基于補益脾腎研究獨活寄生貼對佐劑性關節炎大鼠的治療作用

董立財，王德龍，趙義軍，林春盛，王銳（. 黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，哈爾濱 5000；2. 黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 50040）

在我國關節炎發病率高達18%[1]，且人數在逐漸上升，其臨床治療上多以手術治療、服用激素等化學藥物緩解癥狀，但費用高，還具有胃腸道和心血管不良反應[2-3]，同時患者依從性低。患者若未進行規范治療，易發生關節損傷甚至殘疾[4-5]。

中醫認為，關節炎屬于痹癥范疇[6]。獨活寄生貼是在獨活寄生湯的基礎上進行劑型改造而得。獨活寄生貼由獨活、細辛、桑寄生等藥材組成，能夠祛風濕，止痹痛，治療痹證日久、肝腎兩虧之證[7]。“膏藥能治病，無殊湯藥，用之得法，其響立應”，把湯劑改為貼膏劑后，不但可以規避湯藥的苦味及煎藥之煩瑣，而且還可以避免“陡然下咽、入胃、并可以斃”的弊端[8]。故本文將獨活寄生的湯劑改變成貼劑，使藥性從毛孔而入其腠理，通經貫絡，起到治療關節炎的作用。

1 材料

1.1 試藥

獨活、桑寄生、杜仲、牛膝、細辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防風、川芎、人參、甘草、當歸、芍藥、干地黃飲片（哈藥集團世一堂中藥飲片有限責任公司，批號分別為211004、200415、211004、200907、200704、210710、201021、200907、210804、211021、210709、210805、201102、211005、210504），均經黑龍江中醫藥大學王振月教授鑒定符合2020年版《中國藥典》要求；完全弗氏佐劑（CFA，美國Sigma公司）；甲氨蝶呤片（規格：2.5 mg/片，通化茂祥制藥有限公司，批號：220903）；布洛芬片（規格：0.1 g/片，吉林萬通藥業集團鄭州萬通復升藥業股份有限公司，批號：220605）；大鼠白介素（IL）-β、IL-10酶聯免疫吸附測定法（ELISA）試劑盒（北京冬歌生物科技有限公司，貨號分別為 DG20049D、DG94478Q）；乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液（飛凈生物科技有限公司，批號：20220705）。

1.2 儀器

Infinite M200 Pro多功能酶標儀（瑞士TECAN公司）；WD-2105A微型離心機（美國六一儀器廠）；微量移液器（德國Eppendof公司）；Scope A1正置熒光顯微鏡（德國卡爾蔡司）；RM2235切片機（德國徠卡）；YLS-6B熱板儀（上海精密儀器儀表有限公司）。

1.3 實驗動物

SPF級Wistar健康大鼠50只，雌雄各半，體質量180～220 g；昆明種小鼠，雌雄各半，體質量18～22 g，均購于黑龍江中醫藥大學動物實驗中心，實驗動物使用許可證編號：SYXK（黑）2018-007。將大鼠飼養于溫度（22±2）℃、濕度55%～60%的標準居住環境，自由攝食及飲水。

2 方法

2.1 獨活寄生貼的制備

獨活、桑寄生、杜仲、牛膝、細辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防風、川芎、人參、甘草、當歸、芍藥、干地黃粉碎機粉碎，過80目藥典篩。將上述藥物混勻，加入姜汁∶食醋＝1∶10調和至糊狀裝入空白穴位貼內，備用。

2.2 佐劑性關節炎（AA）大鼠模型的建立、給藥及取材

2.2.1 AA模型建立 大鼠適應性喂養后，隨機挑選6只作為正常對照組，剩余大鼠于大鼠右足趾處，朝向踝關節注射CFA 0.15 mL以致炎[9]，制備大鼠AA模型。正常對照組大鼠同法注射等體積生理鹽水。

2.2.2 分組及處理 將造模成功的大鼠分為模型組、治療組（穴位貼組）、陽性組（甲氨蝶呤片），每組6只。穴位貼組：將獨活寄生貼貼敷于“腎俞”“脾俞”，2 次·d－1、4 h/次。陽性組：甲氨蝶呤片按照每周0.8 mg·kg－1的劑量進行灌胃。正常對照組和模型組大鼠不作任何干預。

