漢防己甲素對5種植物病原真菌的抑制作用及對灰葡萄孢的作用機制初探

王雨 王鑫偉 劉洋 劉楚涵 錢怡云 宋萍萍 韋敏

摘要

為尋找環境友好型的農藥先導化合物，利用菌絲生長速率法研究了粉防己中漢防己甲素對常見植物病原真菌的抑制活性，結果表明，漢防己甲素對5種常見植物病原真菌均有抑制作用，對立枯絲核菌的抑制作用最強，EC50為33.49?mg/L;對串珠鐮孢和瓜類黑腐球殼菌的EC50分別為41.71?mg/L和43.97?mg/L，抑制活性優于對照植物源藥劑蛇床子素;對灰葡萄孢的抑制活性與蛇床子素相當。接種藍莓離體葉片的試驗結果表明，漢防己甲素對藍莓灰霉病具有治療和保護作用且作用效果與對照藥劑蛇床子素基本相當;激光共聚焦顯微鏡檢測發現漢防己甲素可降低灰葡萄孢菌絲內鈣離子濃度，漢防己甲素分別與CaCl2及鈣通道阻滯劑維拉帕米兩者相互作用可降低灰葡萄孢對各藥劑的敏感性，表明其作用機制與鈣離子及鈣離子通道有關。本文首次報道漢防己甲素對5種植物病原真菌的抑制作用及其作用機制，為其進一步的開發應用提供理論基礎。

關鍵詞

漢防己甲素;?植物病原真菌;?灰葡萄孢;?鈣離子;?鈣離子通道

中圖分類號：

S?482.292

文獻標識碼：?B

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022343

Inhibitory?effect?of?tetrandrine?on?five?plant?pathogens?and?its?mechanism?on?Botrytis?cinerea

WANG?Yu1，?WANG?Xinwei1，?LIU?Yang1，?LIU?Chuhan2，?QIAN?Yiyun1，?SONG?Pingping1*，?WEI?Min1*

（1.?Jiangsu?Key?Laboratory?for?the?Research?and?Utilization?of?Plant?Resources，?Institute?of?Botany，?Jiangsu?Province?and

Chinese?Academy?of?Sciences，?Nanjing?210014，?China;?2.?Nanjing?University?of?Chinese?Medicine，?Nanjing?210023，?China）

Abstract

In?order?to?search?for?more?effective?environmentfriendly?fungicide?lead?compounds，?sensitivity?of?tetrandrine?on?five?plant?pathogens?were?determined?by?mycelium?growth?rate?method.?The?results?showed?that?tetrandrine?had?antifungal?activity?against?all?tested?pathogens，?displayed?a?strong?antifungal?activity?against?Rhizoctonia?solani?isolate?（EC50=33.49?mg/L），?exhibited?a?higher?activity?against?Fusarium?moniliforme?isolate（EC50=41.71?mg/L）?and?Didymella?bryoniae?isolate（EC50=43.97?mg/L）?than?osthole，?and?showed?significant?activity?against?Botrytis?cinerea?equal?to?osthole.?The?results?of?inoculation?of?blueberry?leaves?in?vitro?showed?that?tetrandrine?had?both?therapeutic?and?protective?activities?against?gray?mold?infections，?equal?to?those?of?osthole.?Laser?confocal?microscopy?showed?that?tetrandrine?could?reduce?the?concentration?of?calcium?ions?in?the?mycelia?of?B.?cinerea，?and?the?interaction?of?tetrandrine?with?CaCl2?and?calcium?channel?blocker?verapamil?could?reduce?the?sensitivity?of?B.?cinerea?to?each?reagent，?indicating?that?the?mechanism?of?tetrandrine?against?B.?cinerea?was?related?to?Ca2+?and?Ca2+?channels.?Our?work?represents?the?first?report?of?the?antifungal?properties?of?tetrandrine?against?five?plant?pathogens?and?its?mechanism，?providing?a?theoretical?basis?for?its?further?development?and?application.

