假單胞菌Pseudomonas promysalinigenes RW10S1次級代謝產物研究

陳滸良，韓立峰，王羅醫（.天津中醫藥大學中醫藥研究院 組分中藥國家重點實驗室，天津 3067；2.中國科學院微生物研究所 中國科學院微生物生理與代謝工程重點實驗室，北京 000）

假單胞菌（Pseudomonas）是一類廣泛存在于土壤、水、動植物及人體中的革蘭氏陰性細菌[1]，可產生多種的次級代謝產物[2]，如莫匹羅星（mupirocin）[3-4]、硝吡咯菌素（pyrrolnitrin）[5]、藤黃綠菌素（pyoluteorin）[6]、safracins[7]等，在醫藥研發、生物防治和工業微生物開發等領域具有重要應用價值。

Pseudomonas promysalinigenes（原名Pseudomonas putida）RW10S1于1990年分離自斯里蘭卡的水稻根際[8]，2011年Li等[9]報道了該假單胞菌中次級代謝產物promysalin的化學結構（見圖1）、抗菌活性及其生物合成途徑。該化合物由脯氨酸（proline）、十四酸（myristic acid）及水楊酸（salicylic acid）3個結構單元組成，其名稱promysalin即由此而來。Promysalin可選擇性抑制多重耐藥的銅綠假單胞菌生長，是具有重要開發價值的抗菌先導化合物[10-15]。然而，該化合物在酸性條件下不穩定，可發生分子內重排得到化合物1a（見圖1）而喪失活性[15]，限制了其進一步開發和應用。

圖1 Promysalin的化學結構及其重排產物Fig 1 Structures of promysalin and its rearrangement products

微生物培養基作為微生物次級代謝產物產生的重要一環，其成分含量的不同，對發酵產物的結果具有重要影響，有研究通過探究菌種培養基與培養條件，成功提升了次級代謝產物的產量與豐富度[16-18]。為進一步挖掘假單胞菌Pseudomonas promysalinigenesRW10S1來源的天然產物，本研究對該菌株發酵條件進行改變和優化，從其LB培養基發酵液的乙酸乙酯萃取部位分離鑒定了3個化合物（見圖2），其中2個為新的promysalin結構類似物（見圖3），由煙酸（nicotinic acid）取代了promysalin中的水楊酸部分，穩定性優于promysalin。本文不僅探究了不同培養條件對假單胞菌Pseudomonas promysalinigenesRW10S1發酵產物的影響，也對該菌株次級代謝產物的化學成分進行了研究。

圖2 假單胞菌Pseudomonas promysalinigenes RW10S1在不同發酵條件下的HPLC圖Fig 2 HPLC chromatogram of Pseudomonas promysalinigenes RW10S1 under different fermentation conditions

圖3 化合物2和3的化學結構Fig 3 Structures of compounds 2 and 3

1 材料

Bruker Avance Ⅲ-600核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）；Q-Exactive Orbitrap MS高分辨質譜質譜、Nicolet IS5紅外光譜儀（美國Thermo公司）；Chirascan圓二色光譜儀（英國應用光物理公司）；Anton Paar MCP 200高精度智能旋光儀（奧地利Anton Paar公司）；LC-20A分析型高效液相色譜儀（日本SHIMADZU公司）；Waters 2695半制備型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；綠百草色譜柱GH0525046C18AQ（250 mm×4.6 mm，5 μm）；綠百草色譜柱GH0525010C18AQ（250 mm×10 mm，5 μm）；SBC MCI GEL 反相色譜填料 F型50～70 μm（成都科譜生物有限公司）；MQD-S3R振蕩器（上海旻泉儀器有限公司）；RE-52AA型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；AIRTECH超凈臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；色譜級乙腈（美國Thermo公司）；分析級甲醇、乙酸乙酯（天津康科德公司）；LB培養基、胰酪大豆胨液體培養基（TSB）、瓊脂粉（北京奧博星生物技術公司）；葡萄糖（國藥集團化學試劑有限公司）。

實驗菌株假單胞菌Pseudomonas promysalinigenesRW10S1由比利時魯汶大學René De Mot教授提供，現保存于中國科學院微生物研究所。

2 菌株的發酵、萃取及其代謝產物的分離

將生長在LB瓊脂培養基上的假單胞菌Pseudomonas promysalinigenesRW10S1單克隆接種到LB培養基中，30℃、200 r·min－1在搖床中培養1 d作為種子液備用。然后以體積分數5%的接種量接入含4%葡萄糖的LB發酵培養基中（5個2000 mL三角瓶分別裝有500 mL培養基），22℃、200 r·min－1振蕩培養2 d。

