川西獐牙菜藥物代謝動力學和質量控制研究進展

杜茜，張珍源，陳西敬，趙娣（中國藥科大學基礎醫學與臨床藥學學院，南京 211199）

川西獐牙菜又稱藏茵陳，是龍膽科獐牙菜屬干燥全草，為一年生矮小草本植物[1]。川西獐牙菜始最早收錄在《四部醫書》，被稱為藏藥中的奇葩，是清熱利膽的良藥[2]，常用于治療肝膽疾病如慢性肝炎、肝硬化、膽囊疾病等[3]。近年來發現川西獐牙菜有抗腫瘤[4]、抗微生物[5]、抗突變[6]等作用。川西獐牙菜中主要化合物分為三類：一是環烯醚萜類，如獐芽菜苷、獐芽菜苦苷和龍膽苦苷等；二是三萜類化合物，如齊墩果酸等；三是呫噸酮類，如芒果苷、當藥醇苷等[7-10]。化合物的結構式見圖1。以往報道對該藥的藥理作用和化學成分綜述較多，本文主要從川西獐牙菜的藥物代謝動力學和質量控制方面進行綜述，分析藥物開發可能的挑戰和困難，為進一步利用或開發川西獐牙菜提供參考。

圖1 川西獐牙菜主要成分化學結構式Fig 1 Structural formula of the main ingredients of Swertia mussotii

1 川西獐牙菜的藥物代謝動力學研究

中藥是化合物組成的復雜體系，具有多成分、多環節、多靶點的特征，尤其是各種成分之間由于結構相近可能存在相互轉化、相互影響，使得中藥進入體內后的吸收、分布、代謝以及排泄等一系列過程的作用機制變得極為復雜。目前川西獐牙菜提取物的藥物代謝動力學研究報道非常少。Ye等[11]通過UPLC-MS/MS的方法對獐牙菜提取物在大鼠體內的藥物代謝動力學行為進行了研究，結果如表1所示，目標分析物分別為環烯醚萜類成分中的龍膽苦苷、獐芽菜苷和獐芽菜苦苷，3種成分都是在1.09～2.67 h達峰，半衰期在3.03～6.35 h，從藥物濃度-時間曲線峰面積來看呈現出非線性吸收的特點。Suryawanshi等[12]發現，家兔耳緣靜脈注射獐牙菜的提取物1 mg·kg－1時，芒果苷的半衰期為0.73～1.05 h，與單體芒果苷相比無顯著差異。川西獐牙菜提取物所含的主要單體比如龍膽苦苷、獐芽菜苦苷、獐芽菜苷、芒果苷的藥物代謝動力學研究相對較多[13-15]，故接下來分別從吸收、分布、代謝和排泄的角度對上述4種主要成分進行藥物代謝動力學描述。

表1 川西獐芽菜提取物以及主要單體的藥代動力學參數Tab 1 Pharmacokinetic parameters of Swertia mussotii extract and main monomer

1.1 吸收

龍膽苦苷、獐芽菜苦苷、獐芽菜苷作為川西獐牙菜藥效物質基礎的一部分[16-17]，均屬于環烯醚萜類成分，存在吸收較快，生物利用度相對低的情況。龍膽苦苷是川西獐牙菜中含量最多的化合物[14]。Wang等[18-19]先后研究了小鼠和大鼠體內龍膽苦苷的吸收特征。小鼠分為兩組，一組灌胃150 mg·kg－1龍膽苦苷，另一組靜脈注射50 mg·kg－1龍膽苦苷，龍膽苦苷符合開放性二房室模型，生物利用度約為39.6%；大鼠分別靜脈注射30 mg·kg－1或灌胃150 mg·kg－1龍膽苦苷，結果表明龍膽苦苷生物利用度僅為4.71%，推測兩者差異可能是由于種屬不同，腸道壁或肝臟的首過代謝，細菌菌群在腸道中的代謝不同導致的[20]。Shi等[21]將24只大鼠分為了4組，分別尾靜脈注射2 mg·kg－1，灌胃50、100和150 mg·kg－1的獐芽菜苦苷，結果表明獐芽菜苦苷的生物利用度較低（≤8.0%），且達峰時間（tmax）在1 h左右，說明獐芽菜苦苷在體內吸收較快。Li等[22]將大鼠分為兩組，一組尾靜脈注射4 mg·kg－1的獐芽菜苦苷，另一組灌胃25 mg·kg－1的獐芽菜苦苷，采用DAS軟件計算其絕對生物利用度，結果其生物利用度較低，僅為10.3%，推測可能是獐芽菜苦苷腸道滲透性較差或者肝臟的首過效應造成的。Luo等[23]使用HPLC-UV測定靜脈注射1 mg·kg－1以及灌胃500 mg·kg－1獐芽菜苷的大鼠血漿、糞便和膽汁樣品，結果表明其生物利用度約為0.31%，而糞便和膽汁的排泄率分別為（43.38±3.2）%和（31.2±7.2）%，說明獐芽菜苷大部分會隨著糞便被排出體外，這也可能是其生物利用度低的原因之一。

