皂苷類化合物抗肝癌作用機制的研究進展

張哲，龍佳瑤，陳曉勇，饒利兵，林玲，唐根云*（. 廣州醫科大學研究生院，廣州 50000；. 湖南醫藥學院，湖南 懷化 48000；. 三亞中心醫院，海南 三亞 57000）

皂苷類化合物是一類苷元為三萜或甾烷類的糖苷類化合物，主要分布于人參、柴胡、桔梗、甘草等高等植物中，少量存在于海星、海參、珊瑚等海洋生物中。現代藥理學研究表明，皂苷類化合物具有顯著的抗腫瘤作用[1]，其在抗肝癌[2]、胃癌[3]、肺癌[4]、白血病[5]等惡性腫瘤藥理機制的研究中取得了較大進展。原發性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC），又稱肝細胞癌，占據所有肝癌類型的70%～90%，其病死率在所有惡性腫瘤中居第四位[6]。NCCN指南指出[7]，臨床上治療中晚期HCC患者常采用姑息性手術、化療、放療及免疫治療等方法。考慮到這些手段有著較明顯的不良反應和并發癥，限制了其在HCC患者中的廣泛應用，所以尋找并開發新型有效、毒性較低、適應性更廣的抗肝癌藥物具有重要意義。我國傳統植物藥滇重樓、人參、柴胡、桔梗、地膚子中富含的天然皂苷毒副作用小且藥理活性廣泛，能夠通過抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、增加細胞自噬、阻滯細胞周期、抑制腫瘤侵襲轉移及腫瘤耐藥性等多途徑發揮抗肝癌作用。因此，筆者歸納總結了近20年的國內外文獻，首次系統綜述滇重樓、人參、柴胡、桔梗、地膚子皂苷抗肝癌的藥理作用機制，以期為先導化合物的發現與新藥的開發提供新思路。

1 皂苷類化合物抗肝癌的作用機制

1.1 抑制肝癌細胞增殖

不受機體控制地無限增殖幾乎是所有腫瘤細胞的一個共同特點[8]。許多皂苷類化合物可以通過表觀遺傳學如DNA甲基化、轉錄后修飾調節基因的表達來抑制肝癌細胞的增殖。人參皂苷Rh2在體內外均可通過上調miR-491，促進表皮生長因子受體（EGFR）mRNA降解，從而抑制細胞的增殖[9]。DNA甲基轉移酶（DNMT）是DNA甲基化修飾的關鍵酶，可使啟動子CpG島序列上的胞嘧啶發生甲基化來抑制基因的轉錄。Teng等[10]采用高效液相色譜結合質譜法從人參中分離出20（R）-人參皂苷Rg3、20（S）-人參皂苷Rg3，經鑒定兩者均可通過增加DNMT3a、DNMT3b的表達，促進基因P53轉錄，并甲基化血管內皮生長因子（VEGF）的啟動子來抑制肝癌細胞增殖，而體外實驗表明后者效果較前者更優。此外，人參皂苷Rh2可下調甲基轉移酶Zeste同源物2的增強子（EZH2）的表達，減少基因CDKN2A-2B啟動子的甲基化修飾，促進下游基因p14、p15、p16的轉錄，從而抑制HepG2細胞的增殖[11]。環氧合酶-2（COX-2）是前列腺素生成的限速酶，與腫瘤細胞的增殖成正相關[12]。Ren等[13]報道柴胡皂苷d可以通過激活信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）/增強子結合蛋白β（C/EBPβ）信號通路降低肝癌細胞中COX-2的水平，提示其在肝癌治療中的潛在作用。

皂苷類化合物抑制肝癌細胞增殖主要源于對表觀遺傳學及轉錄后修飾的調節，通過增加甲基轉移酶DNMT3a、DNMT3b、EZH2及非編碼RNA miR-491的表達，驅動下游基因的轉錄與翻譯。此外，在抑制肝癌細胞增殖過程中，翻譯后修飾作為蛋白質成熟的關鍵環節，亦可能是皂苷類化合物的候選作用靶點。

1.2 促進肝癌細胞凋亡

凋亡是指細胞自主發生程序性死亡的過程[14]。皂苷類化合物促進肝癌細胞凋亡主要包括內源性途徑[15-17]、外源性途徑[18-19]、內源性與外源性雙途徑[19-20]及內質網應激[21-22]四種方式，其通過直接或間接作用于下游凋亡相關基因來介導胱天蛋白酶（Caspase）的激活導致細胞死亡（見圖1）。

