治療誘導性衰老在膠質母細胞瘤中的研究進展

曾女金，邢孟韜，何玲（中國藥科大學藥學院，南京 211198）

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是一種常見的腦腫瘤，惡性程度高，被世界衛生組織歸類為Ⅳ級膠質瘤，年發病率約4.03/10萬[1]。目前針對膠質瘤的治療以最大程度手術切除為主，輔以放化療。但綜合治療后，大多數患者仍在相對較短的時間內復發，且復發腫瘤往往更具侵襲性和耐藥性，導致患者預后不良，中位生存期少于兩年[2]。減少GBM復發是亟待解決的臨床問題。

DNA損傷性化療藥物和輻照可能引起腫瘤細胞和非腫瘤細胞的衰老，這種現象被稱為治療誘導性衰老（therapy-induced senescence，TIS）[3]。GBM具有高侵襲性，雖然目前對GBM的最大安全性切除通常包括腫瘤以外的區域，但切除邊緣仍可能存在殘留GBM細胞[4]。浸潤到正常組織中的腫瘤細胞在放化療作用下被誘導衰老，生長增殖受到抑制，使患者受益。但越來越多的臨床及臨床前研究證據表明，放化療會引起腫瘤和正常組織中衰老細胞累積，持續增加的衰老細胞可能分泌多種促腫瘤因子，誘導GBM復發[5-6]；且殘留GBM細胞在治療壓力誘導的衰老狀態下可能轉化為對治療有更高抗性的分子亞型，產生惡性更強的復發腫瘤[7-8]，引起患者不良預后，表現出比初發時更高的轉移率和病死率。基于衰老細胞在腫瘤治療中的雙重作用，完善TIS有關治療策略成為眾多科學家關注的焦點。本文就TIS對GBM治療的影響作一綜述，旨在為降低GBM復發和研發GBM治療藥物提供參考。

1 放化療引起GBM細胞衰老

細胞衰老（cellular senescence）是發生在二倍體細胞中的一種穩定的細胞周期停滯現象，最早于19世紀60年代由Hayflick和Moorhead提出[9]。體外培養的人成纖維細胞在連續培養50～70代后即喪失增殖能力并進入生長停滯狀態，達到“Hayflick極限”，這種衰老類型被命名為復制型衰老（replicative senescence）。除復制型衰老外，在各種壓力刺激下，細胞也會發生衰老，這種衰老沒有明顯端粒缺失，被命名為早衰，TIS就是早衰的一種[3]。

放化療引起GBM細胞廣泛發生衰老。替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是治療GBM的一線化療藥物，通過誘導O6-甲基鳥嘌呤（O6-methylguanine，O6MeG）發揮細胞毒性作用，誘導DNA雙鏈斷裂和細胞死亡。關于替莫唑胺的作用機制研究發現，除誘導凋亡和自噬外，替莫唑胺還可引起膠質瘤細胞大量發生衰老[10]。近期的一項研究指出，使用替莫唑胺處理GBM細胞后，衰老細胞逐漸增多，第8日時達到80%，是凋亡細胞數量的4倍，這表明衰老可能是TMZ治療后的主要反應[4]。同樣，輻照放療也會誘導細胞衰老[11-12]，實驗發現輻照導致60%～80%的GBM細胞生長停滯，進入衰老狀態，白細胞介素（IL）-6、IL-1α、IL-1β等衰老相關因子表達增加，NF-κB途徑被激活。

通常而言，TIS以一種細胞自主調控的方式限制DNA損傷細胞的增殖，從而阻止腫瘤發展。因此，以各種治療手段加速腫瘤細胞的衰老成為既往腫瘤治療的一大理論基石。各種臨床常見的化療藥物，如烷化劑、鉑類等藥物，都是常見的細胞衰老誘導劑；部分分子靶向藥物也可導致細胞衰老，達到治療腫瘤的目的[13]。然而，隨著腫瘤研究的深入，TIS帶來的潛在問題逐漸暴露。腫瘤細胞經化療或放射治療后進入衰老狀態，衰老腫瘤細胞通過退出細胞周期來躲避化療藥物的直接細胞毒性作用，可能在治療結束后幸存，進入蟄伏狀態，伺機而動，引起腫瘤復發。

