防治葡萄潰瘍病的殺菌劑篩選與評價

劉梅 金添 王慧 李永華 王訓成 李興紅 燕繼曄

摘要

采用菌絲生長速率法和孢子萌發法測定了7種殺菌劑對可可毛色二孢CSS01s的室內生物活性，篩選出3種抑制效果較好的殺菌劑;通過對離體葡萄綠枝條及盆栽葡萄幼苗新梢進行人工接種病原菌，進一步評價殺菌劑的防治效果。結果表明，7種殺菌劑對可可毛色二孢菌絲生長和孢子萌發表現出不同的抑制活性，其中戊唑醇、氯氟醚菌唑、啶酰菌胺和氟啶胺對菌絲生長的抑制作用較強，EC50分別為0.116、0.137、0.109?μg/mL和0.119?μg/mL;戊唑醇、氯氟醚菌唑、氟啶胺對孢子萌發的抑制作用較強，EC50分別為0.420、0.595?μg/mL和1.885?μg/mL。CSS01s接種離體葡萄綠枝條試驗中，戊唑醇100、200?mg/L，氯氟醚菌唑100、300?mg/L和氟啶胺100、200?mg/L的防治效果無顯著差異，在57.81%～65.31%;CSS01s接種葡萄幼苗新梢試驗中，氟啶胺200?mg/L的防治效果最好，為77.56%，與氟啶胺100?mg/L、氯氟醚菌唑100、300?mg/L和戊唑醇200?mg/L之間無顯著差異，但顯著高于戊唑醇100?mg/L。研究結果顯示，氯氟醚菌唑、戊唑醇和氟啶胺可以作為推薦殺菌劑，經進一步的田間藥效評價用于葡萄潰瘍病的防治。

關鍵詞

葡萄潰瘍病;?可可毛色二孢;?殺菌劑;?室內生物活性;?防治效果

中圖分類號：

S?436.631.1

文獻標識碼：?B

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022144

Screening?and?evaluation?of?fungicides?for?controlling?grapevine?Botryosphaeria?dieback

LIU?Mei，?JIN?Tian，?WANG?Hui，?LI?Yonghua，?WANG?Xuncheng，?LI?Xinghong，?YAN?Jiye*

（Beijing?Key?Laboratory?of?Environment?Friendly?Management?on?Fruit?Diseases?and?Pests?in?North?China，?Institute

of?Plant?Protection，?Beijing?Academy?of?Agricultural?and?Forestry?Sciences，?Beijing?100097，?China）

Abstract

Inhibitory?activities?of?seven?fungicides?to?Lasiodiplodia?theobromae?were?determined?using?the?mycelial?growth?and?conidia?germination?methods.?Three?fungicides?with?high?inhibitory?effect?were?screened?out，?including?tebuconazole，?mefentrifluconazole?and?fluazinam.?Control?efficacy?was?further?evaluated?by?CSS01s?inoculation?in?vitro?grape?green?shoot?and?seedling?branch.?The?results?showed?that?all?the?seven?fungicides?presented?different?inhibitory?activity?against?both?mycelial?growth?and?conidia?germination.?For?the?mycelial?growth，?the?highest?inhibitions?were?found?in?the?cases?with?tebuconazole，?mefentrifluconazole，?boscalid，?and?fluazinam，?with?EC50?values?of?0.116，?0.137，?0.109，?and?0.119?μg/mL，?respectively.?For?the?conidia?germination，?the?highest?inhibitions?were?found?in?the?cases?with?tebuconazole，?mefentrifluconazole?and?fluazinam，?with?EC50?values?of?0.420，?0.595?and?1.885?μg/mL，?respectively.?For?the?CSS01s?inoculation?in?vitro?grape?green?shoot，?control?efficacies?of?tebuconazole?（100，?200?mg/L），?mefentrifluconazole?（100，?300?mg/L），?and?fluazinam?（100，?200?mg/L）?were?no?significantly?different，?and?in?the?range?of?57.81%-65.31%.?For?the?CSS01s?inoculation?seedling?branch，?the?highest?control?efficacy?of?fluazinam?（200?mg/L）?was?77.56%，?had?no?significant?difference?with?that?of?fluazinam?（100?mg/L），?mefentrifluconazole?（100，?300?mg/L），?and?tebuconazole?（200?mg/L），?but?significantly?higher?than?that?of?tebuconazole?（100?mg/L）.?The?above?results?indicated?that?tebuconazole，?mefentrifluconazole，?and?fluazinam?could?be?recommended?as?fungicides?for?prevention?and?control?of?grapevine?Botryosphaeria?dieback?after?further?evaluation?of?field?efficacy.

