RGD和泊洛沙姆F127共修飾載多西紫杉醇脂質體的制備及體外抗卵巢癌的初步研究

馬寧珠，王振霖，張建國，齊娜，2*（. 桂林醫學院藥學院，廣西 桂林 54004；2. 南方醫科大學中西醫結合醫院，廣州 5035）

卵巢癌是危及女性健康和生命的惡性腫瘤之一，其病死率居婦科腫瘤之首[1]。2020年數據統計顯示，全球卵巢癌新增患者約31萬人，死亡人數約20萬，具有明顯的上升趨勢[2]。卵巢癌發病隱匿，臨床確診多為晚期，對于早期癌癥手術治療有效，但中晚期手術治療不能完全切除，預后不良，且易復發和轉移[3]，在臨床治療中化療藥物發揮著至關重要的作用。

大多數化療藥物存在水溶性差、生物相容性低、體內分布廣等問題[4]。此外，化療藥物生物選擇性差，進入體內后殺傷腫瘤細胞的同時會對正常細胞、組織機體造成巨大的毒副作用，降低患者的生活質量，制約了其臨床應用[5]。為解決這一系列問題，需要尋找合適的藥物遞送系統降低不良反應。脂質體是由膽固醇和磷脂及其衍生物在體外自我組裝形成的囊泡，其結構類似于細胞膜的磷脂雙分子層，具有良好的生物相容性和細胞親和力[6]，同時，納米脂質體通過注射能夠滲透、滯留于腫瘤部位，將藥物帶入腫瘤細胞內，是一種優良穩定的藥物遞送系統。

腫瘤細胞增殖快，與正常組織有較大差異，其組織內血管間隙大、淋巴管不完整，脂質體因其獨特的尺寸和結構，以及具有高滲透和滯留效應（EPR效應），能通過被動靶向作用積聚于腫瘤組織，但是其腫瘤富集是有限的[7]。為實現藥物精準給藥，單靠EPR效應遠遠不夠，主動靶向是解決藥物腫瘤富集率低和降低正常細胞的毒副作用的有效方案[8]。腫瘤微環境復雜，與正常細胞相較，整合素家族在腫瘤細胞中過度表達[9]。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列（RGD）可以與細胞膜表面的跨膜黏附蛋白整合素特異性結合[10]。經聚乙二醇化（PEG）和RGD修飾后，脂質體可以延長體內循環時間，具有相關腫瘤新生血管和腫瘤細胞的主動靶向能力[11]。泊洛沙姆是由聚環氧乙烷（PEO）和聚環氧丙烷（PPO）組成的兩親性三嵌段共聚物，具有無毒性和良好的生物相容性等優點[12-13]，是一種可靜脈注射的高分子非離子表面活性劑，其兩端的親水嵌段可以抑制血小板聚集，延長體內循環時間[14]。中間的疏水嵌段可以嵌入磷脂雙分子層，不同嵌段的泊洛沙姆可以調控脂質體形態結構，增強脂質體的穩定性和細胞內化水平[15]。本研究選取多西紫杉醇（DTX）為模型藥物，DTX可影響腫瘤細胞微管蛋白聚合和解聚，使細胞G2/M期受到阻滯，達到抑制腫瘤細胞生長作用[16]。DTX包載于脂質體疏水域，RGD修飾在表面，泊洛沙姆F127鑲嵌其中，以期增加藥物溶解性，延長循環時間，提高內化水平，實現藥物靶向遞送，降低全身毒副作用，提高生存期和抗腫瘤效果。

1 材料

1.1 試藥

蛋黃卵磷脂（Epc，美國SBTI公司）；膽固醇（Chol，上海行知化工廠）；DTX（北京諾瑞醫藥技術有限公司）；泊洛沙姆F127（德國BASF公司）；RGD-DSPE-PEG2000（上海芃碩生物科技有限公司）；DMEM高糖培養基（美國Gibco公司）；胎牛血清（FBS）、PBS緩沖液、青鏈霉素混合液、0.25%胰蛋白酶細胞消化液（北京索萊寶科技有限公司）；香豆素-6（廣州日化化工有限公司）；Hoechst 33342染色劑、抗熒光萃滅封片液（碧云天生物技術有限公司）；4%多聚甲醛（上海如吉生物科技發展有限公司）；SKOV3卵巢癌細胞（桂林醫學院科學實驗中心惠贈）。