Key?words

tetrandrine;?plant?pathogens;?Botrytis?cinerea;?Ca2+;?Ca2+?channel

植物病原菌引起的植物病害嚴重影響農作物的產量和品質，是農業發展面臨的問題之一，多年來人們解決這一問題的主要方式是化學防治，但近年來化學防治帶來的食品安全、環境污染及抗藥性問題愈發突出［1］，因此亟須研發新型、安全、環保的防治藥劑及綠色防控技術。已有研究證實植物中多種天然化合物對植物病原菌具有較好的抑制作用［23］，這些化合物因作用方式特異、不易產生抗藥性、環境友好、對非靶標生物相對安全等特點逐漸引起人們的關注［4］。

漢防己甲素又稱粉防己甲素，是從防己科千金藤屬植物粉防己Stephania?tetrandra?S.?Moore根莖中提取的一種生物堿，為中藥粉防己的主要活性成分之一［5］。現代藥理學研究發現漢防己甲素具有心血管保護、神經保護、抗肝纖維化、鎮痛、降壓、降血糖和抗自由基損傷等多種藥理作用，臨床上主要用于治療塵肺病、風濕痛、關節痛、神經痛等［56］。文獻報道漢防己甲素可抑制金黃色葡萄球菌Staphylococcus?aureus、大腸桿菌Escherichia?coli、白色念珠球菌Candida?albicans等細菌和真菌［78］，但在抑制植物病原真菌方面的研究未見有報道。基于此，本研究選用粉防己為原料，從中提取分離得到漢防己甲素，采用菌絲生長速率法測試了其對常見植物病原真菌的抑制活性，初步探討了漢防己甲素對灰葡萄孢的抑菌作用機制，為基于天然產物的植物源抑菌劑的開發提供科學依據。

1?材料與方法

1.1?材料

粉防己塊根：購自南京益豐大藥房，將塊根粉碎成粉末狀，過三號篩，保存備用。

供試真菌：立枯絲核菌Rhizoctonia?solani，分離自水稻紋枯病病葉;灰葡萄孢Botrytis?cinerea，分離自草莓灰霉病病株;禾谷鐮孢Fusarium?graminearum，分離自小麥赤霉病病株;串珠鐮孢Fusarium?moniliforme，分離自水稻惡苗病病株;瓜類黑腐球殼菌Didymella?bryoniae，分離自西瓜蔓枯病病株;供試菌株均由南京農業大學植物保護學院饋贈。

供試植物：‘藍莓1號植株栽培于江蘇省中國科學院植物研究所溫室中。

1.2?儀器與藥劑

儀器：METTLER?AE240電子天平，梅特勒托利多儀器公司;高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠;SWCJIFD可調式垂直單向潔凈

工作臺，上海天恒醫療器械有限公司;SPX150BSHⅡ

生化培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司;Agilent

1260?UPLCDAD6530?ESIQTOF?MS

液質聯用儀，美國安捷倫公司;核磁共振譜儀，Bruker?Avance?300;X6顯微熔點測定儀，北京泰克儀器有限公司;搖床，上海智城分析儀器制造有限公司;

Zeiss?LSM?900

激光掃描共聚焦顯微鏡，蔡司公司。

試劑：98%漢防己甲素，陜西綠清生物工程有限公司;98%蛇床子素，四川省維克奇生物科技有限公司;

瓊脂、PBS，北京索萊寶科技有限公司;DMSO、葡萄糖，國藥集團化學試劑有限公司;氯化鈣，廣東光華科技股份有限公司;

Fluo3?AM（鈣離子熒光探針，5?mmol/L），碧云天生物技術有限公司;薄層層析硅膠，青島海洋化工廠分廠;維拉帕米、色譜純甲醇、色譜純乙腈，阿拉丁公司;其他試劑均為分析純。