圖1 皂苷類化合物促進肝癌細胞凋亡機制圖Fig 1 Mechanisms of saponins promoting apoptosis of hepatocellular carcinoma cells

1.2.1 內源性途徑 細胞內染色體DNA發生損傷或斷裂、線粒體動力學紊亂及活性氧（ROS）激增均可使腫瘤細胞經內源性途徑發生凋亡[14]。一般而言，某種因素單獨作用或多種因素相互疊加促使抗凋亡基因Bcl-2與促凋亡基因Bax的比例發生改變，增加線粒體膜通透性，釋放大量細胞色素C，從而激活凋亡執行蛋白Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7，誘導細胞凋亡[14]。人參皂苷作為經典的天然皂苷類化合物具有顯著的促肝癌細胞凋亡作用。人參皂苷Rk1和人參皂苷Rg5在結構上互為同分異構體，是從人參中新提取的一類小分子皂苷化合物，可同時激活MHCC-97H細胞中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路與核因子-κB（NF-κB）信號通路致使細胞發生內源性途徑凋亡[23]。另外，人參皂苷Rh2通過降低凋亡相關蛋白Bcl-2/Bax的比例激活Caspase-3，促進肝癌細胞凋亡[15，24]。桔梗皂苷D亦可通過增加H22細胞靜脈注射的荷瘤裸鼠中促凋亡蛋白Bax、切割型多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的水平來誘導其凋亡[25-26]。

隨著人們對腸道微生物菌群的重視，目前肝腸軸的發生機制已成為肝癌治療的研究熱點之一。Compound K是人參皂苷在腸道微生物代謝中提取出的一種具有明顯抗腫瘤作用的化合物。研究發現[27]，Compound K可呈時間依賴性與劑量依賴性地增加促凋亡蛋白Bid的表達，激活線粒體途徑促進BEL7402、SMMC-7221細胞凋亡。為了廣泛開發Compound K的抗腫瘤療效，Zhang等[17]利用殼聚糖來源的歸巢肽納米膠束作為藥物的運輸載體，在體外實驗中，相比于對照組，當給藥質量濃度超過20 μg·mL－1時，含運輸載體的Compound K可明顯增加肝癌細胞的凋亡率。

百合科植物滇重樓中富含多種天然皂苷類成分，其中以皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ研究最為廣泛，體外實驗表明這四種化合物對肝癌細胞均有細胞毒作用[16]。滇重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ通過協同作用于線粒體依賴途徑促進肝癌細胞凋亡[28]，其中滇重樓皂苷Ⅰ主要調控p53基因的表達，增加線粒體膜通透性并釋放細胞色素C，導致細胞內ROS的含量激增，激活Caspase-9、Caspase-3、PARP，促HepaRG細胞凋亡[16]。此外，柴胡皂苷d能通過Caspase-3依賴性、非依賴性及線粒體途徑三種方式共同誘導細胞凋亡，在使用Caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK后僅能部分消除皂苷對肝癌細胞的促凋亡作用[29]。

1.2.2 外源性途徑 細胞凋亡外源性途徑亦稱死亡受體介導的細胞凋亡，是指細胞外多種信號分子特異性結合細胞膜表面的Fas受體，以此誘導Fas相關死亡結構域（FADD）復合體活化，切割Caspase-8前體蛋白，進一步激活Caspase-3，最終導致細胞凋亡的過程[30]。柴胡皂苷d通過抑制NF-κB信號通路，增加Fas受體的表達，誘導p53基因陽性表達的HepG2細胞發生外源性凋亡[31]。另一種天然皂苷類化合物滇重樓皂苷Ⅰ可劑量依賴性地增加p53蛋白、Fas受體蛋白的表達，促進肝癌細胞凋亡[18]。而人參皂苷Rk1抗肝癌作用是以非FADD依賴的信號途徑激活Caspase-8、Caspase-3，其機制可能與端粒酶的活性受抑制有關[32]。

