鳳丹皮內生真菌Alternaria arborescens發酵產物中甾醇類化合物

翟曉東，孫磊，吳德玲，許鳳清（安徽中醫藥大學藥學院 中藥飲片制造新技術安徽省重點實驗室，合肥 230012）

牡丹皮Cortex Moutan始載于《神農本草經》，性微寒，味苦，辛，為清熱涼血、活血化瘀之要藥。安徽省銅陵市自晉代就有栽培牡丹的記載，距今已有1700多年的歷史，其中鳳凰山所出者因皮厚、木心小、香氣足、療效好享有道地藥材之美譽。道地藥材是植物基因組、植物外環境（土壤、氣候、生物等因素）以及植物內環境（內生菌群、pH等）相互作用的產物[1]。內生真菌（endophytic fungi）是指生活在宿主植物組織中，與宿主植物共生時期對宿主植物組織沒有引起明顯病害癥狀并與宿主植物共生互惠的真菌[2]。其對宿主的促生長、抗逆性、促進活性物質生成和積累、吸附重金屬等功能是道地藥材形成的重要因子[3-4]。本實驗前期對鳳丹皮不同生長期內生真菌多樣性研究中，分離并鑒定了9屬13種內生真菌，并運用生物發酵工程研究分離純化得到的Aspergillus sp. MBL1612、Fusarium oxysporum和Fusarium acutatum等菌株的次生代謝產物[5-8]。本文報道來源于鳳丹皮中的一株優勢菌株Alternaria arborescens，經液體發酵產生的麥角甾醇類成分的分離和結構鑒定工作。

1 材料

1.1 儀器與試藥

捷歐路JNM-ECP 600 MHz型核磁共振波譜儀（日本電子株式會社）；Agilent 1260 Infinity 2液相色譜系統（Agilent公司）；SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；萬分之一電子天平（EL104型）；低溫冰箱50 L（海信集團有限公司）；生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；YMC-Pack ODS-A色譜柱（粒徑：5 μm，孔徑：12 nm；250 mm×10.0 mm）；Sephadex LH-20（GE公司）；柱色譜硅膠（200～300目）、薄層色譜用硅膠板（GF254）（青島海洋化工廠）；甲醇、乙腈（色譜純，TEDIA公司）；其他試劑均為分析純；水為純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；顯色劑為10%硫酸-乙醇溶液（105℃加熱顯色）。

1.2 菌株來源及鑒定

新鮮鳳丹皮塊根于2017年采集安徽省銅陵市鳳凰山鐵山村鳳丹種植基地，經安徽中醫藥大學方成武教授鑒定為芍藥科芍藥屬Paeonia ostiiT. Hong et J. X. Zhang的新鮮植株。按文獻[9]進行分離純化，經上海生工生物工程有限公司進行分子鑒定。大致流程為：純化的菌株經PDA平板培養5 d，依據《真菌鑒定手冊》對真菌菌落、培養特征、菌絲形態、產孢結構類型以及孢子的形態、顏色、大小進行初步鑒定分類；同時將菌絲置于無菌研缽中研磨（液氮），參照試劑盒步驟進行操作提取DNA，進行rDNA-ITS的PCR擴增[上游引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，下游引物ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3']，將PCR擴增產物交由海生工生物工程股份有限公司進行測序，測序結果與GenBank 數據庫中的已知序列進行 NCBI BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）比對分析，尋找具有較高同源性的16S rDNA 序列，經基因測序對比后鑒定為Alternaria arborescens（GenBank：AF347033），現保存于安徽中醫藥大學天然藥物化學研究室（樣本憑證號m 26）。

1.3 培養基

PDA培養基：每500 mL培養基中含去皮馬鈴薯100 g、磷酸二氫鉀1.5 g、蛋白胨0.5 g、葡萄糖10 g、維生素B 55 mg、硫酸鎂0.75 g，最后加入氫氧化鈉，調節pH值至5.5～6.0。每500 mL加3.0 g瓊脂粉。將PDA培養基放入500 mL錐形瓶中，用鋁箔封口，高壓滅菌30 min，趁熱導入已滅菌的冷卻干燥培養皿中，凝固冷卻，備用。大米固體培養基：取100 g大米，120 mL超純水于500 mL錐形瓶中，封口。放入高壓蒸汽滅菌鍋120℃滅菌30 min，備用。

2 發酵、提取與分離

2.1 液體發酵

將保存于－18℃冰箱的斜面培養基的Alternaria arborescens接種于PDA平板，在恒溫培養箱中28℃培養6 d，待菌種長至約2/3平板，觀察菌落形態，挑選無污染長勢良好的平板，用接種環挑取菌落周圍新長出的菌絲，接種于多個PDA平板中，培養8 d待菌種鋪滿整個平板時，將其用打孔器制成約6 mm的圓片，接種于已滅菌的液體培養基中，設置溫度28℃，轉速150 r·min－1的全溫振蕩培養箱中培養15 d。共培養120瓶。