Key?words

grapevine?Botryosphaeria?dieback;?Lasiodiplodia?theobromae;?fungicide;?inhibitory?activity?in?vitro;?control?efficacy

葡萄Vitis?vinifera?L.屬于葡萄科葡萄屬木質藤本植物，是一種具有重要經濟價值的果樹，在全球范圍內廣泛種植。我國是世界第二大種植葡萄的國家，葡萄種植面積約為87.5?萬hm2，占全球葡萄種植面積的12%［1］。葡萄及其相關產業在我國農業生產中占有較大的比重。葡萄潰瘍病于1964年在加拿大首次報道［2］，是葡萄重要的枝干病害，典型癥狀包括枝條或枝干頂梢枯死、木質部出現褐色至黑色楔形或弓形壞死斑;另外，田間還可表現為芽壞死、果實干縮脫落等癥狀，嚴重時會導致整株枝條或整樹枯死。近年來，由于葡萄樹齡的增長、種植方式改變以及環境變化、栽培管理等多種原因，葡萄潰瘍病發生較為普遍且個別年份較重，平均每年造成葡萄減產3%～8%，在發病較重的省份如廣西、浙江等地可導致10%～20%的產量損失，給葡萄產業發展帶來不利影響［3］。

國際上報道與葡萄潰瘍病有關的病原真菌主要集中于葡萄座腔菌屬Botryosphaeria、色二孢屬Diplodia、小穴殼屬Dothiorella、毛色二孢屬Lasiodiplodia、Neofusicoccum、Spencermartinsia和球殼孢屬Sphaeropsis?這7個屬，其中葡萄座腔菌B.dothidea、色二孢D.seriata、可可毛色二孢L.?theobromae和小新殼梭孢N.?parvum最為常見［35］。可可毛色二孢的致病力最強［4］，寄主廣泛，除危害葡萄外，還可危害獼猴桃［6］、茶樹［7］、橡膠等［8］。

針對葡萄潰瘍病的防治，國內外學者嘗試了熱水處理苗木［912］，調整修剪時間［13］、“外科手術治療”等多種措施［1415］，對控制病害發生和蔓延起到了一定的作用，但從田間的防治效果來說，使用殺菌劑是最有效的措施，一些三唑類殺菌劑（苯醚甲環唑）、甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（嘧菌酯）和苯并咪唑類殺菌劑（甲基硫菌靈）已陸續被用于葡萄潰瘍病的防治中［16］，但為避免同一化學殺菌劑長期連續使用帶來的抗藥性問題，需要篩選新型高效的殺菌劑進行輪換或交替使用，同時結合生物防治、物理防治等多種措施建立葡萄潰瘍病綜合防治技術。本研究通過菌絲生長速率法、孢子萌發法測定了7種殺菌劑對葡萄潰瘍病菌的室內生物活性，并通過可可毛色二孢CSS01s接種葡萄離體綠枝條以及盆栽幼苗新梢的方法，篩選出高效低毒的化學藥劑，為田間葡萄潰瘍病的科學防控提供理論依據。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

供試菌株：可可毛色二孢Lasiodiplodia?theobromae?CSS01s，從湖南葡萄枝干病樣上分離獲得，并經單孢純化保存。

供試葡萄品種：‘夏黑。

供試殺菌劑均為原藥。97%戊唑醇，上虞穎泰精細化工有限公司;97%氯氟醚菌唑、98%啶酰菌胺和98%吡唑醚菌酯，巴斯夫歐洲公司;96%氟啶胺，日本石原產業株式會社;98%咯菌腈，瑞士先正達作物保護有限公司;95%甲基硫菌靈，日本曹達株式會社;99%水楊肟酸?（SHAM），上海麥克林生化科技有限公司。用丙酮溶劑制備成10?mg/mL的母液，于4℃黑暗條件下保存備用。