1.2.3 內源性與外源性雙重途徑 天然皂苷類化合物多靶點、多通路的藥理作用更有利于協同發揮抗腫瘤效應。滇重樓皂苷Ⅶ可經MAPK通路與PTEN/p53通路介導HepG2細胞發生內源性與外源性凋亡，在使用PTEN、MAPK通路抑制劑后細胞凋亡率顯著降低[19]。類似地，滇重樓皂苷Ⅱ也可以同時激活內外雙途徑促進肝癌細胞凋亡[33]。人參皂苷Rh2可使SK-HEP-1細胞內Bcl-2/Bax比例下調，Caspase-8、Caspase-9表達水平增加，誘導細胞凋亡[34]。此外，有研究發現地膚子皂苷momordin Ic可介導一種新型促肝癌細胞凋亡的機制，momordin Ic通過激活抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路與MAPK信號通路，增加下游轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）入核啟動叉頭框轉錄因子4（FoxO4）、COX-2基因的轉錄，導致肝癌細胞凋亡，而這種機制可能并不直接依賴于Caspase家族成員，但可促進RARP蛋白的切割導致細胞凋亡[35]。最新研究顯示，桔梗皂苷D與核糖體失活蛋白能協同抑制PI3K/Akt、細胞外調節蛋白激酶1/2（ERK1/2）信號通路，并磷酸化MAPK通路中的c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38蛋白，從而使肝癌細胞發生Caspase-3依賴性凋亡[20]。

1.2.4 內質網應激 蛋白質的正確折疊與成熟依賴于內質網的動態調控，當細胞內外環境發生變化時會打破蛋白質的生成平衡，激活內質網信號通路，導致內質網應激的發生，促使細胞凋亡[36]。轉錄因子C/EBP同源蛋白（CHOP）既作為內質網應激中的關鍵蛋白，又參與調節細胞凋亡，在細胞死亡方式的調節中扮演著重要的角色[36]。人參皂苷Rg3通過上調CHOP介導的死亡受體5（DR5）的表達，促進肺癌細胞凋亡[37]。近期一項研究顯示，Compound K可抑制STAT3的磷酸化，使其無法形成二聚體結構，削弱STAT3入核結合DNA的能力，導致HepG2、SMMC-7221細胞發生內質網應激和凋亡[22]。然而，Luo等[21]研究發現，重樓皂苷Ⅰ以內源性途徑促進細胞凋亡的同時，還通過CHOP非依賴途徑激活核糖核酸內切酶肌醇需求酶1（IRE-1）信號通路抑制HepG2細胞凋亡，顯示了其促細胞凋亡的雙向機制。

總之，天然皂苷類化合物可通過內源性途徑、外源性途徑、內源性與外源性雙重途徑及內質網應激等多種途徑促進肝癌細胞凋亡（見圖1）。但皂苷類化合物藥理機制復雜，具有多靶點、多途徑作用的特點，例如，滇重樓皂苷Ⅰ經內源性途徑促進肝癌細胞凋亡同時，也能激活內質網應激抑制凋亡，這就給皂苷類化合物作用機制的研究帶來了新的挑戰。所以，筆者認為后期研究者可采用網絡藥理學結合實驗驗證的方法多維度揭示皂苷的分子調節網絡。另外，在皂苷促凋亡的機制研究中大多局限在體外實驗，應增加如裸鼠成瘤模型等體內實驗進一步驗證相關機制。

1.3 促進肝癌細胞自噬

自噬是指細胞內衰老的細胞器和某些蛋白質等成分被光面內質網膜包裹，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體后將其降解，以實現細胞自我更新的過程[38]。適度自噬可延緩細胞衰老，但過度自噬會導致細胞凋亡。越來越多的研究表明自噬是皂苷類化合物發揮抗腫瘤作用的新途徑，其中哺乳動物雷帕霉素受體（mTOR）途徑是自噬上游負性調節的經典信號通路[39]。滇重樓皂苷Ⅰ、Ⅶ均可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路促進HepG2細胞自噬，誘導細胞凋亡[40-41]，而滇重樓皂苷Ⅶ還能通過激活ADP活化的蛋白激酶（AMPK）、JNK通路誘導HepG2肝癌細胞過度自噬來發揮抗肝癌作用[41]。柴胡皂苷d作用于SMMC-7721和MHCC97L細胞后，亦可抑制mTOR的磷酸化，增加下游自噬相關蛋白LC3-ⅡBeclin-1的表達，促進細胞自噬[42]。另一項研究發現，柴胡皂苷d可增加肝癌細胞對放療的敏感性，其原因在于柴胡皂苷d可通過誘導自噬增加來提高肝癌細胞對放療的敏感性，但是，在使用自噬抑制劑后，僅能部分逆轉柴胡皂苷d的放療增敏作用，表明可能存在其他機制參與自噬的調節[43]。