2.2 發酵產物的提取與分離

將內生真菌Alternaria arborescens的發酵產物過濾，得到菌絲體和發酵液。將過濾得到的菌絲置于三角燒瓶中，加乙醇35℃超聲提取30 min 3次，過濾，收集浸提液，減壓濃縮至無醇，混入發酵液中，濃縮至500 mL。乙酸乙酯萃取，合并萃取液，減壓回收溶劑，得到浸膏乙酸乙酯部位（16.8 g）。取乙酸乙酯萃取部位16.0 g，經硅膠柱色譜（石油醚-乙酸乙酯比例為39∶1、19∶1、9∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、0∶100，每200 mL一個流分，各2 L）洗脫，經TLC檢識合并得到8個流分Fr.1～Fr.8。流分Fr.2經硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯（9∶1）洗脫，重結晶得到化合物6（118 mg）。流分Fr.3通過硅膠柱（石油醚-丙酮比例為9∶1、4∶1、1∶1、0∶100）洗脫，使用TLC檢識合并得到5個流分Fr.3.1～Fr.3.5。將Fr.3.2部位（250 mg）經制備液相（甲醇-水＝98∶2，流速3 mL·min－1，檢測波長210 nm）得到化合物2（16 mg，tR＝22.5 min）和5（9 mg，tR＝18.3 min）。流分Fr.3.3（450 mg）依次經Sephadex LH-20柱色譜（二氯甲烷-甲醇＝1∶1）、制備液相（甲醇-水＝95∶5，流速3 mL·min－1，檢測波長210 nm，tR＝8.5 min）得到化合物1。將流分Fr.4經硅膠柱色譜（石油醚-乙酸乙酯的比例為7∶1、4∶1、1∶1、0∶100）洗脫，經TLC檢識合并得到4個流分Fr.4.1～Fr.4.4。流分Fr.4.3依次經Sephadex LH-20柱色譜（二氯甲烷-甲醇＝1∶1）、制備液相（甲醇-水＝90∶10，流速3 mL·min－1，檢測波長210 nm，tR＝32 min）得到化合物3（4 mg）。流分Fr.5經Sephadex LH-20柱色譜（二氯甲烷-甲醇＝1∶1）、制備液相（甲醇-水＝100∶0，流速3 mL·min－1，檢測波長210 nm，tR＝10.5 min）得到化合物4（10 mg），化合物結構見圖1。

圖1 化合物1～6的結構式Fig 1 Chemical structure of compound 1～6

3 結構鑒定

化合物1白色針狀結晶（二氯甲烷∶甲醇＝1∶1），10%硫酸乙醇顯色為紫紅色。ESI-MSm/z：431.3[M＋Na]＋；1H NMR（CDCl3，600 MHz）δ：5.33（1H，dt，J＝7.2、2.4 Hz，H-7），5.20（1H，dd，J＝15.0、7.2 Hz，H-23），5.13（1H，dd，J＝15.0、8.4 Hz，H-22），4.04（1H，m，H-3），3.61（1H，br s，H-6），2.11（1H，t，J＝12.0 Hz，H-4a），2.03（1H，dt，J＝12.0、4.2 Hz，H-12a），2.00（1H，m，H-20），1.83（2H，m，H-15），1.95（1H，m，H-9），1.88（1H，m，H-14），1.83（1H，m，H-24），1.75（1H，dd，J＝13.2，4.8 Hz，H-4b），1.71、1.26（1H each，m，H-15），1.60、1.53（1H each，m，H-1），1.54（2H，m，H-11），1.46（1H，m，H-25），1.41（2H，m，H-16），1.30（1H，m，H-12b），1.28（1H，m，H-17），1.07（3H，s，H-19），1.01（3H，d，J＝6.6 Hz，H-21），0.90（3H，d，J＝7.8 Hz，H-28），0.82（3H，d，J＝6.4 Hz，H-27），0.80（3H，d，J＝6.6 Hz，H-26），0.59（3H，s，H-18）；13C NMR（CDCl3，150 MHz）δ：144.10（s，C-8），135.44（d，C-22），132.26（d，C-23），117.62（d，C-7），76.03（s，C-5），73.75（d，C-6），67.81（d，C-3），56.07（d，C-17），54.83（d，C-14），43.84（s，C-13），43.56（d，C-9），42.89（d，C-24），40.47（d，C-20），39.55（t，C-4），39.30（t，C-12），37.22（s，C-10），33.15（d，C-25），33.05（t，C-1），30.94（t，C-2），27.98（t，C-16），22.96（t，C-15），22.13（t，C-11），21.19（q，C-21），20.02（q，C-27），19.72（q，C-26），18.92（q，C-19），17.66（q，C-28），12.41（q，C-18）。以上數據與文獻[10]報道一致，故化合物1 鑒定為（22E，24R）-麥角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇。

