不同光照強度和光照周期對多肋藻配子體發育的影響

陳書秀，史良，趙楠，李霞，孫娟，李曉捷

（山東東方海洋科技股份有限公司，國家海藻與海參工程技術研究中心，山東省海藻與海參技術創新中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術重點實驗室，山東 煙臺 264003）

多肋藻（Costaria costata）是一種具有較高經濟價值的一年生大型褐藻，在亞洲主要分布于日本北海道、朝鮮半島等海域，在我國無自然分布。其富含碘以及多種人體必需的微量元素，可以作為海參、鮑魚等海洋無脊椎動物的餌料，也是海藻工業的重要原材料，具備提取褐藻膠、甘露醇、鉀等化工原料以及制備褐藻淀粉的應用潛力[1-2]。目前，我國多肋藻養殖技術有了較大突破，已在山東榮成等地實現了人工養殖[3-4]。

多肋藻生長期較短，1—4 月份生長最為旺盛，5—6 月份產生孢子組織，6—7 月份藻體成熟。由于孢子體自然成熟時間晚，難以與人工育苗時間契合，配子體育苗是目前實現人工苗種適時培育最主要的手段。配子體育苗是通過控制光照、溫度和營養鹽成分等進行配子體擴增培養，然后對配子體進行誘導發育、附苗和幼苗的培育過程。雖然多種常見海帶屬藻類的配子體發育模式已經建立，但是關于多肋藻屬配子體發育方面的研究，在國內外尚未見系統報道。目前國內外的研究主要集中在多肋藻生態資源調查、分類學以及利用分子生物學技術進行種群分析等方面[5-7]，以及對多肋藻配子體世代的生長發育規律進行觀察研究[8-9]。從發現了海帶屬藻類的異形世代交替現象開始，大量關于環境因子對海帶屬藻類配子體生長發育的研究先后開展[10-14]，并且獲得了豐富的理論研究成果，這些成果為本研究的試驗設計提供了理論依據。

現于2022 年9 月，在實驗室光照培養箱中，開展了不同光照強度、光照周期對多肋藻配子體發育影響的試驗，擬為進一步加快多肋藻配子體細胞由營養生長向生殖發育階段轉變提供理論依據，進而用較短的時間培育出更大規格的苗種，降低人工育苗成本，為海上養殖提供更加優質苗種。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

取適量的多肋藻雌雄配子體，經循環泵處理，用孔徑為48 μm 的篩絹過濾，獲得含2~5 個細胞的細胞段懸濁液，然后按照質量比2∶1 混合，均勻攪拌成懸濁液。取一定量的懸濁液加入直徑12 cm 的培養皿中，培養液為添加硝酸鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸鐵的滅菌海水，海水中有效氮10 mg/L、有效磷1 mg/L、有效鐵0.5 mg/L，溫度10 ℃，藍光（波長465~470 nm），于不同的光照強度、光照周期條件下進行培養。

1.1.1 光照強度試驗

共設置7 個光照強度組，分別為10，20，40，60，80，120 和160 μmol/（m2·s）。各組培養條件相同，光照周期均為10L∶14D（L：光照時間；D：黑暗時間）。每個處理組設置3 個平行。

1.1.2 光照周期試驗

共設置5 個光照周期組，分別為6L∶18D，10L∶14D，12L∶12D，16L∶8D 和20L∶4D。各組培養條件相同，光照強度均為30 μmol/（m2·s）。每個處理組設置3 個平行。

1.2 指標測定

在顯微鏡下觀察配子體的生長發育狀態，每3 d拍照1 次，試驗周期30 d。

配子體發育率的計算：每個培養皿隨機觀察10個100×視野，分別統計卵囊形成、排卵、幼孢子體和總細胞數，按卵囊形成數、排卵數和孢子體數之和占總細胞數的百分比，計算發育率。

1.3 數據處理

用SPSS19.0 軟件對發育率進行單變量方差分析和多重比較（P<0.05 表示差異顯著）。用Excel 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同光照強度、培養天數多肋藻配子體發育狀況