1.2 儀器

R-1001W旋轉蒸發儀（鄭州長城科工貿有限公司）；DZF-300真空干燥箱（上海喆鈦機械制造有限公司）；20-AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；2D-85恒溫振蕩器（常州國華儀器）；UV-1800 PC紫外可見分光光度計（上海美普達儀器有限公司）；Nano ZSE粒徑電位分析儀（英國馬爾文儀器公司）；AXio Imager z2倒置熒光顯微鏡（日本ZEISS公司）。

2 方法與結果

2.1 DTX分析方法學

配制50 μg·mL－1的DTX溶液，以甲醇為溶劑作為空白，在200～800 nm波長內進行紫外掃描[17]，結果DTX在230 nm處有最大吸收峰，后續實驗選擇230 nm作為其檢測波長。分別配制20.0、40.8、61.2、81.6、102.0、204.0 μg·mL－1的DTX對照品溶液進樣，記錄峰面積，以DTX質量濃度C為橫坐標，峰面積A為縱坐標，得到線性回歸方程A＝1.277×104C－1.970×104，r＝0.997，結果顯示DTX在20～ 204 μg·mL－1與峰面積線性關系良好。配制30.6 μg·mL－1DTX對照品溶液，連續進樣5次，記錄峰面積并計算日內精密度[18-19]，結果顯示，RSD值為0.5%，說明實驗測量準確，儀器精密度高，可用于分析結果。取載DTX脂質體樣品、DTX對照品以及空白脂質體樣品進樣，記錄峰面積，考察專屬性[20]，結果如圖1所示，DTX的HPLC色譜圖基線平穩，峰形穩定。圖1B顯示DTX的保留時間為6.520 min，結合圖1A中空白脂質體甲醇溶液僅有溶劑峰，并不影響DTX出峰及峰形，專屬性良好。

圖1 HPLC專屬性實驗Fig 1 HPLC specific experimental

2.2 脂質體的制備

采用薄膜水化法制備脂質體，按摩爾比95∶20∶5∶0.1∶2精確稱量Epc、Chol、DTX、RGD-DSPE-PEG2000、泊洛沙姆F127溶于5 mL氯仿中，轉移至250 mL圓底燒瓶，37℃水浴中減壓蒸發15 min使有機溶劑揮發成膜（90 r·min－1），37℃真空干燥2 h后，加入5 mL pH為7.4的PBS溶液水化30 min（90 r·min－1），水化完成后轉移至西林瓶，150 W下超聲3 min得到RGD和泊洛沙姆F127共修飾的載多西紫杉醇脂質體（DTX-F127-RGD-LP），封口后于4℃冰箱冷藏[21-22]。DTX-LP、DTX-F127-LP和DTX-RGD-LP根據上述方法進行制備。用香豆素-6（C6）代替DTX，根據上述方法制備載香豆素-6熒光探針的脂質體C6-LP、C6-F127-LP、C6-RGD-LP和C6-F127-RGD-LP，全程注意避光。

2.3 脂質體的初步表征

2.3.1 形態觀察 取適量DTX-F127-RGD-LP脂質體用1%磷鎢酸負染滴入銅網，放入干燥皿中過夜，干燥后使用透射電子顯微鏡觀察形態[23]。DTX-F127-RGD-LP透射電子顯微鏡圖片如圖2所示，脂質體呈球形囊泡狀，大小基本均一。

圖2 DTX-F127-RGD-LP脂質體透射電子顯微鏡圖Fig 2 Transmission electron micrograph of DTX-F127-RGD-LP liposomes

2.3.2 電位與粒徑的測定 各組脂質體稀釋10倍后，置于比色皿中，使用馬爾文粒徑電位測量儀測量脂質體粒徑與電位。結果如表1和圖3所示，各組脂質體粒徑均在200 nm以下，多分散指數（PDI）在0.23左右，脂質體分散良好，符合制劑要求。DTX-F127-RGD-LP粒徑和電位，近似正態分布。粒徑為（107.2±0.67）nm，電位為－（19.7±0.4）mV，脂質體表面帶負電荷更具有穩定性。