2.2.3 取材 戊巴比妥鈉麻醉（45 mg·kg－1）大鼠，腹主動脈取血，室溫靜置1 h后，4℃、3000 r·min－1離心15 min分離血清，－80℃保存備用。戊巴比妥鈉（60 mg·kg－1）過量麻醉大鼠安樂死，固定，大鼠踝關節上下兩側斷開，保存在組織固定液中固定備用[10]。

2.3 觀察指標

2.3.1 一般情況觀察 在給藥第3、6、9、12、15、18、21日觀察上述各組大鼠的生活狀態（飲食及活動變化，毛色的改變）和關節部位紅腫的情況。

2.3.2 關節炎指數（AI）評分 各組大鼠參考AI評分標準（見表1），對其雙側后足關節進行炎性評分[11]，每個足爪的關節炎嚴重程度由0到4分表示：AI為每只大鼠兩只后足的累積評分，最大值為8分。當AI≥3分即認定為AA模型復制成功。

表1 AI評分標準Tab 1 Scoring criteria for AI

2.3.3 大鼠體質量、關節足腫脹度 首先在大鼠的踝關節處用畫筆做標記，每隔3日稱定大鼠體質量，同時用排水法測量左右后足體積大小作為基礎值。以造模當日為第0日，每隔3日采用足容積法測量足腫脹體積，每次測量3次取平均值，記錄并計算足腫脹度。比較各組間腫脹度大小的差異，并繪制變化圖形。

大鼠足腫脹度（%）＝（造模后足容積－初始足容積）/初始足容積×100%。

2.3.4 IL-β、IL-10檢測 取各組大鼠離心血清，按照ELISA試劑盒說明書測定大鼠血清中的IL-β、IL-10。

2.3.5 HE染色 取大鼠踝關節，修剪大約5 mm厚度，在組織固定液中固定48 h后，先后用PBS和蒸餾水清洗3次，每次20 min。轉移到約20倍體積的EDTA脫鈣液中，置于37℃溫箱中，每2日更換一次EDTA脫鈣液。直到用針刺無阻力，表示到達脫鈣終點。將脫鈣終點的踝關節置于不同濃度的乙醇中，之后用二甲苯將其脫水至透明。石蠟包埋，切成約5 mm的切片，進行染色后使用中性樹脂封片，并在光學顯微鏡下觀察其組織病理形態變化。

2.3.6 脾臟、胸腺指數 摘取處死大鼠的脾臟和胸腺，稱定質量，計算脾臟和胸腺指數。脾臟（胸腺）指數（%）＝脾臟（胸腺）（g）/大鼠質量（g）×100%。

2.3.7 小鼠熱板致痛實驗 取小鼠50只，雌雄各半，實驗前選擇舔足時間在5～30 s內的小鼠，將符合條件的小鼠隨機分為正常對照組、陽性對照組（布洛芬片）、貼劑組。啟動儀器，將小鼠置于事先預熱的熱板儀上（55.0±0.5）℃，以小鼠舔后足為疼痛反應指標，觀察小鼠出現舔后足所需時間（s）作為該鼠痛閾值。連續給藥6日，于末次給藥后30、60、90、120 min分別測量各組小鼠給藥后的痛閾值。

2.3.8 數據處理 所有數據均用±s表示，各組間均數比較采用單因素方差分析。經方差齊性檢驗，方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Donnett T3檢驗。

3 結果

3.1 一般情況觀察

與正常對照組比較，模型組大鼠在注射后1日，后足趾局部開始出現紅腫，緊接著紅腫部位變大，注射部位潰瘍結痂，結果見圖1。模型組大鼠在整個實驗期間，進食減少、毛發干枯且發黃、活動減少，體質量增加緩慢甚至減少。與模型組比較，陽性對照組、治療組大鼠精神狀態較佳、皮毛光澤、飲食正常、自由活動關節、無異常狀態出現。

圖1 獨活寄生貼對AA大鼠踝關節及足腫脹程度的影響Fig 1 Effect of Duhuo Jisheng paste on ankle swelling and paw in AA rat

3.2 對AA大鼠AI的影響

各組大鼠造模前足跖腫脹度差異均無統計學意義。與正常對照組比較，模型組大鼠在給予CFA的第6日開始AI顯著升高，在第9日達到峰值（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組、治療組大鼠AI均顯著降低。結果見圖2。

圖2 獨活寄生貼對AA大鼠關節炎指數的影響（ ±s，n＝6）Fig 2 Effect of Duhuo Jisheng paste on arthritis index of AA rat（ ±s，n＝6）