PDA固體培養基：?200?g去皮馬鈴薯切塊，煮沸10?min后，取汁，加入20?g瓊脂，加熱至融化，再加入20?g葡萄糖，用去離子水定容至1?L。

PD培養液：?200?g去皮馬鈴薯切塊，煮沸10?min?后，取汁，加入20?g葡萄糖，用去離子水定容至1?L。

含鈣PDA培養基：取剛做好的PDA培養基，稱取氯化鈣加入其中，制成氯化鈣終濃度分別為40?000?mg/L?和50?000?mg/L?的含鈣培養基。

1.3?試驗方法

1.3.1?粉防己根中漢防己甲素的提取分離純化與鑒定

準確稱取粉防己塊根粉2.0?kg，75%乙醇熱回流提取，濾過，濾液濃縮成浸膏，加水溶解后二氯甲烷萃取3次，合并有機溶劑后濃縮成浸膏，浸膏溶解，粗硅膠拌樣，柱層析純化，用二氯甲烷∶甲醇?（20∶1，10∶1，5∶1，2∶1，1∶1）梯度洗脫，硅膠板檢測，將含有與漢防己甲素標準品化學位移值相同的溶液合并，反復硅膠柱層析制備得到漢防己甲素粗品，重結晶后制得的固體用丙酮溶解，加水沉析制備得到的晶體經HPLCMS質譜及氫譜數據并與標準品比對鑒定得到純度98%以上的漢防己甲素［911］，用制備得到的漢防己甲素作為供試品進行試驗。

1.3.2?菌絲生長速率法測定漢防己甲素的抑菌活性

采用菌絲生長速率法［12］測定漢防己甲素抑制植物病原菌的EC50。用二甲基亞砜（DMSO）將漢防己甲素配成母液（104mg/L）后加入PDA培養基中，制成含有5個濃度梯度的含藥平板（d=9?cm），以蛇床子素原藥為陽性對照，以加入相應DMSO溶劑為空白對照。將供試病原菌菌餅（直徑為?0.5?cm）分別接種于含藥PDA平板中央，每皿1塊菌餅，菌絲面向下。接種后將培養皿用保鮮膜密封后放置于24?℃培養箱中黑暗培養3～12?d，待對照組菌絲長至超過平板直徑2/3時，用十字交叉法測量菌落直徑，利用DPS軟件計算抑制中濃度EC50及斜率，用GraphPad?Prism?8進行卡方檢驗。每處理重復3次，試驗重復3次。

1.3.3?采用離體葉片法測定漢防己甲素對灰霉病的保護和治療作用

保護作用測定［13］：采摘新鮮的藍莓葉片用水洗凈晾干，分別噴灑用含有0.1%?吐溫80的去離子水稀釋的濃度為0、20、40、60、80、100?mg/L的化合物，將葉片放置于底部有濕潤濾紙的培養皿中，于24?℃培養箱中黑暗培養。24?h后，挑取灰葡萄孢菌餅（直徑0.5?cm）接種于各試驗組長勢基本一致的藍莓葉片中央部位。將接種后的培養皿置于24?℃培養箱中黑暗培養，3?d后，用十字交叉法測定病斑直徑，計算防治效果。每處理10個重復，試驗重復2次。

治療作用測定［13］：采摘新鮮的藍莓葉片用水洗凈晾干后，將灰葡萄孢菌餅（直徑0.5?cm）接種于各試驗組長勢基本一致的藍莓葉片中央部位，將葉片放置于底部有濕潤濾紙的培養皿中，置于24?℃培養箱中黑暗培養。24?h后，分別噴灑用含有0.1%吐溫80的去離子水稀釋的濃度為0、20、40、60、80、100?mg/L的化合物，培養3?d后，用十字交叉法測定病斑直徑，計算防治效果。每處理10個重復，試驗重復2次。

防治效果=（對照組病斑直徑-處理組病斑直徑）/（對照組病斑直徑-0.5）×100%。

1.3.4?外源性鈣離子對漢防己甲素抑菌作用的影響

采用菌絲生長速率法測定外源性鈣離子對漢防己甲素抑菌作用的影響［12，14］。制備含不同濃度CaCl2（40?000、50?000?mg/L）、漢防己甲素（30?mg/L）及二者聯用的含藥培養基，以加入相應DMSO溶劑為空白對照組，將供試病原菌菌餅（直徑為?0.5?cm）分別接種于含藥平板上，保鮮膜密封后置于24?℃培養箱中黑暗培養3～4?d，觀察菌絲生長情況，用十字交叉法測量菌落直徑，計算各藥劑對各病原菌的生長抑制率。