表1 各組脂質體的粒徑和電位Tab 1 Particle size and potential of liposomes in each group

圖3 DTX-F127-RGD-LP的粒徑分布（A）和Zeta電位（B）Fig 3 Particle size distribution（A）and Zeta potential（B）of DTXF127-RGD-LP

2.3.3 包封率和載藥量的測定 取DTX-LP、DTXRGD-LP、DTX-F127-RGD-LP各1 mL于透析袋中，置于pH 7.4（0.01 mol·L－1）的PBS緩沖溶液中，使用恒溫振蕩器透析8 h（37℃，130 r·min－1），透析后轉移至10 mL量瓶定容，超聲破乳，過0.22 μm微孔濾膜，另取1 mL未透析過的脂質體按以上方法處理，進樣測定其含藥量。按下述公式計算各組脂質體中藥物的包封率和載藥量[22]：包封率（EE，%）＝（包封于脂質體內的藥量/藥物投料量）×100%，載藥量（DL，%）＝（包封于脂質體內的藥量/載藥脂質體的總重量）×100%。

結果如表2所示，DTX-LP包封率為82.7%，載藥量為2.5%，DTX-RGD-LP包封率為80.5%，載藥量為2.4%，DTX-F127-RGD-LP包封率為86.4%，載藥量為2.7%。泊洛沙姆F127的鑲嵌增加了DTX在脂質體中的包封率。

表2 多西紫杉醇的包封率和載藥量Tab 2 Entrapment efficiency and loading efficiency of docetaxel

2.4 脂質體穩定性實驗

將制備好的各組脂質體于4℃避光保存，檢測保存33 d脂質體的平均粒徑，并根據粒徑變化來評價其長期穩定性[24]。采用FBS模擬血漿環境。將各組含DTX質量濃度為200 μg·mL－1的脂質體與10%FBS等體積混合，置于振蕩器內，37℃、150 r·min－1振搖24 h，定時取樣測其粒徑變化來評價其血清穩定性[25]。

脂質體放置33 d的體外長期穩定性結果如圖4A所示，DTX-LP和DTX-RGD-LP隨時間變化粒徑略微增大，而加入泊洛沙姆F127的脂質體不同時間粒徑幾乎不變。結果表明，制備的脂質體在33 d內相對穩定。脂質體在體內容易與血清白蛋白等大分子蛋白結合形成蛋白冠，影響其在體內的預期功能，無法發揮治療作用。各組脂質體與含FBS的培養基共同孵育24 h，結果如圖4B所示，各脂質體粒徑在前4 h略有波動，但在合理范圍內。在之后的20 h內，粒徑無明顯變化，也未見沉淀物，表明幾乎沒有血清白蛋白吸附在脂質體上，PEG有效避免了蛋白冠的形成，脂質體在血液中具有良好的穩定性。

圖4 各組脂質體的穩定性Fig 4 Stability of liposomes in each group

2.5 細胞攝取實驗

攝取定性：實驗分為5組，分別為Control組、C6-LP組、C6-F127-LP組、C6-RGD-LP組和C6-F127-RGD-LP組。細胞爬片放置于6孔板中，取2 mL細胞懸液按2×105個/孔將SKOV3細胞接種至6孔板中，5%CO2、37℃條件下孵育24 h。細胞單層覆蓋至70%時，分別加入2 mL培養基和香豆素-6質量濃度為2 μg·mL－1的脂質體（即C6-LP、C6-F127-LP、C6-RGD-LP和C6-F127-RGD-LP），37℃條件下孵育4 h后吸出培養基，PBS緩沖溶液洗滌3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌多余固定液。加入2 mL Hoechst 33342（15 μg·mL－1）核染色劑染色10 min，PBS洗滌3次，晾干，抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡觀察細胞熒光情況[26-27]。

攝取定量：實驗分為4組，分別為C6-LP組、C6-F127-LP組、C6-RGD-LP組和C6-F127-RGD-LP組。將SKOV3細胞按5000個/孔密度接種至96孔黑板，分別加入100 μL C6-LP、C6-F127-LP、C6-RGD-LP和C6-F127-RGD-LP（2 μg·mL－1），按上述孵育條件孵育4 h，洗滌后加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO）裂解細胞，靜置15 min，使用全波長熒光酶標儀（Ex＝466 nm，Em＝504 nm）檢測熒光強度[28]。

