衍生化高效液相色譜法測定醋酸西曲瑞克中10種手性氨基酸的含量

韓承剛，李明顯，姬麗芳，沙向陽，鄭楓*（1. 中國藥科大學藥物分析教研室，南京 211198；2. 浙江省原料藥安全研究中心（工藝技術創新平臺），杭州 10018；. 南京銳志生物醫藥有限公司，南京 211100）

醋酸西曲瑞克（cetrorelix acetate）是一種由10個氨基酸組成的人工合成多肽（絕對構型見圖1），是第三代促性腺激素釋放激素拮抗劑的代表，可以促排卵獲取適當數量的高質量成熟卵母細胞[1]。

圖1 西曲瑞克的絕對構型（來源于SciFinder，CAS：120287-85-6）Fig 1 Absolute configuration of cetrorelix acetate（obtained from SciFinder，CAS：120287-85-6）

多肽類藥物的生物活性與其氨基酸的手性密切相關。在研究醋酸西曲瑞克一級結構時，需要將多肽在6 mol·L－1的鹽酸和110℃條件下反應，該過程可能會引起手性氨基酸發生外消旋化[2-3]。2023年2月藥品審評中心（CDE）發布的《化學合成多肽藥物藥學研究技術指導原則》（試行）版中，對含有手性中心的氨基酸提出需要控制其異構體的要求，因此有必要對多肽合成中手性氨基酸的含量進行研究和控制。目前各國藥典未見收載醋酸西曲瑞克的質量標準，關于其質量研究的文獻報道也較少[4-6]。

除含芳環結構的氨基酸外，絕大多數氨基酸不含發色基團，因此一般需經衍生化反應處理。柱前衍生化法是利用衍生試劑與氨基酸反應形成非對映體衍生產物的方法。目前已有文獻報道了多種衍生化試劑用于氨基酸及胺類化合物的分析檢測，包括Marfey試劑、2，4-二硝基氟苯、（FDNB）、熒光胺（FA）、鄰苯二甲醛（OPA）、異硫氰酸苯酯（PITC）、丹磺酰氯等[2，7-9]。許多衍生試劑具有一定的局限性，例如不能分離手性氨基酸、衍生物性質不穩定、氨基酸衍生物的可檢測性差等[10]。其中Marfey試劑具有強紫外吸收官能團，衍生產物專屬性、穩定性強，衍生操作簡便等優點[2]。因此本文開發了一種基于Marfey法，采用常規反相HPLC即可對醋酸西曲瑞克水解后10種氨基酸的構型及含量進行測定的方法，以期為醋酸西曲瑞克的結構確證提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC-20AD XR高效液相色譜儀（配有LC-20AD XR二元泵、SIL-20A XR自動進樣器、CTO-20A柱溫箱、SPD-20A紫外檢測器，日本島津有限公司）；Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra AM質譜儀（液相U3000 DAD檢測器，美國賽默飛世爾科技）； XS205DU/A 電子分析天平（d＝0.01 mg），S210-K pH計[梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司]；TGL-16B高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；DHG-9070A、DHG-9140A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 試藥