上述研究表明，皂苷類化合物可通過激活AMPK、JNK通路，抑制PI3K/Akt/mTOR途徑增強自噬，進而促進肝癌細胞凋亡，其中，多數皂苷類化合物通過直接或間接抑制PI3K/Akt/mTOR通路來發揮抗肝癌作用，這可為其他天然分子提供有效的作用靶點。

1.4 阻滯肝癌細胞周期

細胞周期是指從上一次細胞分裂結束時開始到下一次細胞分裂結束時為止的時間過程[44]。該過程需要周期蛋白激酶（CDK）與周期蛋白（Cyclin）的廣泛參與，CDK與Cyclin結合形成復合物后激活下游的特定基因，維持周期的正常運轉[44]。阻滯肝癌細胞周期在任意時期均可顯著抑制肝癌細胞的增殖。CDK2、CDK4/6系參與細胞周期S期、G1期的關鍵激酶，可以精準調控細胞的增殖。人參皂苷Rh2可顯著降低CDK2、CDK4/6的表達，將SK-HEP-1細胞分別阻滯于G1/S期、G0/G1期，實驗證實，人參皂苷Rh2可直接結合熱休克蛋白90A（HSP90A），后者減少與細胞分裂周期控制蛋白37（CDC37）結合，抑制CDK正確折疊和成熟[45]。滇重樓皂苷Ⅰ與formosanin C均是從滇重樓中提取的主要皂苷成分，兩者以1∶1的比例混合體外處理肝癌細胞，可協同減少CDK2/CyclinE復合物的形成，使細胞停留在G1期[28]。另有研究發現，滇重樓皂苷Ⅱ亦具有類似的抗腫瘤作用，可將HepaRG細胞與HL-7702細胞阻滯于S期，且呈劑量依賴性[33]。細胞周期檢查點專司細胞周期精確調控，保證細胞能夠進行正常的DNA復制與染色體的分離[44]。柴胡皂苷d通過促進p53表達，上調p21/WAF1的水平，阻滯肝癌細胞于G1期[31]。此外，在低氧條件下，柴胡皂苷d可將SMMC-7721細胞的細胞周期同時阻滯于G0/G1期與G2/M期，而恢復常氧后卻失去了對細胞G2/M期的阻滯作用，這一特性能更好地遏制腫瘤細胞在缺氧條件下旺盛生長的速率[46]（見表1）。

表1 皂苷類化合物抑制肝癌細胞周期Tab 1 Cell cycle of saponins with anti-hepatocellular carcinoma

人參皂苷Rh2、滇重樓皂苷Ⅰ、滇重樓皂苷Ⅱ及柴胡皂苷d以阻滯細胞周期的方式來抑制肝癌細胞的生長。其主要藥理機制不僅可以影響細胞周期相關調節蛋白CDK2、CDK4/6、CyclinE的表達，還能在不同氧環境條件下適應性地調節細胞周期上游蛋白p53的水平，抑制肝癌細胞周期。

1.5 抑制肝癌細胞侵襲和轉移

腫瘤細胞的侵襲和轉移是指腫瘤細胞經血管、淋巴管遷徙到機體的不同部位形成同類型的腫瘤[47]。該過程通常需要上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）、基質金屬蛋白酶（MMP）的參與[48]。人參皂苷Compound K可促進NF-κB的核因子p65出核，減少下游MMP-2與MMP-9的表達，抑制MHCC97-H細胞的轉移能力[49]。人參皂苷Rh2抑制HepG2肝癌細胞遷移與MMP-3的高表達有關[15]。近期研究發現，地膚子皂苷momordin Ic一方面通過激活PPARγ，抑制COX-2、MMP-9蛋白的表達[50]；另一方面可以磷酸化MAPK（ERK、p38、JNK）信號通路，抑制ICAM-1和VCAM-1的表達，促進E-cadherin的表達，協同減弱肝癌細胞的侵襲和轉移能力[51]。血管生成擬態（VM）與腫瘤的侵襲和轉移密切相關，主要是指具備類上皮細胞功能的腫瘤細胞形成微血管來供應自身生長必需的營養物質[52]。滇重樓皂苷Ⅰ通過抑制PI3K/Akt/Twist/E-cadherin通路降低VM的形成，其抑制VM的兩種主要機制：① 抑制Twist啟動子的轉錄激活；② 干擾Twist的穩定性，減少與下游E-cadherin的啟動子結合[53]。此外，滇重樓皂苷Ⅱ能抑制Akt/NF-κB通路，進而降低HepG2與BEL7402細胞分泌MMP-2、MMP-9，從而削弱其侵襲轉移能力[54]。