SKOV3對細胞的攝取如圖5A所示，Control組幾乎沒有熒光，C6-LP具有微弱熒光，C6-RGD-LP顯示中等強度的熒光，C6-F127-RGD-LP熒光強度最強。由圖5B熒光定量可知，與C6-LP相比，C6-RGD-LP熒光強度明顯增加，說明RGD修飾脂質體后選擇性提高了SKOV3細胞對熒光脂質體的攝取。與C6-RGD-LP相比，C6-F127-RGD-LP的熒光強度增加，表明泊洛沙姆F127鑲嵌于RGD脂質體后，SKOV3細胞對其攝取量增加，推測泊洛沙姆F127鑲嵌磷脂雙分子層后選擇性提高了腫瘤細胞對目標性脂質體的攝取。RGD和泊洛沙姆F127修飾脂質體后，促進SKOV3細胞攝取脂質體的機制如圖5C所示，推測其原因為RGD與腫瘤細胞表面過表達的αvβ3整合素蛋白結合，通過受體與配體結合促進細胞攝取脂質體，泊洛沙姆F127促進細胞膜流動，增加細胞內化作用。

圖5 細胞攝取結果Fig 5 Cell uptake

2.6 攝取抑制實驗

將SKOV3細胞按照5000/孔接種至96孔黑板，孵育24 h后棄去培養基，對照組用DMEM培養基培養2 h，實驗組加入攝取抑制劑阿米洛利（15 μg·mL－1）、氯丙嗪（10 μg·mL－1）、菲律平（5 μg·mL－1）、秋水仙堿（5 μg·mL－1）以及RGD（200 μg·mL－1），37℃條件下孵育2 h，PBS洗滌3次，加入含C6質量濃度為1.5 μg·mL－1的C6-F127-RGD-LP孵育4 h，PBS洗滌3次，加入150 μL DMSO裂解細胞，靜置15 min。使用全波長熒光酶標儀（Ex＝466 nm，Em＝504 nm）檢測熒光強度[29]。

結果如圖6所示，SKOV3細胞與攝取抑制劑孵育后封閉攝取受體，能夠降低對C6-F127-RGD-LP的攝取。與對照組相比，巨胞飲抑制劑秋水仙堿和小窩蛋白抑制劑菲律平攝取率下降較明顯，與對照組存在統計學差異。Na＋/H＋交換體抑制劑阿米洛利和網格蛋白抑制劑氯丙嗪攝取率無明顯降低。SKOV3細胞主要通過小窩蛋白途徑和巨胞飲途徑攝取脂質體。此外，靶向阻斷劑RGD也抑制C6-F127-RGD-LP的攝取，其攝取率降低，與對照組差異存在統計學意義。

圖6 C6-F127-RGD-LP對SKOV3細胞攝取機制結果Fig 6 Uptake mechanism of C6-F127-RGD-LP to SKOV3 cells

2.7 細胞毒性實驗

SKOV3細胞以1×104個/孔密度接種于96孔板，37℃、5%CO2培養箱中培養24 h。吸去培養基，加入100 μL質量濃度為0.2、0.4、0.08、0.016 μg·mL－1的DTX原料藥或各組脂質體，孵育48 h后每孔加入10 μL 噻唑藍（MTT）孵育4 h，孵育結束后，加入150 μL DMSO，孵育15 min，560 nm處測量吸光度，計算細胞存活率，細胞存活率（%）＝（實驗組吸光度/空白組吸光度）×100%[30-31]。

如表3所示，DTX、DTX-LP、DTX-F127-LP、DTX-RGD-LP和DTX-F127-RGD-LP的IC50值分別為0.210、0.152、0.109、0.079、0.039 μg·mL－1，IC50值越小代表對細胞的毒性越強。細胞存活率如圖7所示，各組脂質體對SKOV3細胞的毒性呈現濃度依賴性，隨著濃度的增加，與DTX原料藥相比毒性效果明顯。藥物質量濃度在0.04 μg·mL－1時，與DTX組相比，包載DTX的脂質體對細胞的毒性顯著增強。在0.2 μg·mL－1時，泊洛沙姆F127或RGD的加入進一步增強了細胞的毒性，且DTX-RGD-LP比DTX-F127-LP有更強的細胞殺傷效果，差異具有統計學意義。泊洛沙姆F127和RGD共同修飾后，可協同增強細胞毒性，有最小的IC50值，與細胞攝取實驗結果一致，可能與卵巢癌細胞對脂質體的攝取量增加有關。