2 治療壓力誘導衰老細胞重編程

衰老在過去一直被認為是一種不可逆轉的生長停滯狀態，但最近的研究表明，一些已表現出衰老的腫瘤細胞亞群可能逃逸衰老，恢復增殖能力，且恢復的細胞可能比親本細胞群更具侵襲性[14]。基于大規模的表觀遺傳重編程和增強的可塑性，衰老的腫瘤細胞可能在治療壓力下進化，獲得更惡性的表型特征，出現治療抗性，進而引起腫瘤復發。替莫唑胺誘導的DNA損傷是引起GBM細胞發生衰老的主要觸發因素，該過程由MRN-ATR-CHK1途徑的激活引發，并依賴于CDC25c降解[15]，此外該過程還伴隨著E2F1/DP1復合物的破壞，導致DNA修復因子EXO1、MSH2、MSH6和RAD51的下調，進而引起DNA錯配修復和同源重組下調。DNA損傷修復能力下降，積累遺傳改變，可能阻礙衰老的誘導和維持，包括CDKN2A純合子丟失，或TP53相關途徑突變[14]。

還有研究揭示，TIS可能通過促進細胞重編程誘導干性表型來推動腫瘤生長[16-17]。衰老的關鍵組件，如p16INK4a、p21CIP1、p53以及組蛋白H39號位賴氨酸處的三甲基化（H3K9me3）等，也是調節細胞干性的關鍵因子，表明細胞衰老和細胞干性由重疊的信號網絡共同調節[16]。衰老相關的干細胞是一種意料之外的細胞自主特征，在逃離細胞周期阻滯后表現出高侵襲性的生長潛力，并在復發腫瘤中富集。根據基因特征，膠質母細胞瘤干細胞（glioblastoma stem cells，GSCs）可分為前神經型（proneural GSCs，pGSCs）和間質型（mesenchymal GSCs，mGSCs）[18]。在腫瘤治療中，原發性GBM會傾向于發生原神經-間質轉化（proneural-mesenchymal transition，PMT）[19]，pGSCs在放化療期間，原神經樣相關特征（如CD133、OLIG2）減少，間充質樣基因特征（如CD44、YKL40）上調，轉化為mGSCs，且復發GBM中mGSCs顯著增加。PMT過程是GBM復發的關鍵因素[20]，包含多個信號通路的激活，涉及NF-κB、Notch1、C/EBP-β等關鍵調節因子。有趣的是，這些信號通路也在TIS中被激活[21]，提示GSCs的PMT過程與衰老相關基因表達特征具有相似性。衰老細胞重編程可能促進GSCs發生干細胞亞型轉化，侵襲性增強，惡性程度變高，導致復發和患者不良預后。

3 治療誘導腦內衰老細胞積累

除了對腫瘤細胞的影響外，放化療手段也可能引起腦中非腫瘤細胞發生衰老[6]。星形膠質細胞是大腦中最豐富的細胞類型，研究發現，放療會引起小鼠大腦中廣泛的細胞衰老[22-24]，尤其是星形膠質細胞的衰老，且輻照后衰老的星形膠質細胞促進了小鼠膠質瘤的生長，侵襲性增強。衰老基質細胞通過分泌多種促腫瘤因子，促進鄰近腫瘤細胞的生長，包括生長因子、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分等。比如衰老星形膠質細胞過量分泌肝細胞生長因子（HGF），激活間質表皮轉化因子（cellular-mesenchymal to epithelial transition factor，c-MET），促進腫瘤細胞在體外的遷移和侵襲；衰老星形膠質細胞也會產生過量的纖連蛋白，促進細胞存活和侵襲[22]。衰老星形膠質細胞分泌的IL-6和IL-8，可以激活膠質瘤細胞中的NF-κB和STAT3信號傳導，以維持其干性并促進其侵襲性。此外，研究發現星形膠質細胞體外誘導衰老后，其培養基中c-Myc水平升高，當與GBM細胞共培養時，增加的c-Myc可以促進GBM細胞增殖，并提高后者對替莫唑胺的耐藥性[25]。總之，衰老基質細胞可能通過旁分泌作用促進腫瘤復發，且導致復發腫瘤的治療抗性。

膠質母細胞瘤常發生于年齡較大的人，其中確診為異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）野生型腫瘤的患者中位年齡是62歲[5，26]。確診時的年齡與生存率成負相關，這種不良預后主要歸因于腫瘤切除程度以及與高齡相關的體質虛弱或恢復不佳，但有學者指出這可能在一定程度上也與大腦老化有關[5]。腦中增多的衰老細胞既是人衰老的原因，也促進了癌癥的發展，且年齡相關性炎癥已在多種腫瘤的發生發展中被證明[27]。矛盾的是，放射治療和各種抗癌化療藥物引起腫瘤細胞和非腫瘤細胞的衰老，造成組織內衰老細胞大量增加；且TIS會降低免疫系統對衰老腫瘤細胞的去除效率，進一步導致衰老細胞在腫瘤和治療小鼠的正常組織中積累[3]。這意味著當對GBM患者采用放化療手段治療時，本身就可能會誘導其腦部衰老細胞的增加，這可能導致進一步的不良預后，包括復發。