光照強度（P<0.001）、培養天數（P<0.001）及兩者交互作用（P<0.001）對多肋藻配子體的發育均有極顯著的影響（表1）。由表1 可見，第一行校正模型中的F=17.811，P<0.001，表明所用模型有統計學意義。效果量（Eta2）培養天數（0.835）大于Eta2光照強度（0.698）大于Eta2（光照強度×培養天數）（0.560），表明這3 個因素對多肋藻配子體發育的影響效應為：培養天數大于光照強度大于（光照強度×培養天數）。

表1 不同光照強度、培養天數多肋藻配子體發育率方差分析①

不同光照強度條件下多肋藻配子體發育25 d后的光學顯微圖見圖1（a）（b）（c）（d）（e）（f）（g）。由圖1 可見，多肋藻配子體在7 種不同的光強條件下培養25 d 后，均有一定數量的配子體正常發育成孢子體，較低光強[0~60 μmol/（m2·s）]條件下仍有大量配子體細胞處于營養生長狀態，發育率為40%~80%。當光強≥80 μmol/（m2·s）時，僅有少量孢子體存活，無處于營養生長的配子體細胞，最終發育率＜20%。

圖1 不同光照強度多肋藻配子體發育25 d 后的光學顯微圖（10×10 倍）

不同光照強度多肋藻配子體發育率見表2。隨著培養時間的增加，配子體發育率不同程度的增加，120 μmol/（m2·s）時，在第22 天達到最大值，第25 天稍有下降，其他試驗組發育率均在第25 d 達到最大值。但相同光照強度下，第22 天與第25 天的發育率相比，無顯著差異。培養天數相同時，40 μmol/（m2·s）光照強度條件下的發育率最高，顯著高于10，80，120 和160 μmol/（m2·s）條件下的發育率（P<0.05），但與20 和60 μmol/（m2·s）條件下的發育率差異不顯著（P>0.05）。

表2 不同光照強度多肋藻配子體發育率①%

綜上所述，多肋藻配子體育苗時，若采用的光照周期為10L∶14D，在配子體發育成孢子體階段，光照強度建議保持在40 μmol/（m2·s），既有利于配子體快速由營養生長轉化為生殖生長，又可提高最終的孢子體密度。

2.2 不同光照周期多肋藻配子體發育狀況

光照周期（P<0.001）、培養天數（P<0.001）及兩者交互作用（P<0.001）對多肋藻配子體的發育均有極顯著的影響（表3）。由表3 可見，第一行校正模型中的F=19.044，P<0.001，表明所用模型具有統計學意義。Eta2光照周期（0.801）大于Eta2培養天數（0.787）大于Eta2（光照周期×培養天數）（0.586），表明這3 個因素對多肋藻配子體發育的影響效應為：光照周期大于培養天數大于（光照周期×培養天數）。

表3 不同光照周期、培養天數對多肋藻配子體發育的方差分析結果①

不同光照周期條件下，多肋藻配子體發育25 d后的光學顯微圖見圖2（a）（b）（c）（d）（e）。由圖2可見，多肋藻配子體在5 個不同光照周期條件下培養25 d 后，均有部分配子體可正常發育成孢子體。在光周期6L∶18D 和20L∶4D 條件下，約有70%配子體仍處于營養生長狀態，僅有少量進入生殖生長（16%~30%），且孢子體長度明顯小于其他3 組。

圖2 不同光照周期條件下，多肋藻配子體發育25 d 后的光學顯微圖（10×10 倍）

不同光照周期配子體發育率見表4。隨著培養時間的增加，配子體發育率不同程度的增加，均在第25 d 達到最大值。相同的培養時間條件下，光照周期12L∶12D 時配子體發育率最高，但與10L∶14D的發育率差異不顯著（P>0.05），兩者的發育率均顯著高于其他3 組（P<0.05）。

表4 不同光照周期多肋藻配子體發育率①%

綜上所述，多肋藻配子體育苗時，若采用的光照強度為30 μmol/（m2·s），在配子體發育成孢子體階段，光照周期建議使用12L∶12D，有利于配子體快速同步發育。