1.3.5?激光共聚焦顯微鏡檢測漢防己甲素對灰葡萄孢菌絲內鈣離子濃度的影響

Fluo3?AM作為最常用的檢測細胞內鈣離子濃度的熒光探針之一，可穿透細胞膜被剪切成Fluo3，繼而與鈣離子結合產生較強的熒光，且熒光在一定時間內強度恒定［15］，因此可用來觀察藥劑對鈣離子濃度的影響。將5個灰葡萄孢菌餅（直徑為0.5?cm）接入150?mL?PD培養液中，于24℃、125?r/min搖培60?h，夾取灰葡萄孢菌絲于培養皿中，PBS洗3次，放置于含有3?μL?Fluo3?AM鈣離子探針的500?μL?PBS的EP管中避光冰水浴超聲30?min，激光共聚焦顯微鏡檢測后有熒光。放入含100?mg/L漢防己甲素的PBS溶液中，用激光共聚焦顯微鏡觀察藥劑處理過的菌絲體內鈣離子濃度的變化［14］。設置激發波長488?nm，發射波長525?nm，分別在5、10?min時進行觀察。以相應溶劑處理菌絲作為對照組，每處理設3次重復。

1.3.6?鈣通道拮抗劑維拉帕米對漢防己甲素抑菌作用的影響

采用菌絲生長速率法測定鈣通道拮抗劑維拉帕米對漢防己甲素抑菌作用的影響［12］。制備含200?mg/L維拉帕米（去離子水為溶劑）、40?mg/L漢防己甲素及二者聯用的含藥培養基，以加入相應DMSO溶劑為空白對照組，將供試病原菌菌餅（直徑為?0.5?cm）分別接種于含藥平板上，保鮮膜密封后置于24?℃培養箱中黑暗培養3～4?d，觀察菌絲生長情況，用十字交叉法測量菌落直徑，計算各藥劑對各病原菌的生長抑制率。

2?結果與分析

2.1?漢防己甲素的鑒定

白色粉末，m.p.223～224.1?℃（文獻［911］：216～222℃）。ESIMS?（m/z）：623.38［M+H］+，分子式為C38H42N2O6。

1HNMR（400?MHz，?CDCl3）δ：2.34（s，?3H），2.38～2.40（m，?1H），2.48（d，?J=33.8，?13.8?Hz，?1H），2.63（s，?3H），2.67～3.12（m，?6H），3.19（s，?3H），3.27（dd，?J=12.3，5.2?Hz，?1H），3.37（s，?3H），3.38～3.40（m，?1H），3.46～3.48（m，?1H），3.75（s，?4H），3.88（dd，?J=10.8，5.6?Hz，?1H），3.93（s，?3H），6.00（s，?1H），6.29（s，?1H），6.30（s，?1H），6.53（d，?J=13.1?Hz，?2H），6.80（d，?J=8.3?Hz，?1H），6.86（d，?J=8.1?Hz，?1H），6.89（d，?J=8.2?Hz，?1H），7.15（d，?J=8.1，?2.5?Hz，?1H），7.35（d，?J=8.2，?2.0?Hz，?1H）。

1HNMR譜數據、質譜數據、熔點數據與文獻［911］一致，故該化合物鑒定為漢防己甲素（tetrandrine）。經HPLCMS測定標準品及提取分離純化的漢防己甲素純度均超過98%。