4 衰老相關分泌表型的雙重作用

衰老細胞具有增強的分泌活性，產生衰老相關分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP），包括炎癥介質、生長因子、MMPs等[3，27]。在治療早期，通過SASP，衰老細胞可以旁分泌誘導鄰近細胞衰老，起到阻止腫瘤生長的屏障作用。且SASP由多種趨化因子和細胞因子組成，可激活免疫監視，并帶來先天性和適應性免疫反應，清除衰老和增殖的腫瘤細胞，增強衰老對腫瘤的抑制能力。

但隨著衰老細胞的增多以及衰老進程的加速，持續激活的SASP信號可能反過來促進腫瘤的發生和發展。SASP中有多種炎性因子，過量釋放的炎性因子可能引起局部和全身的炎癥，促進多種疾病發展（包括腫瘤），引起患者不良預后[28-29]。SASP中的多種因子有促腫瘤的特性，如MMP3可以促進腫瘤侵襲；血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可以促進腫瘤血管生成。SASP的持續激活還能重塑腫瘤微環境，促進腫瘤發生發展，引起GBM復發[30]。在異種移植小鼠模型中，與僅注射未照射的對照細胞相比，聯合注射經照射的、衰老的原代GBM細胞和未照射的GBM將產生更大的、侵襲性更強的腫瘤塊[31]。另外，研究發現，當衰老細胞出現在疾病后期時，SASP會抑制免疫監視，幫助衰老逃逸，從而促進腫瘤復發和轉移[3]。

5 GBM治療的新方向

衰老和SASP在腫瘤治療中是一把雙刃劍，如何更好地發揮TIS在腫瘤治療中的抑癌作用而避免其促癌作用，是目前完善腫瘤治療方案的關鍵。衰老細胞的持續存在和SASP的負面作用是主要問題，因此多項研究開始聚焦于選擇性清除衰老細胞或減少衰老細胞的產生，衰老消融劑（senolytics），是一類選擇性清除衰老細胞的藥物[32-33]，包括靶向性小分子化合物和天然化合物。

5.1 BCL-2蛋白家族抑制劑

細胞在治療壓力下發生衰老，相較于發生凋亡這種直接的細胞死亡，是一種更溫和的細胞反應。此時細胞雖周期停滯，但仍保持較高的代謝水平和細胞活力[14]。實際上，凋亡抗性是衰老細胞的特征之一，可能有助于它們在衰老組織和化療后積聚。NF-κB在衰老細胞中被激活，誘導抗凋亡因子產生，抑制腫瘤細胞凋亡，保持細胞活力和代謝。BCL-2蛋白家族，包括Bcl2、BclW、Bcl-XL和Mcl-1，在細胞死亡相關過程（包括自噬和凋亡）中起核心作用，在衰老細胞中表達上調[34]；因此，針對這些蛋白的化合物作為衰老消融劑被廣泛研究。研究顯示，BCL-2家族抑制劑顯示出緩解年齡相關疾病（如腫瘤）的潛力[33]。ABT-737是最早發現的BclW/Bcl-XL抑制劑之一，它能在體內和體外優先誘導衰老細胞的凋亡[35]。然而，ABT-737的口服利用度較低，于是一種可口服類似物ABT-263（Navitoclax）被開發出來，并作為第一代Bcl2/Bcl-XL抑制劑進入臨床試驗[36]。無論是替莫唑胺還是輻照誘導的衰老GBM細胞系，都可以被ABT-263選擇性地清除[14]。實驗揭示，當對C57BL6/J小鼠輻照一段時間后再移植腫瘤，與對照組相比，預先使用ABT-263消除衰老細胞的小鼠腫瘤生長更慢，存活期更長[22]。

