2.5.1 相對校正因子（f）的確定 取“2.2”項下混合對照品溶液0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、10 mL，置10 mL量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，進樣測定，以原兒茶醛作為內參物，計算丹參素、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的相對校正因子。公式為fs/i＝fs/fi＝（As/Cs）/（Ai/Ci）＝（As×Ci）/（Ai×Cs），式中As為內參物峰面積，Cs為內參物濃度，Ai為某待測成分峰面積，Ci為某待測成分濃度[10]。計算得相對校正因子，結果見表2。

表2 6個成分的相對校正因子(n＝6)Tab 2 Relative correction factors of 6 components (n＝6)

2.5.2 不同測定儀器及色譜柱對相對校正因子的影響 以原兒茶醛為內參物，考察其他6個成分在不同高效液相色譜儀Waters Arc型、Agilent 1290型，以及不同色譜柱Waters Xselect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Athena C18-WP（250 mm×4.6 mm，5 μm）下的相對校正因子，結果見表3，各成分的相對校正因子RSD均小于3.0%，表明不同色譜系統和色譜柱對各成分相對校正因子無顯著影響。

表3 不同色譜儀和色譜柱對相對校正因子的影響(n＝3)Tab 3 Influence of instrument and column on relative correction factors (n＝3)

2.5.3 不同流速對相對校正因子的影響 以原兒茶醛為內參物，考察其他6個成分在不同流速（0.8、1.0、1.2、1.5 mL·min－1）下的相對校正因子，結果見表4，各成分的相對校正因子RSD均小于3.0%，表明不同流速對各成分相對校正因子無顯著影響。

表4 不同流速對相對校正因子的影響(n＝3)Tab 4 Influence of flow rate on relative correction factors (n＝3)

2.5.4 不同柱溫對相對校正因子的影響 以原兒茶醛為內參物，考察其他6個成分在不同柱溫（25、30、35、40℃）下的相對校正因子，結果見表5，各成分的相對校正因子RSD均小于3.0%，表明不同柱溫對各成分相對校正因子無顯著影響。

表5 不同柱溫對相對校正因子的影響(n＝3)Tab 5 Influence of column temperature on relative correction factors (n＝3)

2.5.5 不同進樣體積對相對校正因子的影響 以原兒茶醛為內參物，考察其他6個成分在不同進樣體積（5、8、10、12、15 μL）下的相對校正因子，結果見表6，各成分的相對校正因子RSD均小于5.0%，表明不同流速對各成分相對校正因子無顯著影響。

表6 不同進樣體積對相對校正因子的影響(n＝3)Tab 6 Influence of injection volume velocity on relative correction factors (n＝3)

2.6 待測成分色譜峰的定位

采用不同色譜儀及色譜柱測定時，待測成分的保留時間會有所波動，目前在QAMS研究中常用的色譜峰定位方法有相對保留值法、保留時間差法、時間校正法、對照提取物法等。本試驗采用相對保留值法，計算公式為ti/s＝ti/ts[11-14]。以原兒茶醛為內參物，考察其他6個成分在不同高效液相色譜儀（Waters Arc型、Agilent 1290型）及不同色譜柱[Waters Xselect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Athena C18-WP（250 mm×4.6 mm，5 μm）]下的相對保留值，結果見表7，各成分相對保留值的RSD＜3.0%，表明不同色譜系統和色譜柱對各成分相對保留值無顯著影響。

表7 不同色譜儀和色譜柱對相對保留值的影響(n＝3)Tab 7 Influence of instrument and column on relative retention time (n＝3)

2.7 外標法（ESM）和QAMS測定結果對比

取12批丹參配方顆粒適量（DS-1～DS-12），精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，分別采用QAMS和ESM法測定各成分含量，利用SPSS 26.0軟件對兩組結果進行Pearson相關系數（r）分析，結果見表8。兩種方法之間的r均為1.000，兩種方法計算的含量具有高相關性（P＞0.05）。使用QAMS和ESM法測定丹參配方顆粒中丹參素、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量，計算兩種測定方法下的相對誤差（RAD），RAD（%）＝[（QAMS計算值－ESM實測值）/外標法實測值]×100%[15]，結果顯示丹參素、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的相對誤差范圍分別為0.43%～0.53%、0.00%～3.70%、0.00%～0.34%、1.71%～2.01%、2.53%～2.93%、1.69%～1.73%，說明建立的丹參配方顆粒QAMS準確可行。

表8 6個成分的含量測定結果(n＝3，%)Tab 8 Content determination of 6 components (n＝3，%)

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇

本研究對供試品溶液的提取方式（超聲法、回流法）、提取溶劑（水、30%甲醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇）、提取時間（20、30、40 min）進行考察。結果表明，本研究供試品制備方法操作簡便，且供試品溶液色譜峰峰面積、分離度均較好。

3.2 色譜條件的選擇

本研究比較了甲醇、乙腈兩種有機溶劑和不同濃度的磷酸、甲酸、醋酸組合的流動相體系，發現使用乙腈作為有機相較甲醇洗脫能力強，峰分離度好，使用磷酸作為水相時色譜圖基線更平穩，噪音小。乙腈-0.05%磷酸洗脫時目標峰與相鄰雜質峰分離度均大于1.5，峰形良好，故采用該流動相系統。采用PDA檢測器在210～400 nm內對供試品溶液進行掃描，得到3D色譜圖，發現在286 nm時各組分的響應值較強，各待測成分色譜峰純度角均小于純度閾值，各色譜峰無雜質干擾，因此選擇286 nm作為檢測波長。

3.3 內參物的選擇

原兒茶醛相較于其他丹參酚酸類成分化學性質穩定，對照品價廉易得，且使用HPLC法測定時響應值高[16]，因此本次研究選擇原兒茶醛為內參物，保證所建立方法穩定可靠，同時達到降本增效的目的。

4 結論

本研究建立QAMS法同時測定丹參中7個酚酸類成分，所選用的內參物原兒茶醛化學性質穩定、來源充足，供試品溶液制備方法簡便，可用于快速定量制劑中的各指標成分，全面反映丹參配方顆粒的內在質量。各色譜峰分離度好，通過方法學驗證、相對校正因子確認、耐用性考察、色譜峰的定位等過程驗證，證明建立的方法科學可靠，穩定性良好，可為丹參配方顆粒的整體質量控制和質量評價提供參考。