2.2?漢防己甲素的抑菌活性

2.2.1?漢防己甲素對5種常見病原菌的EC50

按照1.3.2抑菌活性測試方法測定漢防己甲素對5種植物病原菌的EC50結果如表1所示。在5種植物病原真菌中，漢防己甲素對禾谷鐮孢的抑制活性較低，對其他4種植物病原菌的抑制活性較好，對立枯絲核菌的抑制活性最強（EC50=33.49?mg/L）;對串珠鐮孢、瓜類黑腐球殼菌的EC50分別為41.71?mg/L和43.97?mg/L，抑制活性優于對照藥劑蛇床子素;對灰葡萄孢的抑制活性與對照藥劑蛇床子素相當。

2.2.2?離體條件下漢防己甲素對灰霉病的保護和治療作用

保護作用的防效測定結果顯示（表2），在用藥濃度為20、40、60?mg/L時，漢防己甲素與對照藥劑蛇床子素的作用效果無明顯差異，用藥濃度為80、100?mg/L時，蛇床子素的作用效果較好;保護作用的防治效果隨用藥濃度增加而增強，且本試驗用藥濃度的保護防效均在43%以上。

治療作用的防效測定結果顯示（表2），在用藥濃度為20?mg/L時，蛇床子素的作用效果較好，用藥濃度為40、60、80、100?mg/L時，漢防己甲素與對照藥劑蛇床子素之間的作用效果無顯著差異;治療作用的防治效果均隨用藥濃度增加而增強，且本試驗用藥濃度的治療效果均在41%以上。

2.3?漢防己甲素抑菌作用機制初探

2.3.1?外源性鈣離子對漢防己甲素抑菌作用的影響

由表3數據可知，漢防己甲素單獨使用時對灰葡萄孢的抑制率為26.46%，濃度為40?000?mg/L的CaCl2單獨使用時抑制率為40.54%，但二者混合使用時抑制率為40.27%，與CaCl2單獨使用時的抑制率相近;當添加的CaCl2濃度為50?000?mg/L時抑制率為56.01%，聯合使用后抑制率變為49.48%，較CaCl2單獨使用的抑制率沒有上升反而明顯下降。兩個結果都說明漢防己甲素的抑菌活性與CaCl2的抑菌活性沒有相加作用，漢防己甲素可降低灰葡萄孢對CaCl2的敏感性，因此推斷漢防己甲素的抑菌作用機制與鈣離子有關。

2.3.2?利用激光共聚焦顯微鏡檢測漢防己甲素對灰葡萄孢菌絲內鈣離子濃度的影響

為進一步確定漢防己甲素對灰葡萄孢菌絲內鈣離子的影響，通過激光共聚焦顯微鏡進行觀察。本試驗加入Fluo3?AM?后2?h內用激光共聚焦顯微鏡觀察灰葡萄孢菌絲熒光強度未發現有變化，而加入漢防己甲素后熒光強度明顯減弱（如圖1所示），表明灰葡萄孢菌絲內鈣離子濃度降低，且觀察時間越長，降低程度越明顯。此結果說明漢防己甲素對灰葡萄孢的抑菌作用與鈣離子有關。

2.3.3?鈣通道拮抗劑維拉帕米對漢防己甲素抑菌作用的影響

由表4數據可知，漢防己甲素單獨使用時對灰葡萄孢的抑制率為37.19%，維拉帕米單獨使用時抑制率為44.79%，但二者混合使用時抑制率為51.86%。此結果說明漢防己甲素的抑菌活性與維拉帕米的抑菌活性并不是單純的相加作用，兩者相互作用可降低灰葡萄孢對各自的敏感性，因此可推斷出漢防己甲素的抑菌作用機制也與鈣通道有關。

3?結論與討論

漢防己甲素具有心血管保護、降壓、降血糖等多種藥理作用［56］，還可抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌等細菌和真菌［78］，但在抑制植物病原真菌方面的研究未見有報道。本試驗以粉防己塊根為原料進行提取分離純化得到含量為98%以上的漢防己甲素，采用菌絲生長速率法對其抑菌活性進行研究，發現其對供試病原真菌均有抑制作用，且漢防己甲素對灰霉病的保護和治療作用效果與對照藥劑蛇床子素相當，有進一步研究的價值。