而呫噸酮類成分芒果苷在大鼠體內的絕對生物利用度較低，只有0.31%～1.2%，且研究發現其存在非線性吸收的現象。Han等[24]將大鼠分為兩組，一組灌胃25 mg·kg－1的芒果苷，另外一組尾靜脈注射10 mg·kg－1芒果苷，使用DAS計算得出其生物利用度約為1.2%。這可能與芒果苷極性較大，滲透性較差有關。Ma等[25]通過磷脂絡合技術，采用大鼠原位腸灌注模型研究絡合物的腸吸收，發現大鼠分別灌胃芒果苷和絡合物后，絡合物的生物利用度約為單體的2.3倍，這也說明腸通透性能影響芒果苷的吸收。Qiu等[26]對靜脈注射3.0 mg·kg－1芒果苷的大鼠進行藥物代謝動力學研究，發現半衰期較短，為1 h左右。Liu等[27]開展了芒果苷在大鼠體內的多劑量研究，灌胃給予不同劑量（17.5、35、70 mg·kg－1）的芒果苷后計算其藥物代謝動力學參數，發現芒果苷在體內能夠快速吸收，達峰時間在0.25～1 h，同時達峰濃度Cmax和曲線下面積（AUC）會隨著芒果苷劑量的增高而增大，但并未成比例增加，這也暗示了其在體內可能以非線性的方式進行吸收。Cai等[28]也發現灌胃給藥后芒果苷在大鼠體內的吸收是非線性過程。同時，Hou等[29]研究了21名男性中國志愿者，分別口服0.1 g、0.3 g和0.9 g芒果苷，采用HPLC-MS測定血漿濃度，使用非房室模型計算其藥物代謝動力學參數，當芒果苷劑量從0.1 g增加到0.3 g，從0.3 g增加到0.9 g時AUC0～t并沒有隨著劑量增加而成比例增加，且Log（濃度/劑量）-時間關系曲線沒有重疊，以上均說明芒果苷是非線性吸收。

1.2 分布

組織分布研究結果表明，川西獐牙菜提取物所含的主要的環烯醚萜類成分如龍膽苦苷、獐芽菜苦苷等可以在機體內廣泛分布，而呫噸酮類物質如芒果苷則在胃腸道出現一定的蓄積。郜盡[30]將大鼠以120 mg·kg－1肌內注射龍膽苦苷后發現，在3.5 min時肺、肝、心、脾等龍膽苦苷有較高的濃度，但腦中未檢測到，說明該藥可能不通過血腦屏障。同時王長虹等[31]將小鼠靜脈注射50 mg·kg－1龍膽苦苷后，發現在1～3 h腎、肝、肺、脾、胃、心等濃度較高，在8 h左右基本消除完畢。兩者消除時間可能是種屬差異導致結果有較大差異。Li等[22]對灌胃50 mg·kg－1獐芽菜苦苷的大鼠進行了組織分布實驗，實驗結果表明在1 h左右會在各個器官（肝，心，脾，肺，腎和腦）產生廣泛分布，獐芽菜苦苷的濃度達到峰值，另外在腎臟和肝中有很高的濃度，說明獐芽菜苦苷可能被肝臟大量攝取且主要隨著尿液排出體外。Lin等[32]對服用35 mg·kg－1芒果苷的大鼠進行組織分布實驗，單體組的結果表明，芒果苷在血漿和組織中的分布迅速且廣泛，在胃和腸中濃度最高，且在給藥6 h后其濃度仍高于其他組織，提示可能在胃腸道中存在積累，導致血漿濃度和生物利用度降低。