上述研究提示，皂苷類化合物可以通過調節PPARγ、MAPK、Akt/NF-κB信號通路及相關蛋白的表達，抑制肝癌細胞的侵襲和轉移。雖然人參皂苷Compound K與滇重樓皂苷Ⅱ在藥理機制上均能抑制肝癌的轉移能力，但兩者介導NF-κB途徑的活化形式不同，筆者認為除了使用的細胞模型不同外，還可能存在其他潛在機制。

1.6 降低肝癌細胞耐藥性

對常規化療藥物的耐藥是癌癥治療失敗的重要原因之一。在化療藥物干預下，肝癌細胞可通過增強自噬降低化療藥對胞內細胞器的破壞，而抑制細胞自噬可明顯降低肝癌細胞對化療藥物的耐藥性[55]。人參皂苷Rg3聯合阿霉素治療HCC移植瘤裸鼠，與對照組相比，能顯著提高肝癌細胞對阿霉素的敏感性，因為人參皂苷Rg3作為新發現的自噬抑制劑，可減少肝癌細胞中自噬小體的形成[56]。此外，人參皂苷Rg3經由CHOP上調DR5介導內質網應激途徑來降低肝癌細胞的耐藥性[37]。絲切蛋白-1（cofilin-1）是與肝癌細胞增殖、侵襲、遷移密切相關的蛋白[57]。研究表明，桔梗皂苷D通過抑制ERK1/2介導的cofilin-1的磷酸化，逆轉肝癌細胞對組蛋白去乙?；敢种苿┑哪退幮訹58]。腫瘤耐藥的內體逃逸機制是指脂溶性小分子化療藥物從內涵體（endosome）中逃逸的過程[59]。Lei等[20]發現桔梗皂苷D在不損傷細胞器膜的前提下促進內體逃逸，從而逆轉HepG2細胞對化療藥的耐藥性。

因此，皂苷類化合物可通過抑制細胞自噬、促進內質網應激及激活ERK1/2通路增加肝癌細胞化療藥物的敏感性。同時，皂苷類化合物聯合化療藥治療的效果要大于單藥治療，顯著逆轉肝癌細胞的耐藥性。另外，天然皂苷類化合物通過增加內體逃逸可能是未來研究腫瘤耐藥的新方向（見表2）。

表2 皂苷類化合物抗肝癌的作用機制Tab 2 Mechanism of saponins against hepatocellular carcinoma

2 總結

天然皂苷類化合物是從滇重樓、人參、柴胡、桔梗及地膚子等傳統植物藥中提取出來且具有廣泛抑制肝癌藥理活性的糖苷類化合物，其具體機制包括抑制肝癌細胞增殖、促進肝癌細胞凋亡、促進細胞自噬、阻滯細胞周期、抑制腫瘤侵襲轉移及腫瘤耐藥等。這些皂苷類化合物通過多靶點、多途徑協同發揮治療肝癌的作用，成為國內外研究者尋找的療效更佳、毒性更低的候選先導化合物。然而，由于目前大部分皂苷類化合物的體內研究較少，無法得到更高循證等級的研究結論。目前，有少數皂苷類化合物如人參皂苷Rg3已經開始應用于Ⅱ期臨床試驗[8，60]，該研究主要的入選對象包括HCCⅠ期或Ⅱ期以及進展期的受試者，這一突破為這類患者帶來了福音。此外，人參皂苷作為一種研究較早且應用廣泛的天然皂苷，不僅在治療肝癌方面起作用，還可以顯著提高患者的免疫力，而這一特點亦為腫瘤的免疫治療提供了新思路[47]。因此，研究者們下一步可充分挖掘各種皂苷類化合物的潛在藥理機制，并結合現代分子生物學技術如三代測序、代謝組學、納米傳遞系統等新興技術，為先導化合物的合成與新藥的研發提供可靠的基礎理論。