L-精氨酸（L-Arg，純度：99%，批號：H2113190）、D-精氨酸（D-Arg，純度：98%，批號：D2114171）、3-（3-吡啶基）-D-丙氨酸（D-Pal，純度：98%，批號：A1921075）、L-酪氨酸（L-Tyr，純度：98%，批號：E1811066）、D-酪氨酸（D-Tyr，純度：98%，批號：F2118400）、L-絲氨酸（L-Ser，純度：99%，批號：H1908018）、D-絲氨酸（D-Ser，純度＞98.5%，批號：J2123636）、L-脯氨酸（L-Pro，純度：99%，批號：J2012169）、D-脯氨酸（D-Pro，純度：99%，批號：B2108066）、L-丙氨酸（L-Ala，純度：99%，批號：G2110117）、D-丙氨酸（D-Ala，純度：98%，批號：K1906051）、L-亮氨酸（L-Leu，純度：99%，批號：K2002002）、D-亮氨酸（D-Leu，純度：99%，批號：J2111318）、L-4-氯苯丙氨酸（L-Phe，純度：98%，批號：G1809096）、D-4-氯苯丙氨酸（D-Phe，純度：95%，批號：E1529076）、L-3-（2-萘基）-丙氨酸鹽酸鹽（L-Nal，純度：95%，批號：H2205521）、D-3-（2-萘基）-丙氨酸（D-Nal，純度：98%，批號：F2117074）（阿拉丁）；D-瓜氨酸（D-Cit，純度：98%，批號：C10929512，麥克林）；3-（3-吡啶基）-L-丙氨酸鹽酸鹽（L-Pal，純度：95%，批號：H2205521，畢得醫藥）；L-瓜氨酸（L-Cit，純度：98%，批號：LI20V67，百靈威）；乙腈（色譜級，批號：21115279，TEDIA）；甲酸（色譜級，批號：J2027128，阿拉丁）；Nα-（2，4-二硝基-5-氟苯基）-L-亮氨酰胺（L-FDLA，色譜級，批號：K28OK-OQ，TCI）；DMSO（色譜級，批號：EA617-CN，Honeywell）；鹽酸（分析級，批號：220707328F，南京化試股份有限公司）；氫氧化鈉（分析級，批號：20210813）、碳酸氫鈉（分析級，批號：200523674X）（國藥集團化學試劑有限公司）；實驗用水（杭州娃哈哈集團有限公司）；醋酸西曲瑞克供試品（南京銳志生物醫藥有限公司，批號：XQRK-210801、XQRK-210901、XQRK-210902）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hedera ODS-2 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.065%的甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，洗脫程序見表1；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：35℃；進樣量：10 μL；波長：340 nm。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 質譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子模式采集；噴霧電壓：4000；鞘氣體壓力：35 psi；離子掃描氣體壓力：0.5 psi；輔助氣壓力：5 psi；毛細管溫度：350℃；套管透鏡補償電壓：44 V；源內碰撞解析電壓：0 V；碰撞壓力：0 psi。

2.3 溶液配制

2.3.1L-FDLA溶液 取L-FDLA適量，加二甲基亞砜溶解制成約1.0 g·L－1的溶液。

2.3.2 手性氨基酸對照品溶液 精密稱取組成醋酸西曲瑞克的10種氨基酸對照品適量，加適宜溶劑溶解，得到濃度為1.0 mmol·L－1的儲備液。用0.1 mol·L－1的鹽酸或0.1 mol·L－1的氫氧化鈉溶液調節pH至7.0左右，最終得到濃度為40μmol·L－1的溶液。

2.3.3 手性氨基酸及對映異構體氨基酸混合對照品溶液 精密稱取各氨基酸及其對映異構體對照品適量，加適宜溶劑溶解，得到濃度為0.5 mmol·L－1的儲備液。用0.1 mol·L－1的鹽酸或0.1 mol·L－1的氫氧化鈉溶液調節pH至7.0左右，最終得到濃度為20 μmol·L－1的溶液。

2.3.4 供試品溶液 精密稱取醋酸西曲瑞克適量，用6 mol·L－1的鹽酸溶液溶解并稀釋制成濃度為1.0 mmol·L－1的溶液，充氮后密封，置110℃烘箱中水解8.0 h后取出，放冷，啟封，用2 mol·L－1的氫氧化鈉溶液和0.1 mol·L－1的氫氧化鈉溶液調節pH至7.0左右，最終得到濃度為40 μmol·L－1的溶液。

2.3.5 衍生化空白溶液 精密量取調節pH至7.0左右的水溶液125 μL置1.5 mL聚丙烯管底部，加入0.1 mol·L－1的碳酸氫鈉溶液10 μL與1.0 g·L－1的L-FDLA衍生試劑100 μL，混勻，置37℃電熱鼓風干燥箱中1 h后，取出，加入0.1 mol·L－1的鹽酸溶液10 μL終止反應；于離心機上12 000 r·min－1離心10 min，取上清液得到衍生化空白溶液。

2.3.6 衍生化操作 精密量取氨基酸對照品溶液125 μL置1.5 mL聚丙烯管底部，加入0.1 mol·L－1的碳酸氫鈉溶液10 μL與1.0 g·L－1的L-FDLA衍生試劑100 μL，混勻，置37℃電熱鼓風干燥箱中1 h后，取出，加入0.1 mol·L－1鹽酸溶液10 μL終止反應；于離心機上12 000 r·min－1離心10 min，取上清液得到衍生化對照溶液。衍生化供試品溶液、手性氨基酸及對映異構體氨基酸混合對照品溶液同法進行衍生化操作。