發酵液用等量乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮干燥，得到浸膏1.1 g。浸膏經SBC MCI GEL柱色譜用甲醇-水（56∶44、92∶8、100∶0）梯度洗脫得到3個組分（Fr.1～Fr.3），采用HPLC法檢測分析，組分Fr.2含主要目標成分，經半制備高效液相色譜分離，乙腈-水梯度洗脫（體積比45∶55→ 50∶50，40 min程序）分別得到化合物1（tR＝29.5 min，2.6 mg）、化合物2（tR＝16.0 min，2.6 mg）、化合物3（tR＝22.0 min，2.4 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：無色黏稠固體，易溶于甲醇。[α]－15.55（c0.09，MeOH）；UV（MeOH）λmax（logε）：282.4（0.038）nm；IR（KBr）vmax3342，2929，2857，1738，1669，1614，1197，757 cm－1；CD（c0.18，MeOH）λ（Δε）：208.0（－20.42）。HR-ESI-MS準分子離子峰m/z475.2792 [M＋H]＋（C26H39N2O6，計算值為475.2802），結合NMR數據，推測分子式為C26H38N2O6。1H-NMR（600 MHz，chloroform-d）δH9.53（1H，s，-OH）為低場區羥基信號；δH7.41～7.34（2H，m，H-26，24）、6.99（1H，d，J＝8.2 Hz，H-23）、6.91（1H，t，J＝7.5 Hz，H-25）為芳香氫質子信號；δH6.64（1H，s，-NH）、5.46（1H，s，-NH）為一組氨基氫信號；6.72（1H，br s，H-19）、5.29（1H，dd，J＝4.5，2.4 Hz，H-18）為一組烯烴氫信號；δH5.02（1H，m，H-16）為脯氨酸酮基的α氫信號；δH5.00（1H，m，H-8）為一個與脯氨酸末端氧相連的次甲基氫信號；δH4.10（1H，d，J＝7.6 Hz，H-2）為一個與乙酰氨基相連的亞甲基氫信號；δH3.15（1H，m，H-17）、2.70（1H，d，J＝17.1 Hz，H-17'）、1.80（1H，m，H-3）、1.65（1H，m，H-3'）、1.59（4H，m，H-7，9）、1.44（4H，m，H-4，6，10）、1.28（10H，m，H-5，6'，10'，11，12，13）為一組亞甲基氫信號；δH0.87（3H，t，J＝7.0 Hz，H-14）為甲基氫信號；13C-NMR（150 MHz，chloroform-d）δC：177.2（C-1）、171.3（C-15）、166.5（C-20）、157.6（C-22）、133.4（C-24）、130.9（C-19）、119.4（C-25）、118.8（C-23）、118.0（C-21）、111.0（C-18）、76.0（C-8）、71.4（C-2）、59.3（C-16）、34.5（C-9）、34.3（C-7）、33.4（C-17）、34.1（C-3）、31.8（C-12）、29.9（C-11）、28.4（C-5）、25.5（C-10）、24.9（C-6）、24.6（C-4）、22.7（C-13）、14.2（C-14）。以上數據與文獻報道的promysalin的數據基本一致[9-10]。

化合物2：無色黏稠固體，易溶于甲醇。[α]－21.21（c0.06，MeOH）；UV（MeOH）λmax（logε）：254.2（0.021）nm；IR（KBr）vmax3342，2929，2857，1738，1667，1619，1468，1433，1408，1197 cm－1；CD（c0.13，MeOH）λ（Δε）：208.0（－11.50），228.0（－5.02）。HRESI-MS顯示其準分子離子峰m/z460.2798 [M＋H]＋（C25H38N3O5，計算值為460.2806），結合1H-NMR與13C-NMR數據（見表1），可推定其分子式為C25H37N3O5。比較化合物2與promysalin（1）的核磁數據可知，化合物2中含有與化合物1中同樣的脯氨酸及2-羥基十四酰胺結構單元，兩者的主要差別在于芳香區域的信號，表現為化合物2中芳香區域信號進一步向低場位移δH8.79（1H，d，J＝1.7 Hz，H-22）、8.72（1H，dd，J＝5.0，1.6 Hz，H-23）、7.89（1H，dt，J＝7.9，2.0 Hz，H-25）、7.40（1H，m，H-24）；在化合物2的13C-NMR譜中，碳原子的信號也由26個變為25個，除芳香區碳信號發生變化外，其他碳信號與化合物1基本一致。結合化合物的分子式可知，該結構單元含有一個額外氮原子，通過進一步對化合物2的1H-1H-COSY、HSQC和HMBC譜相關信號進行分析（見圖4），可確定該結構單元為煙酸；同時，該煙酸基團與文獻中化合物pyridin-3-yl（pyrrolidin-1-yl）methanone的煙酸基團核磁數據基本一致[19]。Promysalin的手性區域存在于C-2、C-8、C-16位置，其構型已有化學全合成研究進行確認[10]，在化合物2中δH5.02（1H，dd，J＝11.6，5.6 Hz，H-16）、5.02（1H，m，H-8）、4.10（1H，m，H-2）；δC58.7（C-16）、75.6（C-8）、70.9（C-2）手性碳區域核磁數據與promysalin的數據基本一致。圓二色譜（CD）測定結果（見圖5）顯示，promysalin與promynicotin在210 nm波長處均表現為負的Cotton效應，且峰形接近。通過對化合物1和化合物2的比旋光度、波譜和CD數據結果分析，推測化合物2手性中心的構型與promysalin一致，即C-16為S構型，C-2、C-8為R構型。同時，生物合成的代謝產物立體選擇性較高，產物的構型會相對保持一致，也能為化合物2的構型維持提供一定參考。綜合以上分析，最終確定化合物2的結構，并命名為promynicotin。