3.3 對AA大鼠體質量影響

各組大鼠造模前體質量差異均無統計學意義（P＞0.05）。造模第9日，模型組大鼠體質量較正常對照組顯著減輕（P＜0.01）；貼敷干預12 d后，治療組的大鼠體質量均高于模型對照組（P＜0.01）。結果見表2。

表2 獨活寄生貼對AA大鼠體質量的影響(g， ±s，n＝6)Tab 2 Effect of Duhuo Jisheng paste on body mass of AA rat (g， ±s，n＝6)

表2 獨活寄生貼對AA大鼠體質量的影響(g， ±s，n＝6)Tab 2 Effect of Duhuo Jisheng paste on body mass of AA rat (g， ±s，n＝6)

注：與正常對照組比較，**P＜0.01，與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note：Compared with the normal control group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別劑量/（g·kg－1）第0日第3日第6日第9日第12日第15日第18日第21日正常對照組－198.21±7.01204.26±6.13207.51±5.20212.65±5.07214.94±2.86218.96±2.81222.81±5.28228.15±5.44模型組－200.93±4.09202.35±5.63204.09±4.19192.36±8.59**194.07±7.07** 199.4±9.90**204.54±4.87**209.88±5.50**陽性對照組0.5×10－3199.93±3.22203.48±2.42207.35±4.16209.38±3.37##209.84±2.92##210.13±3.21##210.15±2.17#217.12±1.93#治療組10.62200.76±4.36203.33±2.77205.94±2.54208.32±1.94212.49±2.13##215.50±2.95##218.20±2.53##221.15±3.57##

3.4 對AA大鼠足腫脹的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠在致炎后第6～15日足趾腫脹度逐漸升高，18日達到峰值。與模型組比較，陽性對照組、治療組大鼠足趾腫脹度上升速度較慢，呈先上升后下降趨勢。結果見圖3。抑制率%＝（右后足腫脹后厚度－右后足腫脹前厚度）/右后足腫脹前厚度×100%。

圖3 獨活寄生貼對AA大鼠足腫脹度的影響（ ±s，n＝6）Fig 3 Effect of Duhuo Jisheng paste on foot swelling of rat（ ±s，n＝6）

3.5 對AA大鼠血清IL-1β及IL-10水平的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血清中IL-1β水平顯著升高（P＜0.01），IL-10水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組、治療組大鼠血清中IL-1β水平顯著下降（P＜0.01），IL-10水平出現不同程度的升高（P＜0.01）。結果見圖4。

圖4 獨活寄生貼對AA大鼠血清炎癥因子水平的影響（ ±s，n＝6）Fig 4 Effect of Duhuo Jisheng paste on inflammatory factors levels of AA rat（ ±s，n＝6）

3.6 對AA大鼠踝關節組織病理形態的影響

與正常對照組比較，模型組踝關節組織中壞死骨組織增多、被大面積增生的結締組織取代，同時中性粒細胞與巨噬細胞浸潤。與模型組比較，陽性對照組、治療組關節軟骨表面無增生、關節軟骨邊緣的滑膜組織腫脹減輕，炎癥細胞浸潤降低，提示能夠抑制滑膜細胞增生和纖維組織滲出。結果見圖5。

圖5 獨活寄生貼對AA大鼠踝關節組織病理形態的影響（HE，×100）Fig 5 Effect of Duhuo Jisheng paste on histopathological morphology of ankle joint in AA rats（HE，×100）

3.7 對AA大鼠脾臟、胸腺指數的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠脾臟、胸腺指數升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、治療組大鼠脾臟、胸腺指數降低（P＜0.05），結果見圖6。

圖6 獨活寄生貼對大鼠脾臟/胸腺指數的影響（ ±s，n＝6）Fig 6 Effect of Duhuo Jisheng paste on spleen/thymus index in AA rats（ ±s，n＝6）

3.8 對小鼠熱板痛閾值的影響

結果表明，各組小鼠給藥前的痛閾值差異均無統計學意義（P＞0.05）。與正常對照組比較，陽性對照組、貼劑組小鼠出現舔足所需時間顯著延長（P＜0.01），提示該貼劑具有鎮痛作用。結果見圖7。