2.4 高效液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）鑒定與液相專屬性

10種氨基酸衍生物LC-MS/MS鑒定結果見表2。

表2 正離子模式檢測中10種衍生化氨基酸的相關參數和LC-MS/MS特性Tab 2 Related parameters and LC-MS/MS characteristics of 10 derived amino acids in positive mode detection

分別精密量取衍生化空白溶液、衍生化對照品溶液、衍生化供試品溶液和衍生化手性氨基酸及對映異構體氨基酸混合對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果顯示組成醋酸西曲瑞克的10種手性氨基酸及其對映異構體不會受到空白干擾；衍生化對照品溶液中，各氨基酸衍生物峰與相鄰峰之間的最小分離度為1.19；2份衍生化對照品溶液的含量匹配應在96%～105%；第一份衍生化對照品溶液連續進樣5針，各氨基酸衍生物峰校正因子RSD均不大于0.8%，表明進樣精密度良好；衍生化供試品溶液中，其他峰不干擾各目標氨基酸衍生物峰的測定；該方法專屬性良好，典型色譜圖見圖2。

圖2 醋酸西曲瑞克水解后氨基酸含量測定的典型色譜圖Fig 2 Typical chromatogram for content determination of amino acid after hydrolysis of cetrorelix acetate

2.5 檢測限和定量限

精密移取“2.3.2”項下氨基酸對照品溶液，逐級稀釋合適倍數后同“2.3.6”項下進行衍生化處理后進樣，分別將信噪比（S/N）≥3和10的濃度作為檢測限（LOD）和定量限（LOQ）（見表3）。結果10種氨基酸衍生物的LOD和LOQ的濃度均分別為0.68 μmol·L－1和2.04 μmol·L－1。取LOQ濃度衍生化溶液連續進樣6針，氨基酸衍生物峰面積RSD＜4.2%，保留時間的RSD＜0.20%，結果表明定量限測定精密度良好。

表3 10種氨基酸衍生物的LOD與LOQ的信噪比Tab 3 LOD and LOQ of 10 amino acid

2.6 線性與范圍

精密移取“2.3.2”項下氨基酸對照品儲備液，依次制備成10.20、16.33、20.41、22.45、24.49μmol·L－1系列濃度的線性測試溶液。照“2.3.6”項下方法分別進行衍生化處理，進樣分析，以峰面積為縱坐標，摩爾濃度為橫坐標，作圖并進行線性回歸，結果表明組成醋酸西曲瑞克的10種氨基酸衍生物在10.20～24.49 μmol·L－1與峰面積線性關系良好，r值均大于0.991。

2.7 重復性與中間精密度試驗

按“2.3.5”和“2.3.6”項下方法分別配制衍生化空白溶液、衍生化對照品溶液及平行6份衍生化供試品溶液，進行重復性考察，結果組成醋酸西曲瑞克的10種氨基酸衍生化后的含量RSD在0.41%～0.90%，表明重復性良好。不同分析人員在不同日期重復上述試驗，考察方法中間精密度，結果組成醋酸西曲瑞克的10種氨基酸衍生化后含量RSD在0.23%～1.6%。精密度試驗中組成醋酸西曲瑞克的10種氨基酸衍生化后含量RSD在0.46%～5.8%，表明方法中間精密度良好。

2.8 穩定性試驗

按“2.3.6”項下方法分別配制衍生化空白溶液、衍生化對照品溶液及衍生化供試品溶液，于室溫放置0、11、14、17、22、40 h后進樣分析，記錄各氨基酸衍生化后的峰面積并計算供試品中各氨基酸衍生物的含量。結果顯示對照品溶液中組成醋酸西曲瑞克的10種氨基酸衍生化后的峰面積RSD均低于1.8%；水解供試品溶液中10種氨基酸衍生后產物的含量RSD均低于1.8%，表明在40 h內溶液穩定性良好。

2.9 耐用性考察

改變流動相中甲酸添加量（%）、流速（mL·min－1）、柱溫（℃）以考察環境的微小變動對方法測定結果的影響，結果發現在各個色譜條件下10種氨基酸的檢測均不會受到干擾，衍生化對照品溶液中，各氨基酸校正因子RSD均低于2.7%，峰與峰之間的最小分離度均不小于1.0；各條件下供試品溶液中各氨基酸含量的RSD均低于6.9%，方法耐用性良好，具體結果見表4。