表1 化合物2和3的1H-NMR (600 MHz)和13C-NMR (150 MHz)數據(in CDCl3)Tab 1 1H-NMR (600 MHz) and 13C-NMR (150 MHz) data of compounds 2 and 3 in CDCl3

圖4 化合物2和3關鍵二維相關信號1 H-1 H-COSY（紅色線條）和HMBC（藍色箭頭）Fig 4 Key 1 H-1 H-COSY（red lines）and HMBC（blue arrows）correlations of compounds 2 and 3

圖5 化合物1～3在甲醇中的CD譜Fig 5 CD spectra of compounds 1～3 in methanol

化合物3：無色黏稠固體，易溶于甲醇。[α]－33.99（c0.1，MeOH）；UV（MeOH）λmax（logε）：259.0（0.021）nm；IR（KBr）vmax3342，2929，2857，1737，1668，1632，1434，1407，1190 cm－1；CD（c0.13，MeOH）λ（Δε）：205.0（－2.06），232.0（－9.25），270.0（－3.89）。HRESI-MS顯示其準分子離子峰m/z446.3004 [M＋H]＋（C25H40N3O4，計算值為446.3013），結合1H-NMR與13C-NMR數據（見表1），可推定其分子式為C25H39N3O4。化合物3與化合物2相比，少了一個羥基信號，化學位移向高場移動δH2.20（2H，t，J＝7.7 Hz，H-2），另外18位和19位雙鍵信號消失，在高場區顯示信號為δH2.04（1H，m，H-18），1.93（1H，m，H-18'）、3.67（1H，q，J＝8.3，7.4 Hz，H-19），3.54（1H，q，J＝9.5，7.7 Hz，H-19'），δC50.1（C-19）和25.2（C-18）特征烯碳信號也相應消失，其他位置信號與化合物2基本一致。化合物3的手性區域為C-8、C-16位置，該手性碳區域核磁數據與化合物2的數據基本一致，由于C-2位置少了羥基的一個手性中心，與化合物2相比，CD譜呈現的吸收峰發生紅移，但總體峰形基本一致（見圖5），因此，其構型同化合物2，即C-8為R構型，C-16為S構型。通過對化合物3的比旋光度、波譜和CD數據分析，最終確定了結構，并命名為dihydrodeoxypromynicotin。

4 討論

前期研究僅對假單胞菌Pseudomonas promysalinigenesRW10S1在TSA或TSB培養基中進行了發酵和代謝產物研究，在此條件下只獲得了化合物promysalin[9]。本研究通過對其發酵培養基的改變和優化，在LB培養基中加入4%葡萄糖，22℃、200 r·min－1振蕩培養，提升了假單胞菌Pseudomonas promysalinigenesRW10S1代謝產物的豐富度，并從中分離鑒定了2個新的、結構更加穩定的promysalin類似物（化合物2和3），其獲得可能與LB培養基中酵母提取物含有的煙酸成分有關[20]，該成分的加入為菌株發酵提供不同底物，進而豐富了該菌株次級代謝產物的類型。另外，由于培養溫度的降低，菌種的生長速度和酶的催化效率也相應下降，通過檢測能發現中間代謝產物，化合物3即為中間代謝產物。總之，本研究豐富了假單胞菌屬次級代謝產物的化學成分多樣性，也為假單胞菌Pseudomonas promysalinigenesRW10S1次級代謝產物的開發利用提供更多研究基礎。后期將通過前體喂養、組合生物合成等方法獲得更多的promysalin結構類似物，并對這些衍生物進行生物活性測試。