漢防己甲素為一種非選擇性的鈣離子通道阻滯劑，動物細胞試驗表明，其可調節細胞外Ca2+內流，平衡細胞內外Ca2+濃度，維持Ca2+在內環境的穩態等［1619］。真菌中，Ca2+可調控很多內在的代謝及外在環境刺激過程，如細胞周期、孢子萌發、菌絲頂端生長、生物鐘以及滲透脅迫、熱休克、機械刺激及氧化脅迫等［2023］。目前鈣/鈣調神經磷酸酶信號通路已被認為是抗菌劑的潛在作用靶標［24］，通路中有Ca2+通道蛋白、鈣調磷酸酶等重要蛋白。鈣離子通道阻滯劑作用于Ca2+通道蛋白，加入鈣通道阻滯劑可以影響真菌的正常生理過程，例如?Shaw?等報道鈣拮抗劑可降低葉點霉Phyllosticta?ampelicida分生孢子萌發率和附著胞的形成率［22］，鈣拮抗劑維拉帕米可使胃腸道定殖的白色念珠菌細胞顯著減少［25］。漢防己甲素已被證明為鈣離子通道阻滯劑，作用于鈣通道蛋白，故推測其抑菌作用機制可能與Ca2+和Ca2+通道蛋白有關。基于此，本文研究了添加外源性Ca2+及鈣通道阻滯劑維拉帕米對漢防己甲素抑菌活性的影響，并通過激光共聚焦顯微鏡檢測漢防己甲素對灰葡萄孢菌絲內鈣離子濃度的影響，結果證明漢防己甲素對灰葡萄孢的抑菌作用機制與鈣離子及鈣離子通道有關。

漢防己甲素是防己科千金藤屬植物粉防己中分離提取的雙芐基異喹啉類生物堿，已作為臨床藥物用于抗風濕及陣痛、抗肺癌、抗矽肺等。雖然已開展了許多工作，但對于抑制植物病原真菌方面的研究未見有報道。本文首次發現漢防己甲素具有抑制植物病原真菌的作用，并對其抑菌作用機制進行了初步探索，為進一步開發高效低毒的新型殺菌劑提供理論基礎。

參考文獻

［1］?宋佳露，?程星凱，?劉鵬飛，?等.?植物病原菌對殺菌劑多藥抗性的發生現狀［J］.?植物保護，?2021，?47（6）：?2833.

［2］?宋萍萍.?五種類型天然香豆素化合物的活性研究［D］.?南京：?南京農業大學，?2016.

［3］?徐曙，?趙興增，?周倩，?等.?甘草根中黃酮類化合物的提取、分離與衍生化及其抑菌活性研究［J］.?植物資源與環境學報，?2020，?29（6）：?3241.

［4］?石志琦，?范永堅，?王裕中.?天然化合物在農藥中的應用研究［J］.?江蘇農業學報，?2002（4）：?241245.

［5］?劉繼紅，?賴月琴，?王浩宇，?等.?漢防己甲素全合成研究進展［J］.?合成化學，?2022，?30（2）：?146152.

［6］?張翔宇，?曹世杰，?王小瑩，?等.?漢防己甲素及其衍生物的研究進展［J］.?中國藥物化學雜志，?2022，?32（1）：?10.

［7］?李楊.?異喹啉類生物堿及其衍生物體外抗菌活性研究［D］.?昆明：?昆明醫學院，?2010.

［8］?李水秀，?劉朝紅，?張宏，?等.?漢防己甲素對氟康唑抗白念珠菌生物膜增效活性的初步研究［J］.?中國人獸共患病學報，?2011，?27（11）：?953957.

［9］?傅志慧，?應志洪，?嚴突明，?等.?漢防己甲素的合成［J］.?中國醫藥工業雜志，?2015，?46（9）：?948949.

［10］菲索查克.?漢防己甲素原料藥的質量控制及穩定性研究［D］.?南寧：廣西醫科大學，?2016.

［11］郭為.?漢防己甲素原料藥的制備工藝及結構確證研究［D］.?南寧：?廣西醫科大學，?2016.