1.3 代謝

環烯醚萜類化合物的母核含有環戊烷結構，是五元碳環并六元氧雜環單萜類化合物。裂環環烯醚萜則是環戊烷C7-C8共價鍵斷裂形成，龍膽苦苷、獐芽菜苦苷與獐芽菜苷均為裂環環烯醚萜類。該類化合物進入體內后容易被腸道的β-葡萄糖苷酶水解，生成對應的苷元，但由于所生成的苷元為半縮醛結構，故容易形成更穩定的結構，例如雙醛或含氮雜環化合物等[33]。

早在1989年，El-Sedawy 等[20]將龍膽苦苷與人腸道的厭氧細菌進行溫孵，發現能夠代謝為紅白金花內酯、龍膽醛等。Zeng等[34]和Han等[35]分別使用UPLC/ESI-Q-TOF-MS和UHPLC/Q-TOF-MS研究龍膽苦苷的代謝過程，發現龍膽苦苷與β-葡萄糖苷酶孵育后形成半縮醛苷元，易于轉化為雙醛形式：一是雙醛結構雙醛與氮原子反應生成席夫堿，經分子內環化得到代謝產物如紅白金花內酯、龍膽醛等；二是雙醛結構在體內進行葡萄糖醛酸化，例如在人尿液和大鼠尿液中[36]中代謝為葡萄糖醛酸綴合物。

Shi等[21]使用UPLC-Q/TOF-MS/MS鑒定獐芽菜苦苷的大鼠體內代謝產物，推斷存在3種代謝途徑：一是6-羥基斷裂后，吡喃環被保留，然后發生C＝O反應；二是半縮醛的開環反應，半縮醛異構成雙醛；三是RDA裂解反應，由于六元環烯烴的存在，吡喃環被分離（見圖2）；由此可見去羥基化、去羰基化和裂解環是獐芽菜苦苷裂解的特征步驟，整體來講糖苷化過程在下一次代謝前先形成苷元，得到中間配基，但是其苷元不穩定，是形成半縮醛。此時暴露的兩個羰基碳原子容易受到氮原子的親核攻擊。當氮原子攻擊其中一個羰基碳時，原來位置上的氧原子就會脫落，氮原子也可以攻擊另一個羰基碳原子，最終環化形成吡啶結構，形成龍膽寧堿。同時，半縮醛結構也會以另一種方式打開，然后異構化、重排得到紅白金花內酯[37]。Wu等[38]使用衍生化的方法也得到了同樣的結論。Ma等[39]對獐芽菜苦苷的代謝物鑒定研究也發現了多種不同的生物轉化反應，包括還原、脫水、脫氫、羥化、氫化、磺化、甲基化、甲氧基化、N-雜環化，確定了龍膽寧堿是其主要代謝產物。Han等[40]使用UHPLC/Q-TOF-MS鑒定了大鼠灌胃100 mg·kg－1獐芽菜苷的尿液代謝產物，約有11種代謝物包含Ⅰ相代謝產物、Ⅱ相代謝產物和苷元，苷元及其葡萄糖綴合物是主要的代謝產物。

圖2 獐芽菜苦苷裂解機制[21，37]Fig 2 Cleavage mechanism of pyroside sprouts[21，37]

除了裂環環烯醚萜類，粗提物還含有呫噸酮類化合物，比如芒果苷。芒果苷在體內主要以Ⅱ相代謝為主，會被體內的β-葡萄糖苷酶水解糖苷鍵形成苷元，繼而進行葡萄糖醛酸化、硫酸化等Ⅱ相反應[41]。Liu等[42]對灌胃200 mg·kg－1芒果苷的大鼠進行代謝產物鑒定，發現尿液中的代謝產物約有32種，同時發現代謝產物在大鼠體內分布廣泛但是差異較大，如在心臟和脾臟檢測到1種代謝產物，在肺組織中可見芒果苷及2種代謝產物，在肝臟中除芒果苷外，還鑒定出6種代謝產物，在腎臟則出現5種代謝產物。目前已經明確了芒果苷在體內先經過去糖基化再進行去羥基化、甲基化、糖基化、葡萄糖醛酸化和硫酸化等反應。對部分代謝產物進行腸道體外培養，發現腸道細菌參與甲基化和去糖基化代謝產物的形成，但代謝產物是否有活性尚未確定。