1.2?試驗方法

1.2.1?菌絲生長速率法測定不同殺菌劑的生物活性

用無菌水分別稀釋10?mg/mL的母液，配制5個系列質量濃度梯度的含藥PDA平板（其中丙酮的體積分數<0.25%），設置空白對照和溶劑對照。為抑制旁路呼吸作用，吡唑醚菌酯的PDA?平板中加入適當體積的水楊肟酸（SHAM）至終濃度為100?μg/mL。將可可毛色二孢CSS01s在PDA平板上培養2?d?后，打取菌齡一致的菌餅接種于含藥PDA平板和對照PDA平板中央，每處理重復3次，置于28℃，L∥D=12?h∥12?h的培養箱中培養2?d。采用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率，將抑制率轉換為幾率值（y），濃度換算成濃度對數（x），利用?DPS軟件求出毒力回歸方程的斜率，計算各殺菌劑的EC50及95%置信限并進行卡方檢驗。試驗重復2次。

抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

1.2.2?孢子萌發法測定不同殺菌劑的生物活性

按照1.2.1?的方法制備?5個系列質量濃度梯度的含藥水瓊脂（WA）平板，設置空白對照和溶劑對照。為抑制旁路呼吸作用，吡唑醚菌酯的WA?平板中加入適當體積的SHAM至終濃度為100?μg/mL。可可毛色二孢CSS01s在PDA平板上培養7?d，待菌絲表面產生大量的分生孢子器，用滅菌棉簽打斷菌絲并向培養皿中加入5?mL無菌水，而后用4層紗布過濾獲得濃度為1?×?106個/mL的孢子懸浮液。分別吸取100?μL孢子懸浮液至含藥及不含藥的WA平板上，用涂布器涂抹均勻，于28℃，L∥D=12?h∥12?h的培養箱中培養，每處理重復3次，8?h后隨機鏡檢分生孢子的萌發情況（對照孢子萌發率在90%以上時）。當萌發芽管長度超過孢子短半徑時視為萌發。計算各處理的分生孢子相對萌發抑制率，以藥劑濃度對數值為橫坐標，分生孢子萌發抑制率的幾率值為縱坐標，利用?DPS軟件求出毒力回歸方程的斜率，計算各殺菌劑的EC50及95%的置信限并進行卡方檢驗。試驗重復2次。

R=Ng/Nt?×100?（R為孢子萌發率，Ng為孢子萌發數，Nt為調查的孢子總數）;

I=（R0-Rt）/?R0?×100?（I為孢子萌發抑制率，R0為空白對照孢子萌發率，Rt為處理孢子萌發率）。

1.2.3?殺菌劑對接種CSS01s的離體葡萄綠枝條的防治效果

可可毛色二孢CSS01s在PDA平板上培養2?d，在菌落邊緣打取直徑4?mm的菌餅。用無菌水分別稀釋10?mg/mL的母液，配制系列濃度梯度的藥液。取30～35?cm包含4～5節的健康‘夏黑葡萄綠枝條作為接種材料，經表面消毒后，采用電動噴霧器向離體枝條均勻噴灑各濃度的藥液，以藥液不滴落為宜。對照噴施相同體積的無菌水。施藥24?h?后，在距枝條頂端15?cm?處用4?mm滅菌打孔器打孔，去掉韌皮部，將制備的菌餅貼接于傷口處，用封口膜包扎保濕，每個接種后的綠枝條馬上插入裝有滅菌蛭石營養缽中，每處理5根枝條，3次重復。接菌后放置于28℃，L∥D=12?h∥12?h，前48?h相對濕度80%～90%，后期相對濕度60%的人工氣候室中，7?d?后測量病斑長度，計算各殺菌劑各濃度處理對葡萄潰瘍病的防效。