［12］SONG?Pingping，?ZHAO?Jun，?LIU?Zongliang，?et?al.?Evaluation?of?antifungal?activities?and?structureactivity?relationships?of?coumarin?derivatives?［J］.?Pest?Management?Science，?2017，?73（1）：?94101.

［13］HOU?Yipin，?MAO?Xuewei，?WU?Luoyu，?et?al.?Impact?of?fluazinam?on?morphological?and?physiological?characteristics?of?Sclerotinia?sclerotiorum［J］.?Pesticide?Biochemistry?and?Physiology，?2019，?155（3）：?8189.

［14］SONG?Pingping，?WANG?Yu，?HOU?Yiping，?et?al.?Crucial?role?of?Ca2+?/CN?signalling?pathway?in?the?antifungal?activity?of?disenecioylciskhellactone?against?Botrytis?cinerea［J］.?Pest?Management?Science，?2022，?78（11）：46494659.

［15］王春梅，?張杰，?陳浩，?等.?天然化合物丁香酚對灰葡萄孢菌絲脂質過氧化和膜損傷的影響［J］.?農藥學學報，?2009，?11（1）：?104108.

［16］孔曉旭，?左紅艷，?李楊.?粉防己堿的藥理作用及臨床應用研究進展［J］.?國際藥學研究雜志，?2020，?47（7）：?496501.

［17］LIU?Kuoching，?LIN?Yajing，?HSIAO?Y，?et?al.?Tetrandrine?induces?apoptosis?in?human?nasopharyngeal?carcinoma?NPCTW?039?cells?by?endoplasmic?reticulum?stress?and?Ca2+/calpain?pathways［J］.?Anticancer?Research，?2017，?73（11）：?61076118.

［18］張樂之，?何華美，?李新芳，?等.?粉防己堿的抗炎作用與炎癥白細胞cAMP的關系［J］.?中國藥理學通報，?2003，?19（7）：?791796.

［19］徐友涵，倪基德.?粉防己堿紅細胞膜依賴鈣調蛋白?Ca2+Mg2+ATPase?的一種新的天然抑制劑［J］.?科學通報，?1985，?30（17）：?13481351.

［20］ULRIKE?B，?CHU?Meiling，?NICK?D?R，?et?al.?The?antifungal?activity?of?the?Penicillium?chrysogenum?protein?PAF?disrupts?calcium?homeostasis?in?Neurospora?crassa?［J］.?Eukaryotic?Cell，?2010，?9（9）：?13741382.

［21］GADD?G?M.?Singal?transduction?in?fungi?［M］∥GROW?N?A，?GADD?G?M.?The?growing?fungus.?London：Chapman?&?Hall.?1994：?183210.

［22］SHAW?B?D，?HOCH?H?C.?Ca2+?regulation?of?Phyllosticta?ampelicida?pycnidiospore?germination?and?appressorium?formation?［J］.?Fungal?Genetics?&?Biology，?2000，?31（1）：?4353.

［23］BENELOUJAEPHAJRI?E，?COSTA?A，?LHARIDON?F，?et?al.?Production?of?reactive?oxygen?species?and?woundinduced?resistance?in?Arabidopsis?thaliana?against?Botrytis?cinerea?are?preceded?and?depend?on?a?burst?of?calcium?［J/OL］.?BMC?Plant?Biology，?2013，?13（1）：?160.?DOI：10.1186/1471222913160.

［24］LIU?Shuyuan，?HOU?Yinglong，?LIU?Weiguo，?et?al.?Components?of?the?calciumcalcineurin?signaling?pathway?in?fungal?cells?and?their?potential?as?antifungal?targets?［J］.?Eukaryotic?Cell，?2015，?14（4）：?324334.

［25］YU?Qilin，?DING?Xiaohui，?ZHANG?Bing，?et?al.?Inhibitory?effect?of?verapamil?on?Candida?albicans?hyphal?development，?adhesion?and?gastrointestinal?colonization?［J］.?FEMS?Yeast?Research，?2014，?14（4）：?633641.

（責任編輯：田?喆）