表3 各組脂質體對SKOV3細胞的IC50值Tab 3 IC50 value of liposomes and DTX to SKOV3 cells

圖7 SKOV3細胞存活率（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）Fig 7 Viability rate of SKOV3 cells（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

2.8 結晶紫染色觀察凋亡

SKOV3細胞以1×105個·mL－1密度接種于6孔板中，孵育24 h后加入2 mL含0.2 μg·mL－1DTX、DTX-LP、DTX-F127-LP、DTX-RGD-LP、DTX-F127-RGD-LP脂質體的DMEM培養基孵育48 h，Control組只加入2 mL DMEM培養基，PBS清洗2次，細胞在4%多聚甲醛中固定20 min，用2 mL含0.5%結晶紫染色劑染色20 min，PBS清洗5次，顯微鏡下觀察實驗情況[32]。

結果如圖8所示，Control組細胞密度在70%左右，DTX原料藥使大部分細胞死亡，但存在一部分細胞團；泊洛沙姆F127或RGD單獨修飾的脂質體進一步減小了細胞團，細胞毒性增強；而DTX-F127-RGD-LP結果顯示視野中僅存在零星的細胞數，無細胞團，細胞毒性效果顯著，其結果與細胞毒性實驗結果一致，說明DTX-F127-RGD-LP體外抗卵巢癌效果顯著。

圖8 SKOV3細胞結晶紫染色（比例尺：×200）Fig 8 Crystal violet dying of SKOV3 cells（scale bar：×200）

3 討論

DTX是臨床治療卵巢癌常用的化療藥物，屬于脂溶性藥物，薄膜分散法本身適合難溶性藥物，并且操作簡單，因此選用此法制備了DTX-F127-RGDLP[33]。其形態為球形囊泡狀，大小基本均一，分布較均勻，符合脂質體的要求。泊洛沙姆F127嵌入后脂質體的粒徑稍有下降，這與先前的報道一致，泊洛沙姆F127鑲嵌于磷脂雙分子層，可以減小脂質體的粒徑[15]。RGD修飾在脂質體上后，脂質體的粒徑稍有增加，可能是因為RGD的頭部空間較大，形成的脂質體較疏松，導致粒徑增大。DTX-F127-RGDLP的包封率為86.4%，載藥量為2.7%，包封率高于80%，對DTX的包載性能良好。脂質體在4℃和血清條件下的穩定性良好，且DTX-F127-LP和DTXF127-RGD-LP組粒徑幾乎不變，這可能是泊洛沙姆F127的嵌入增加了脂質體的穩定性[34-36]。

脂質體因其獨特的尺寸與結構以及EPR效應，在腫瘤細胞中積聚，對腫瘤細胞的毒性作用增強[37]。DTX-RGD-LP與DTX-LP相比對腫瘤細胞有更強的細胞毒性，這可能是RGD修飾脂質體后，RGD與腫瘤細胞表面過表達的整合素家族結合，通過受體與配體介導的作用主動靶向腫瘤細胞，增加腫瘤細胞對脂質體的攝取，藥物在細胞內濃度增加，對腫瘤細胞的毒性增強。泊洛沙姆F127的添加使得DTX-RGD-LP對腫瘤細胞毒性增加，這可能得益于泊洛沙姆F127可以加速細胞膜的流動，促進腫瘤細胞對修飾脂質體的攝取，提高細胞內化水平，使得毒性增強，這表明RGD和泊洛沙姆F127修飾至脂質體表面對增強腫瘤細胞攝取脂質體及脂質體對腫瘤細胞的毒性具有協同作用[38]。

綜上所述，制備的DTX-F127-RGD-LP具有較好的主動靶向性及體外抗卵巢癌的能力，為卵巢癌的主動靶向治療提供了實驗依據。