化合物 2白色針狀結晶（二氯甲烷∶甲醇＝1∶1），10%硫酸乙醇顯色為紫紅色。ESI-MSm/z：396.3 [M＋H]＋；1H NMR（CDCl3，600 MHz）δ：5.57（1H，d，J＝4.4 Hz，H-6），5.38（1H，d，J＝4.4 Hz，H-7），5.20（1H，dd，J＝15.2、7.2 Hz，H-23），5.14（1H，dd，J＝15.2、7.2 Hz，H-22），3.61（1H，m，H-3），1.03（3H，d，J＝6.4 Hz，H-21），0.95（3H，s，H-19），0.91（3H，d，J＝6.8 Hz，H-28），0.85（3H，d，J＝6.4 Hz，H-27），0.82（3H，d，J＝6.0 Hz，H-26），0.63（3H，s，H-18）；13C NMR（CDCl3，150 MHz）δ：141.45（s，C-8），139.86（s，C-5），135.64（d，C-22），132.06（d，C-23），119.67（d，C-6），116.36（d，C-7），70.55（d，C-3），55.82（d，C-17），54.64（d，C-14），46.33（d，C-9），42.92（d，C-24），42.90（s，C-13），40.88（t，C-4），40.49（d，C-20），39.16（t，C-12），38.45（t，C-1），37.11（s，C-10），33.17（d，C-25），32.08（t，C-2），28.36（t，C-16），23.07（t，C-15），21.19（t，C-11），21.18（q，C-21），20.03（q，C-27），19.72（q，C-26），17.68（q，C-28），16.35（q，C-19），12.13（q，C-18）。以上數據與文獻[11]報道一致，故化合物2鑒定為麥角甾醇。

化合物3白色針狀結晶（二氯甲烷∶甲醇＝1∶1），10%硫酸乙醇顯色為紫紅色。ESI-MSm/z：429.3 [M＋H]＋；1H NMR（MeOD，600 MHz）δ：6.52（1H，d，J＝8.4 Hz，H-6），5.27（1H，d，J＝8.4 Hz，H-7），5.22（1H，dd，J＝15.6、7.6 Hz，H-23），5.17（1H，dd，J＝15.6、6.8 Hz，H-22），3.77（1H，m，H-3），1.01（3H，d，J＝6.4 Hz，H-21），0.92（3H，d，J＝6.8 Hz，H-28），0.90（3H，s，H-19），0.85（3H，s，H-18），0.85（3H，d，J＝6.4 Hz，H-27），0.83（3H，d，J＝6.0 Hz，H-26）；13C NMR（MeOD，150 MHz）δ：136.90（d，C-6），136.90（d，C-22），133.56（d，C-23），131.81（d，C-7），83.57（s，C-5），80.84（s，C-8），67.08（d，C-3），57.67（d，C-17），53.20（d，C-14），52.85（d，C-9），45.85（d，C-24），44.41（t，C-4），41.19（s，C-13），40.77（d，C-20），38.25（t，C-12），37.86（s，C-10），36.00（d，C-25），34.45（t，C-2），30.96（t，C-1），29.87（t，C-16），24.49（t，C-15），21.85（t，C-11），21.47（q，C-21），20.03（q，C-27），20.17（q，C-26），18.58（q，C-28），18.26（q，C-19），13.37（q，C-18）。以上數據與文獻[10-12]報道一致，故化合物3鑒定為5α，8α-環氧-（22E，24R）麥角甾-6，22-二烯-3β-醇。