防治效果=（對照病斑長度-處理病斑長度）/（對照病斑長度-菌餅直徑）×100%。

1.2.4?殺菌劑對接種CSS01s盆栽葡萄幼苗新梢的防治效果

將可可毛色二孢CSS01s在PDA平板上培養2?d，在菌落邊緣打取直徑4?mm的菌餅。用無菌水分別稀釋

10?mg/mL的母液，

配制系列濃度梯度的藥液。選取溫室盆栽‘夏黑葡萄長約40?cm，直徑10?mm左右，包含4～5節的健康葡萄新梢作為接種材料，采用電動噴霧器向整條新梢均勻噴灑各濃度的藥液，以藥液不滴落為宜。對照噴施相同體積的無菌水。施藥24?h?后，在距枝條頂端15?cm?處用4?mm滅菌打孔器打孔，去掉韌皮部，將制備的菌餅貼接于傷口處，用封口膜包扎保濕，每處理5根枝條，3次重復。培養條件同1.2.3小節。10?d?后測量病斑長度，計算各殺菌劑各濃度處理對葡萄潰瘍病的防效。

防治效果=（對照病斑長度-處理病斑長度）/（對照病斑長度-菌餅直徑）×100%。

2?結果與分析

2.1?殺菌劑對可可毛色二孢CSS01s的生物活性

供試殺菌劑對可可毛色二孢CSS01s菌絲生長均具有不同程度的抑制作用，其中戊唑醇、氯氟醚菌唑、啶酰菌胺、氟啶胺的抑制作用較強，EC50分別為0.116、0.137、0.109?μg/mL和0.119?μg/mL，其次是吡唑醚菌酯和咯菌腈，甲基硫菌靈對菌絲生長的抑制作用最低，EC50為0.776?μg/mL（表1）。

供試殺菌劑對可可毛色二孢CSS01s孢子萌發均具有不同程度的抑制作用，其中戊唑醇、氯氟醚菌唑和氟啶胺的抑制作用較強，其EC50分別為0.420、0.595?μg/mL和?1.885?μg/mL，其次是咯菌腈和甲基硫菌靈，啶酰菌胺和吡唑醚菌酯對孢子萌發的抑制作用最低，EC50分別為7.961?μg/mL和10.935?μg/mL（表2）。

2.2?殺菌劑對可可毛二孢CSS01s接種離體葡萄綠枝條和盆栽葡萄幼苗新梢的防治效果

3種殺菌劑對葡萄潰瘍病具有一定的防治效果，但在低質量濃度50?mg/L下對葡萄綠枝條的防治效果均低于25%，隨著殺菌劑濃度的提高，防治效果增加。CSS01s接種離體葡萄綠枝條試驗中，戊唑醇100、200?mg/L，氯氟醚菌唑100、300?mg/L和氟啶胺100、200?mg/L防治效果無顯著差異，防效在57.81%～65.31%;CSS01s接種葡萄幼苗新梢試驗中，氟啶胺200?mg/L的防治效果最高，為77.56%，與氟啶胺100?mg/L、氯氟醚菌唑100、300?mg/L和戊唑醇200?mg/L的防效無顯著差異，顯著高于戊唑醇100?mg/L的防效（表3）。

3?結論與討論

本試驗采用菌絲生長速率法和孢子萌發法測定了7種殺菌劑對可可毛色二孢的室內生物活性，結果表明，戊唑醇、氯氟醚菌唑和氟啶胺對菌絲生長和孢子萌發的抑制活性較高。接種試驗結果表明，戊唑醇、氯氟醚菌唑、氟啶胺在中、高質量濃度下，對離體葡萄綠枝條和盆栽葡萄幼苗新梢具有較好的保護作用，防治效果在57.81%～77.56%之間，可作為推薦藥劑進一步在田間進行藥效的驗證。

戊唑醇屬于三唑類殺菌劑，可通過雜環上的氮原子與甾醇上的14α脫甲基酶P450的血紅素鐵活性中心形成配位鍵，抑制由CytP450加單氧酶催化的脫甲基反應，從而破壞麥角甾醇的合成，造成細胞膜的功能異常和結構損傷［1719］，使細胞非正常死亡。國內學者報道三唑類殺菌劑中的苯醚甲環唑、丙環唑對可可毛色二孢的菌絲生長均具有明顯的抑制作用［8，?2021］，Gramaje等認為三唑類藥劑強烈抑制多種葡萄枝干病害病原菌的菌絲生長，部分藥劑的活性在植株上也進行了驗證［22］，Di等發現環唑醇、三環醇對早期出現葡萄枝干病害癥狀的幼嫩葡萄樹有一定的治療效果［23］，但因大多數三唑類藥劑的作用位點單一，已報道葡萄白粉病菌［24］和葡萄炭疽病菌［25］對戊唑醇產生了抗性，為了避免或延緩抗藥性的發展，需要研發替代藥劑以構建葡萄潰瘍病綜合治理技術。