表4 耐用性結果Tab 4 Durability test

2.10 樣品檢測

分別取3批醋酸西曲瑞克樣品（批號：XQRK-210801、XQRK-210901、XQRK-210902）進行檢測，結果各批次組成醋酸西曲瑞克的10種氨基酸衍生物含量均在83.5%～109.5%內，見表5。

表5 10種氨基酸在3批醋酸西曲瑞克供試品中的檢測結果(%)Tab 5 10 amino acids in 3 batches of cetrorelix acetate (%)

3 討論

3.1 衍生條件的選擇

對影響L-FDLA與氨基酸反應的因素進行了考察。分別在37、50、60℃下反應相同時間，或在相同溫度下分別反應0.5、1.0、1.5 h，結果顯示反應溫度越高，衍生物峰面積越大，但是溫度高于37℃后，衍生試劑產生的雜質會顯著干擾樣品峰的測定，在37℃左右反應1.0 h時沒有明顯干擾；反應時間越長衍生物峰面積越大，考慮到試驗效率結合文獻[11]已報道的方法（Marfey試劑在與L型與D型氨基酸的α-氨基在40℃堿性條件下反應1 h后，不會產生外消旋產物），決定反應時限定為1.0 h。對10種氨基酸總摩爾之和與L-FDLA的用量摩爾比（1∶1～1∶10）進行考察，結果顯示摩爾比在1∶5左右時即可達到最大產率。

3.2 水解條件摸索

取醋酸西曲瑞克的6 mol·L－1鹽酸溶液，分別在110℃加熱4、6、8、12、24 h后測定。結果選取多數氨基酸能較大程度水解且變化趨勢較平穩的8 h作為水解終點時間。在8 h時，組成醋酸西曲瑞克的10種氨基酸外消旋化程度小，結果見圖3。

圖3 醋酸西曲瑞克水解時間與衍生化產物峰面積的關系Fig 3 Relationship between hydrolysis time and peak area of derivatization products

3.3 色譜條件的選擇

在C18色譜柱上考察了不同流動相系統對醋酸西曲瑞克水解產生的氨基酸衍生物的分離效果。結果以甲醇-水系統作為流動相時部分氨基酸有拖尾現象，且分離度小于1.0；改用乙腈-磷酸鹽系統作流動相時，調節pH、柱溫、梯度或者更換色譜柱都無法使所有氨基酸分離度均大于1.0；最終選取乙腈-甲酸水體系，甲酸添加量為0.065%左右時，能使所有氨基酸達到良好的分離效果，且峰形良好。

3.4 質譜結果討論

瓜氨酸每種構型都產生的兩個雜質衍生產物峰m/z（M＋H）＝427.18，符合鳥氨酸衍生后分子量，推測反應過程見圖4A；酪氨酸產生的保留時間約46.0 min的副產物峰m/z（M＋H）＝770.77，符合酪氨酸雙衍生物的分子量，見圖4B，該產物與文獻報道結果相符[12]。此外，衍生試劑產生的最大副產物m/z（M＋H）＝313.10，推測是L-FDLA的氟原子在堿性條件下水解為羥基形成的化合物，見圖4C。

圖4 4種鳥氨酸衍生物（A）、酪氨酸雙衍生物（B）與衍生試劑水解產物（C）示意圖Fig 4 Schematic diagram of 4 ornithine derivatives（A），Bis-Mar-Tyr（B），and hydrolysate of L-FDLA（C）

3.5 含量測定結果討論

D-Cit衍生物含量測定結果偏差較大，推測是D-Cit在水解條件下被破壞成了鳥氨酸而產生損失；D-Phe偏差較大的原因暫且未知；其他氨基酸衍生物含量在90%～110%內，無明顯異構體產生。

3.6 總結與展望

本文建立了一種能夠排除對映異構體氨基酸的干擾從而準確測定醋酸西曲瑞克產生的10種手性氨基酸含量的方法；該方法高效、簡便，僅用液相色譜系統結合普通C18色譜柱就能完成測定，可為多肽藥物的手性氨基酸含量測定提供參考。