化合物4白色針狀結晶（二氯甲烷∶甲醇＝1∶1），10%硫酸乙醇顯色為紫紅色。ESI-MSm/z：427.3[M＋H]＋；1H NMR（CDCl3，600 MHz）δ：6.58（1H，d，J＝8.4 Hz，H-6），6.27（1H，d，J＝8.4 Hz，H-7），5.41（1H，dd，J＝6.0、1.8 Hz，H-11），5.21（1H，dd，J＝15.6、7.2 Hz，H-23），5.13（1H，dd，J＝15.6、8.4 Hz，H-22），3.98（1H，m，H-3），2.23（1H，dd，J＝16.8、6.0 Hz，H-12a），2.05（1H，d，J＝16.8，H-12b），0.98（3H，d，J＝6.6 Hz，H-21），1.08（3H，s，H-19），0.98（3H，d，J＝6.8 Hz，H-28），0.82（3H，d，J＝6.4 Hz，H-27），0.80（3H，d，J＝6.0 Hz，H-26），0.72（3H，s，H-18）；13C NMR（CDCl3，150 MHz）δ：142.61（s，C-9），135.56（d，C-6），135.18（d，C-22），132.48（d，C-23），130.81（d，C-7），119.93（d，C-11），82.87（s，C-5），78.47（s，C-8），66.47（d，C-3），55.94（d，C-17），48.24（d，C-14），43.67（s，C-13），42.89（d，C-24），41.18（t，C-12），39.96（d，C-20），38.03（s，C-10），36.15（t，C-4），33.17（d，C-25），32.65（t，C-1），30.68（t，C-2），28.69（t，C-16），25.61（q，C-19），20.95（t，C-15），20.78（q，C-21），20.00（q，C-26），19.70（q，C-27），17.61（q，C-28），13.02（q，C-18）。以上數據與文獻[11]報道一致，故化合物4 鑒定為5α，8α-環氧-（22E，24R）麥角甾-6，9，22-三烯-3β-醇。

化合物5白色針狀結晶（二氯甲烷-甲醇＝1∶1）；10%硫酸-乙醇顯色為紫紅色斑點。ESIMSm/z：399.4 [M＋H]＋；1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：5.35（1H，m，H-6），5.21（1H，dd，J＝15.0，7.8 Hz，H-23），5.15（1H，dd，J＝15.0、9.0 Hz，H-22），3.61（1H，m，H-3），1.03（3H，s，H-19），0.98（3H，d，J＝6.6 Hz，H-21），0.96（3H，d，J＝7.8 Hz，H-28），0.88（3H，d，J＝6.4 Hz，H-27），0.86（3H，d，J＝6.6 Hz，H-26），0.65（3H，s，H-18）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：139.04（s，C-8），135.23（d，C-22），131.42（d，C-23），117.15（d，C-7），70.80（d，C-3），55.84（d，C-17），55.01（s，C-14），49.42（d，C-9），43.15（d，C-13），42.74（d，C-24），40.42（d，C-20），40.23（d，C-5），39.42（t，C-12），37.94（t，C-4），37.13（t，C-1），34.12（s，C-10），33.06（d，C-25），31.45（t，C-6），29.62（t，C-2），28.16（t，C-16），22.91（t，C-15），21.54（t，C-11），21.12（q，C-21），19.94（q，C-27），19.61（q，C-26），17.53（q，C-28），13.04（q，C-19），12.15（q，C-18）。以上數據與文獻[13]報道一致，故鑒定化合物 5為麥角甾-7，22-二烯-3β-醇。

化合物6白色針狀結晶（石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1）；10%硫酸-乙醇顯色為紫紅色斑點。ESI-MSm/z：415.4 [M＋H]＋。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：5.33（1H，m，H-6），3.48（1H，m，H-3），0.99（3H，s，H-19），0.90（3H，d，J＝6.5 Hz，H-21），0.82（3H，t，J＝7.2 Hz，H-29），0.81（3H，d，J＝6.6 Hz，H-26），0.79（3H，d，J＝6.6 Hz，H-27），0.69（3H，s，H-18）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：140.84（s，C-5），121.79（d，C-6），71.89（d，C-3），56.85（d，C-14），56.14（d，C-17），50.22（d，C-9），45.92（d，C-24），42.20（s，C-13），42.38（t，C-4），39.86（t，C-12），37.34（t，C-1），36.59（s，C-10），36.23（d，C-20），34.03（t，C-22），31.99（t，C-2、-7），31.74（d，C-8），29.24（d，C-25），28.33（t，C-16），26.16（t，C-23），24.38（t，C-15），23.15（t，C-28），21.16（t，C-11），19.90（q，C-26），19.48（q，C-27），19.11（q，C-19），18.86（q，C-21），12.06（q，C-29），11.94（q，C-18）。以上數據與文獻[14]報道一致，故鑒定化合物6為β-谷甾醇。

4 結論

本文從鳳丹皮內生真菌Alternaria arborescens的液態發酵物中分離得到6個甾醇類化合物。甾醇類成分作為一類重要醫藥化工原料，在氧化、抗菌、抗腫瘤、抗補體以及減少心腦血管疾病的發病率方面發揮著積極的作用[15]。隨著黃體酮和氫化可的松等甾體類激素的微生物全合成的實現，甾體制藥技術迎來一個全新階段[16]。內生真菌Alternaria arborescens在液體培養基中產生過氧麥角甾醇在抗炎、降血糖等方面發揮較好的活性[17-18]。內生真菌的次生代謝產物受培養基及培養方式影響較大，后續的研究工作將著眼于菌株培養條件的篩選，以期固化發酵工藝，綜合藥效學研究結果，合理開發利用該菌株。