氯氟醚菌唑是巴斯夫公司研發、上市的新型異丙醇三唑類殺菌劑，其分子中獨特的異丙醇基團，使其可以靈活地從游離態自由旋轉與靶標結合成為結合態，從而減少病菌突變、延緩抗藥性的產生［26］。另外，它具有優異的桶混性能，能夠與琥珀酸脫氫酶類殺菌劑、甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（如吡唑醚菌酯）等復配，能進一步延緩殺菌劑抗藥性的產生和發展，是有力的病害防治和抗藥性治理工具［27］。研究表明，相對于傳統的三唑類殺菌劑，氯氟醚菌唑具有更高的選擇性和內吸傳導性［28］，對于小麥銹病、玉米大斑病、小麥白粉病、大麥葉枯病、黃瓜炭疽病、花生褐斑病［29］等都具有優異的防治效果，本研究中氯氟醚菌唑對可可毛色二孢的菌絲生長和孢子萌發均具有很好的抑制效果，通過離體和活體接種試驗證實該殺菌劑在葡萄潰瘍病防治中具有良好的保護效果，應用潛力較大。

氟啶胺最早由日本石原產業株式會社登記上市，屬于二硝基苯胺類殺菌劑，是線粒體氧化磷酰化解偶聯劑，對于馬鈴薯晚疫病、蔬菜根腫病等具有良好的防治效果［30］，國外多位學者發現氟啶胺對葡萄潰瘍病菌和葡萄頂枯病菌?Eutypa?lata的孢子萌發具有很強的抑制作用，進一步證實在葡萄修剪時氟啶胺作為傷口保護藥劑，對葡萄潰瘍病具有較好的防治效果［3132］，本研究也同樣發現氟啶胺對可可毛色二孢菌絲生長和孢子萌發具有很好的抑制效果，噴施離體葡萄枝條和盆栽葡萄幼苗，對于可可毛色二孢引起的葡萄潰瘍病具有較好的預防效果，在病原菌侵染前或發病初期使用可以有效控制葡萄潰瘍病的發生和蔓延，是延緩苯并咪唑類、三唑類殺菌劑過量頻繁使用帶來的抗藥性問題的有效措施。

近年來，葡萄潰瘍病的危害及防治越來越受到全球學者的關注，但受制于病原菌種類多樣性以及葡萄種植區域廣泛性等因素，國內外缺乏高效的防控技術。葡萄潰瘍病的病原菌主要在修剪掉的枝干中越冬，修剪口處是病原菌主要的侵入部位，在修剪口處噴施殺菌劑可在一定時間內避免病原菌的侵入［33］。本研究篩選出戊唑醇、氯氟醚菌唑和氟啶胺室內生物活性較高，進一步的接種試驗顯示3種殺菌劑保護作用較好，可在田間噴施修剪口以減少病原菌侵染。但殺菌劑對裸露傷口部位的保護一般在4～26周［34］，而傷口可能一直處在對病原菌較為敏感的狀態，因此需要與其他能夠提高葡萄自身抗病性的措施，比如生防菌劑、免疫誘抗劑的協調使用來建立綠色高效的葡萄潰瘍病綜合防治技術。

參考文獻

［1］?Online?International?Organization?of?Vine?and?Wine?Intergovernmental?Organization?（OIV）.?Statistical?report?on?world?vitiviniculture?［EB/OL］.??（20200628）??［20200318］.?http：∥www.oiv.int/en/technicalstandardsanddocuments/statisticalanalysis/annualassessment.

［2］?CHAMBERLAIN?G?C，?WILLISON?R?S，?TOWNSHEND?D?J?I，?et?al.?Two?fungi?associated?with?deadarm?disease?of?grapes?［J］.?Canadian?Journal?of?Botany，?1964，?42（4）：?351355.