5.2 p53再激活

p53是一種常見的腫瘤抑制蛋白，激活的p53會誘導細胞周期停滯在G1、G2和S期，以便基因組DNA在合成受損時有時間修復自己，從而防止異常細胞增殖和保護癌基因應激的基因組完整性[37]。恢復細胞核內p53的水平被認為是治療多種癌癥的潛在方法，包括GBM[38]。小鼠雙微體擴增基因2（mouse double minute 2，MDM2）誘導p53降解，其抑制劑可以有效恢復p53水平，盡管這種作用僅在具有MDM2擴增和突變型TP53的GBM（8%～10%）中有效[38]。FOXO4（Forkhead box protein O4）可以螯合p53以促進周期停滯并阻止其引發細胞凋亡[39]。實驗發現，使用細胞穿透性阻斷肽可以從FOXO4中解離p53，使之重定位到線粒體，繼而引起半胱天冬酶依賴性凋亡[40]。但FOXO4-p53干擾是否能在GBM中起作用仍有待驗證。

5.3 HSP90抑制劑

熱休克蛋白90（heat shock protein，HSP90）是一種常見的分子伴侶，已被證明在包括GBM在內的多種癌癥中發揮著促腫瘤的作用[41]。2017年，HSP90抑制劑首次被發現能作為一種衰老消融劑殺傷衰老癌細胞[42]，其機制是抑制HSP90對客戶蛋白的穩定作用，從而抑制客戶蛋白的促衰老癌細胞存活信號。HSP90抑制劑作為抗GBM藥物已被廣泛研究，但這主要是基于其在抑制GBM細胞活力和增殖方面的作用，其在GBM中清除衰老細胞的作用目前還沒有報道。根據現有證據，我們有理由認為HSP90抑制劑可以作為替莫唑胺的輔助藥物，改善臨床治療效果。

5.4 活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除劑

ROS水平升高對于誘導和維持細胞衰老狀態具有潛在的關鍵作用[43]。放化療通常引起腫瘤細胞和基質細胞DNA損傷，導致ROS等自由基水平增加，進而引起氧化應激反應，進一步導致衰老發生。高水平的ROS可直接作用于DNA，觸發DNA損傷反應及激活NF-κB、MAPK等通路，引起衰老。ROS還可能促進腫瘤的上皮-間充質轉化過程和干性的獲得，促進腫瘤發生發展[44]。研究發現，與對照組細胞相比，使用替莫唑胺誘導衰老后的細胞中ROS水平顯著上調[4]。清除ROS、NO等自由基，降低氧化應激反應可能是減少衰老細胞產生，改善GBM治療效果的有效手段。

5.5 天然化合物

幾種植物來源的天然化合物也展示出有效清除衰老細胞的作用，且這些化合物具有低毒性的優勢，表現出轉化為臨床藥物的巨大潛力[32]。達沙替尼是已被美國FDA批準用于治療白血病的藥物，是一種酪氨酸激酶抑制劑，它可以通過選擇性抑制Src激酶促進腎上腺素受體依賴的細胞凋亡[32，45]。當達沙替尼和槲皮素（一種天然類黃酮）聯合使用時，可以有效殺死衰老細胞，緩解小鼠早衰癥狀，改善年齡相關疾病，如阿爾茨海默病[32，45]。非瑟汀（fisetin）是一種存在于多種蔬菜和水果的天然類黃酮，新的一項研究揭示非瑟汀可以有效降低替莫唑胺誘導的衰老細胞數量。同樣作用的還有青蒿琥酯，一種青蒿素的半合成衍生物。姜黃素作為衰老清除劑的相關研究也有很多，其已被證明在腦相關疾病和癌癥中發揮有益作用。白藜蘆醇也被證明可通過加強替莫唑胺誘導的膠質瘤細胞衰老來起作用[14]。此外，白藜蘆醇和其他多酚能夠抑制ROS的形成并限制神經元中的細胞衰老[45]，從而減少衰老基質細胞對GBM的促進作用。

抗衰老治療的相關靶點總結見表1。

表1 抗衰老治療在GBM中的潛在靶點Tab 1 Potential targets for anti-senescence therapies against GBM

6 結語

隨著對腫瘤發生發展認識的逐步加深，細胞衰老在腫瘤治療中的負面影響逐漸引起研究者的重視，尤其是持續存在的衰老細胞。GBM具有高度可塑性，在治療壓力下可能發生表型轉變，逃逸衰老后引起更惡性的復發腫瘤；且TIS引起腫瘤和非腫瘤細胞的分泌表型改變，可能建造促腫瘤生長的微環境，誘導殘留病灶復發，給GBM的治愈造成極大的困難。目前，抗衰老治療在GBM中存在較多空白，相關藥物是否安全有效有待進一步研究。了解不同類型的衰老及其在殘留病灶中的作用，以開發抗衰老療法來對抗化療和放射治療引起的耐藥性，是未來治療GBM，提高患者生存率有希望的途徑。