圖7 獨活寄生貼對小鼠熱板痛閾值的影響（ ±s，n＝10）Fig 7 Effect of Duhuo Jisheng paste on pain threshold of mouse pain model induced by hot plate method（ ±s，n＝10）

4 討論

中藥穴位敷貼是在中醫理論指導下，將藥物制成需要的穴位貼，用于特定穴位。穴位貼通過化學、溫度等方式刺激穴位發揮作用。穴位敷貼作用機制描述為“切于皮膚，徹于肉理。攝于吸氣，融于滲液”。膏方用藥，其法通于湯丸，凡湯丸行之有效者，其方皆可熬膏以用。因此本文以獨活寄生湯為基礎，改變其湯劑為貼劑。

獨活寄生貼在中醫理論指導下，方中各味藥按照君臣佐使的配伍關系，相互協調發揮治療作用。藥理研究發現，該貼劑的各味藥具有抗炎、鎮痛、抗氧化、免疫抑制等作用，可預防和治療關節炎。

研究表明，致病大鼠外周血T細胞遷移到病變的關節組織，或許是與參與關節免疫損傷有關，導致血T細胞比例降低[12]。循環系統和關節腔中的T細胞過度活化，導致T細胞功能紊亂、Th1/Th2細胞失衡、調節性T細胞異常等免疫應答[13]。病變關節組織的T細胞和關節滑膜組織的纖維細胞樣滑膜細胞相結合，以組織相容性復合體-Ⅱ（MHCⅡ）類分子依賴的方式遞呈修飾后自身的抗原，活化T細胞，促進B細胞生成自身抗體，形成免疫復合物，沉積在關節組織，進一步加速免疫反應，參與滑膜炎癥反應[14]。Th1、Th2細胞分泌腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-1β等炎性因子加速破骨細胞形成，參與骨與軟骨的破壞，促進關節炎病理損傷[15-16]。炎癥相關因子持續影響著關節炎的發生與發展進程。關節炎發生后，在炎性因子的刺激下，關節內產生炎性反應，NF-κB通路被激活，導致下游白介素系列炎性因子大量增多。在相關因子的作用下，軟骨細胞的結構和功能被破壞，導致關節軟骨基質損傷與衰減[17]。

本研究采用CFA制備AA模型，模型大鼠關節存在與AA相似的滑膜病理改變和骨質破壞。模型組大鼠造模后，精神倦怠、食欲減退、四肢出現明顯紅腫及變形、足趾腫脹度和關節炎指數顯著升高，顯示造模成功。大鼠踝關節滑膜細胞增生明顯，可見滑膜組織充血、炎癥細胞浸潤、軟骨細胞破壞、血管翳生成，表明模型大鼠體內炎癥反應加劇，關節結構破壞嚴重。因此本研究檢測IL-1β、IL-10水平，研究獨活寄生貼對關節炎的作用，結果與正常對照組比較，模型組大鼠血清中IL-1β水平顯著升高，IL-10水平顯著降低；與模型組比較，陽性對照組、治療組大鼠血清中IL-1β水平顯著下降，IL-10水平出現不同程度的升高。提示該貼劑可能參與了關節炎的發生發展，不僅減少了關節炎性損傷，而且明顯減輕了關節病理損傷。

脾臟和胸腺是機體發揮免疫作用的關鍵器官，常用其指數的高低來反映免疫器官發育的程度，脾臟和胸腺發育越好，質量越大，機體的免疫能力越強[18]。本實驗通過稱質量大鼠的脾臟、胸腺的重量，計算其指數，評估該貼劑對免疫系統的作用。結果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠胸腺、脾臟指數顯著升高，標志著AA大鼠免疫系統的激活，滑膜組織中炎癥因子釋放，發生炎癥癥狀。經獨活寄生貼干預后，與模型組比較，陽性藥物組、治療組大鼠胸腺、脾臟指數明顯降低，提示治療組能在一定程度上改善大鼠的免疫功能。同時大鼠造模成功后，炎性反應發生，導致模型組大鼠的足腫脹程度增高。給予穴位貼敷后，抑制炎性的發生，陽性對照組、治療組足腫脹度降低。

綜上，獨活寄生貼對AA大鼠具有一定的防治作用，可明顯減輕大鼠足腫脹程度、踝關節滑膜炎癥。其作用機制可能與IL-1β和IL-10水平有關，可抑制炎性反應，提高機體免疫力，本研究對獨活寄生貼的開發與應用具有一定的指導作用。