1.4 排泄

川西獐牙菜提取物及相應單體在機體內的排泄研究相對較少。馮怡等[43]將健康受試者分別靜脈滴注80、240、400 mg龍膽苦苷，發現3個劑量25.5 h時平均累計尿排泄率為76.1%，說明龍膽苦苷在人體內主要是以原形從尿液中排出。徐貴麗[44]發現大鼠灌胃20 mg·kg－1獐芽菜苦苷后從尿中排泄量約占給藥量的1.0%，而糞便僅為0.05%。Wang等[45]研究表明大鼠灌胃120 mg·kg－1的芒果苷后，其尿液的累計排泄率為（6.52±0.12）%，推測排泄率低可能是因為芒果苷在腸道中被代謝或者首過效應的影響，也有可能是其他原因造成的。

2 川西獐牙菜的質量控制

根據現有的青海省藏藥炮制規范規定[46]，川西獐牙菜粉末呈黃綠色，加75%的乙醇，濾過濃縮，點于濾紙上，置紫外光燈（365 nm）下觀察，顯淡橙黃色熒光，滴加1%乙酸鎂甲酸液，熒光明顯加強，呈亮金黃色，另取濾液，點濾紙上，烘干后，滴加1%三氯化鐵乙醇液，呈淺墨綠色；且按干燥品計算獐芽菜苦苷和龍膽苦苷總計不得少于1.3%。川西獐牙菜所含主要成分龍膽苦苷、獐芽菜苷、獐芽菜苦苷、當藥醇苷、芒果苷和齊墩果酸，可以使用薄層色譜或超高效液相色譜方法進行鑒別[47-48]。近年來尚未在藥典中錄入川西獐牙菜提取物的質量標準，需對主要成分制定質量標準，防止市場上出現以次充好的局面。

有學者對同一地區的川西獐牙菜進行指紋圖譜分析，發現四川境內的藥材質量穩定[49]。另外，川西獐牙菜和印度獐牙菜在磨碎后肉眼無法辨別，Fan等[50]使用核磁共振氫譜發現與印度獐牙菜相比，川西獐牙菜含有的龍膽苦苷、異葒草素、葡萄糖、馬錢苷酸含量會更高。保怡等[51]測定時發現川西獐牙菜的采摘日期或地域的不同會導致化學成分差異較大，例如四川產出的獐牙菜含有當藥醇苷，而青海玉樹產出的不含該類化合物。這也意味著產地不同，提取物所含的成分也會有所差異，這可能會對其體內藥效、毒性以及藥代動力學行為產生差異化影響。

3 討論及展望

川西獐牙菜因分布廣、療效好，受藏醫的喜愛，許多藏藥書籍記載了川西獐牙菜廣泛的臨床運用，有些療效已經被證實，有些仍舊在探索之中。

龍膽苦苷、獐芽菜苷、獐芽菜苦苷和芒果苷均是川西獐牙菜的主要成分。目前的研究表明，主要單體在體內都可以較快地吸收達峰，除龍膽苦苷外，其余單體以原形的暴露及排泄都較少，說明其生物利用度低可能存在廣泛代謝并以代謝物的形式排出。但是對于其可能的機制比如是否存在腸道代謝、肝臟首過效應，是否有轉運體參與其吸收等都有待進一步的研究。同時，環烯醚萜類化合物（龍膽苦苷、獐芽菜苷、獐芽菜苦苷）均是以Ⅱ相代謝為主，在體內先經過β-葡萄糖水解為苷元，呈半縮醛形式，易于轉化為雙醛形式且二醛與氮原子反應生成席夫堿，經分子內環化得到含氮代謝產物；芒果苷也以Ⅱ相代謝為主，糖苷鍵發生斷裂后形成苷元，在苷元的基礎上再進行去羥基化、甲基化、糖基化、葡萄糖醛酸化和硫酸化反應。但是缺少相關代謝酶亞型的鑒定以及酶動力學研究。另外雖然鑒定出的代謝產物較多，但關于活性代謝物的評估較少，希望后續能對代謝產物進行篩選，再對活性化合物進行評估，從而擴展藥物的使用范疇。再者，上述研究大多是以單體的形式在正常動物體內開展的，川西獐牙菜提取物中所含的不同單體之間是否有相互作用，在病理情況下其藥物處置過程是否會發生改變尚未見報道。最后，川西獐牙菜目前缺乏有效的質量控制標準，這在限制其國際化的同時，也可能會對其體內藥效、毒性以及藥代行為產生差異化的影響。