3 討論

光照強度、光照周期對多肋藻配子體發育存在極顯著的影響（P<0.001）。經Duncan 多重檢測法比較后，40 μmol/（m2·s）的光照強度和10L∶14D 的光照周期或30 μmol/（m2·s）的光照強度和12L∶12D的光照周期，對多肋藻配子體發育具有顯著的促進作用。

3.1 光照強度對多肋藻配子體發育的影響

海帶配子體發育模式受光照和溫度等外界環境因子的影響而不同，主要表現在當配子體初始細胞經過一段時間的營養生長之后，如果外界環境因子適宜，配子體則進入繁殖生長階段，否則繼續營養生長形成絲狀配子體。Borlongan 等[5]研究了多肋藻配子體階段和孢子體階段光合活性對PAR的響應，結果表明，配子體對低光照強度有較高的適應性，其補償光強為1 μmol/（m2·s），飽和光強為44 μmol/（m2·s），若連續6 h 處于100 μmol/（m2·s）時，配子體將受到光損傷，且無法恢復。而孢子體階段的飽和光強為243 μmol/（m2·s）。本試驗得出了相似的結論，由圖1 可見，當光照強度≥40 μmol/（m2·s）時，隨著光照強度的增加，配子體細胞數量顯著減少，80~160 μmol/（m2·s）時，僅有孢子體存活。

本試驗結果顯示，不同光照強度下，多肋藻配子體發育存在顯著差異。在光照周期為10L∶14D、光照強度40 μmol/（m2·s）時發育率最高，且出現孢子體的時間早于其他各組。由此可見，40 μmol/（m2·s）光照強度更有利于多肋藻配子體的發育。一些學者的研究也得出與本研究相似的結論。付剛等[9]研究表明，當溫度為15 ℃、光照強度為40 或60 μmol/（m2·s）時，多肋藻配子體的發育過程中的營養生長階段持續時間為3~5 d，之后即可進入繁殖階段；而當溫度較低（5 ℃）、較高（25 ℃）或者光照強度較低[20 μmol/（m2·s）]時，則不利于配子的發育成熟，配子體表現出旺盛的營養生長趨勢，且營養生長階段持續時間長。

張喜昌等[15]研究表明，“中寶1 號”海帶（Saccharina japonica）配子體預發育的最適光照周期和光照強度為12L∶12D 和37.5 μmol/（m2·s）。陳書秀等[14]研究了光照強度對籠目海帶（Saccharina sculpera）配子體的發育，結果表明，在光周期為10L∶14D 時，籠目海帶配子體發育的最適光照強度為20~40 μmol/（m2·s）。Lee[16]的研究表明，當光照強度為80 μmol/（m2·s）時，皺海帶（Laminaria relifiosa）配子體的繁殖率達到最大。Lüning 等[17]研究表明，通常條件下海帶配子體在充足光照下，會進入生殖生長階段，在低光照下，則維持營養生長狀態。

3.2 光照周期對多肋藻配子體發育的影響

藻類的生長既與光照強度有關，也與光照時間的長短密切相關。本試驗中，配子體發育率在光照周期12L∶12D 時最高，且隨著光照時間的減少或降低，多肋藻配子體發育率明顯下降，在6L∶18D 和20L∶4D 時，大部分配子體仍處于營養生長狀態。由此可見，光照強度為30 μmol/（m2·s）時，多肋藻配子體發育的最適光照周期為12L∶12D。

陳書秀等[14]研究表明，籠目海帶在15μmol/（m2·s）光照強度下，較長的光照時間（16L∶8D、20L∶4D），有利于促進配子體的生殖生長進程，促進卵囊的形成、受精卵的排放及孢子體的生長。張鑫等[18]研究了不同光照周期對羊棲菜（Hizikia fusiformis）有性繁殖過程的影響，結果表明，長光照周期可以明顯促進卵子的排放，延長卵子的存活時間，提高卵子的受精效率，有利于合子的發育與生長。