［3］?葉清桐，?李亞萌，?周悅妍，?等.?國內外葡萄枝干病害的發生危害與病原菌種類［J］.?果樹學報，?2021，?38（2）：?278292.

［4］?URBEZTORRES?J?R，?GLUBLER?W?D.?Pathogenicity?of?Botryosphaeriaceae?species?isolated?from?grapevine?cankers?in?California?［J］.?Plant?Disease，?2009，?93?（6）：?584592.

［5］?CROWS?P?W.?Reassessment?of?the?anamorph?genera?Botryodiplodia，?Dothiorella?and?Fusicoccum?［J］.?Sydowia，?1999，?51（2）：?167175.

［6］?石金巧，?張榮全，?何立楠，?等.?獼猴桃葉斑病防治藥劑篩選［J］.?農藥，?2021，?60（4）：?294296.

［7］?任亞峰，?包興濤，?李冬雪，?等.?茶樹葉斑病病原菌可可毛色二孢菌的鑒定［J］.?植物病理學報，?2019，?49（6）：?857861.

［8］?戴利銘，?劉一賢，?施玉萍，?等.?橡膠樹可可毛色二孢葉斑病菌生物學特性及藥劑篩選試驗［J］.?廣東農業科學，?2018，?45（7）：?8793.

［9］?WAITE?H，?GRAMAJE?D，?WHITELAWWECKERT?M，?et?al.?Soaking?grapevine?cuttings?in?water：?a?potential?source?of?cross?contamination?by?microorganisms?［J］.?Phytopathologia?Mediterranea，?2013，?52（2）：?359368.

［10］BERTSCH?C，?RAMREZSUERO?M，?MAGNINROBERT?M，?et?al.?Grapevine?trunk?diseases：?complex?and?still?poorly?understood?［J］.?Plant?Pathology，?2013，?62（2）：?243265.

［11］LARIGNON?P，?FONTAINE?F，?FARINE?S，?et?al.?Esca?et?black?dead?arm：?deux?acteurs?majeurs?des?maladies?du?bois?chez?la?vigne?［J］.?Comptes?Rendus?Biologies，?2009，?332（9）：?765783.

［12］GRAMAJE?D，?GARCIAJIMENEZ?J，?ARMENGOL?J.?Field?evaluation?of?grapevine?rootstocks?inoculated?with?fungi?associated?with?Petri?disease?and?esca?［J］.?American?Journal?Enology?Viticulture，?2010，?61（4）：?512520.

［13］BAUMGARTNER?K，?HILLIS?V，?LUBELL?M，?et?al.?Managing?grapevine?trunk?diseases?in?Californias?southern?san?joaquin?valley?［J］.?American?Journal?Enology?Viticulture，?2019，?70（3）：?267276.

［14］WEBER?E，?TROUILLAS?F，?GUBLER?W.?Double?pruning?of?grapevines：?A?cultural?practice?to?reduce?infections?by?Eutypa?lata?［J］.?American?Journal?Enology?Viticulture，?2007，?58（1）：?6166.

［15］CREASER?M?L，?WICKS?T?J.?Shortterm?effects?of?remedial?surgery?to?restore?productivity?to?Eutypa?lata?infected?vines?［J］.?Phytopathologia?Mediterranea，?2004，?43（1）：?105107.

［16］王慧，?李興紅，?李永華，?等.?葡萄枝干病害的發生流行規律與防控策略［J］.果樹學報：?2022，?39（2）：?280294.

［17］GEORGOPAPADAKOU?N?H，?WALSH?T?J.?Human?mycoses：?drugs?and?targets?for?emerging?pathogens?［J］.?Science，?1994，?264（5157）：?371373.

［18］ODDS?E?C，?BROWN?A?J，?GOW?N?A.?Antifungal?agents：?mechanisms?of?action?［J］.?Trends?in?Microbiology，?2003，?11（6）：?272279.

［19］ABE?E，?USUI?K，?HIRAM?T.?Fluconazole?modulates?membrane?rigidity，?heterogeneity，?and?water?penetration?into?the?plasma?membrane?in?Saccharomyces?cerevisiae?［J］.?Biochemistry，?2009，?48（36）：?84948504.