遼寧梨樹枝枯病病原菌Diplodia seriata 的分離與鑒定

丁丹丹 劉博 李爽 趙繼榮 程國亭 回虹燕 徐成楠

摘要

在遼寧興城秋子梨栽培園出現(xiàn)一種新型枝干病害，主要癥狀為枝枯及木質(zhì)部壞死。為明確梨樹枝枯病病原菌的分類地位，本研究從遼寧興城地區(qū)采樣，經(jīng)過菌株分離培養(yǎng)和致病性測定，以及形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)合病原菌的ITS、EF1α和βtubulin多基因聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定引起秋子梨枝枯病的病原菌為色二孢Diplodia?seriata。研究結(jié)果為明確色二孢引起的遼寧梨樹枝枯病發(fā)生規(guī)律和防治措施的制定提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞

梨樹;?枝枯病;?系統(tǒng)發(fā)育分析;?色二孢

中圖分類號：

S?436.612

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022045

Isolation?and?identification?of?the?pathogen?Diplodia?seriata?causing?stem?blight?disease?on?pear?in?Liaoning

DING?Dandan，?LIU?Bo，?LI?Shuang，?ZHAO?Jirong，?CHENG?Guoting，?HUI?Hongyan，?XU?Chengnan*

（College?of?Life?Science，?Yanan?University，?Shaanxi?Key?Laboratory?of?Chinese?Jujube，Yanan?716000，?China）

Abstract

A?new?stem?disease?on?Pyrus?ussuriensis?orchard?with?typical?symptoms?including?branches?dieback?and?xylem?necrosis?was?observed?in?Xingcheng?city，?Liaoning?province.?In?order?to?clarify?the?pathogen?causing?stem?blight?disease?on?pear?in?Liaoning，?samples?were?collected，?meanwhile，?isolates?were?purified?and?Kochs?postulation?was?carried?out.?Based?on?morphological?features?and?combined?gene?sequence?analysis?on?ITS，?EF1α?and?βtubulin，?the?causal?pathogen?of?this?new?disease?was?identified?to?be?Diplodia?seriata.?Our?results?provided?a?theoretical?basis?for?further?research?on?the?disease?epidemic?and?control?strategy?of?stem?blight?disease?on?P.ussuriensis?in?Liaoning.

Key?words

pear;?stem?blight;?phylogeny?analysis;?Diplodia?seriata

梨是世界性主要果樹品種之一，我國梨樹種植面積和產(chǎn)量繼蘋果和柑橘之后居第三位［1］。梨樹在我國種植范圍廣泛，根據(jù)國家統(tǒng)計局統(tǒng)計數(shù)據(jù)，截至2020年底，我國梨栽植面積達(dá)94萬hm2，總產(chǎn)量達(dá)到1?781萬t，居全球首位。遼寧是我國梨栽培第二大省，秋子梨Pyrus?ussuriensis?Maxim.、白梨P.bretschneideri?Rehd.、西洋梨P.communis?L.和沙梨P.pyrifolia?（Burm.F.）?Nakai四大系統(tǒng)均有分布。很多特色梨品種在國內(nèi)外均享有盛譽(yù)［2］。梨輪紋病、枝枯病和潰瘍病長期危害我國北方梨產(chǎn)區(qū)，近年來作者曾在遼寧省興城地區(qū)發(fā)現(xiàn)間座殼Diaporthe?nobilis侵染‘錦豐梨引起枝枯癥狀［3］。隨著遼寧省矮砧密植梨樹新栽培模式的發(fā)展，真菌侵染引起的枝干病害日趨嚴(yán)重，甚至造成幼樹死亡，影響當(dāng)?shù)乩鏄浒杳苤残略耘嗄Ｊ降膹V泛推廣。

2019年8月，作者在遼寧省興城市一個矮化栽培梨園發(fā)現(xiàn)一種新病害，癥狀主要表現(xiàn)為當(dāng)年生枝條枯萎、主干木質(zhì)部壞死，該病害的發(fā)生嚴(yán)重影響新建梨園幼樹的成活率，阻礙了遼寧興城地區(qū)矮砧密植梨樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，本研究在對遼寧秋子梨樹枝枯病害進(jìn)行調(diào)查的基礎(chǔ)上，對癥狀進(jìn)行了詳細(xì)描述，對采集的病樣進(jìn)行分離純化，結(jié)合真菌形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)對其病原菌進(jìn)行鑒定，明確該病原種類歸屬，以期為該病害的發(fā)生流行規(guī)律及防治策略研究奠定理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?供試材料

2019年8月在遼寧省興城市梨樹枝枯病發(fā)生嚴(yán)重梨園進(jìn)行調(diào)研采樣。梨園栽培模式為矮化密植新型栽植方式，砧木為杜梨Pyrus?betulifolia?Bunge，嫁接接穗為秋子梨。采集具有梨樹枝枯病典型癥狀的患病枝條，觀察拍照并記錄病害癥狀特征。

供試培養(yǎng)基包括馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）和2%水瓊脂培養(yǎng)基（WA）。其他材料包括：滅菌松針30根;2×Taq?MasterMix、DNA?marker?DL2000，康為世紀(jì)公司;CTAB、Tris、EDTA、瓊脂糖，生工生物工程（上海）股份有限公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2?病原菌的分離

采用常規(guī)組織分離法分離病原。從發(fā)病枝條的病健交界處切取5?mm?×?5?mm大小組織塊，用清水洗凈后，先用75%乙醇表面消毒45?s，再用無菌水漂洗2次后置于PDA培養(yǎng)基上于25℃黑暗培養(yǎng)。挑取菌絲體進(jìn)行純化，將純化后的菌株4℃保存于延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物病原真菌學(xué)與病害綜合防治研究室。選取代表性菌株pearbot1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3?分離株致病性測定

采用有傷和無傷接種方式測定pearbot1對梨樹枝條和果實(shí)的致病性。選擇健康的當(dāng)年生秋子梨枝條及果實(shí)備用，將枝條截為25?cm長枝段，用無菌水清洗后用75%乙醇表面消毒，兩端封蠟。自然風(fēng)干后使用4?mm打孔器在枝段及果實(shí)表皮打上圓形傷口并去掉皮層，同時用4?mm打孔器打取病菌菌絲塊，菌絲面貼至有傷或無傷枝條以及果實(shí)傷口表面。以接種PDA作為對照。接種后枝條置于搪瓷盤中用塑料膜密封，果實(shí)置于塑料密封盒中，25℃恒溫保濕培養(yǎng)。有傷、無傷枝條及果實(shí)分別接種3根枝條及3個果實(shí)，每枝條和果實(shí)設(shè)置3個接種點(diǎn)并均勻分布，重復(fù)3次。逐日觀察記錄枝條及果實(shí)發(fā)病情況，待接種試材出現(xiàn)癥狀后，再次進(jìn)行組織分離培養(yǎng)并用形態(tài)學(xué)方法鑒定病原菌。

1.4?病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株pearbot1接種于PDA平板上，25℃恒溫黑暗培養(yǎng)7?d，觀察并記錄菌落生長特性，同時將菌株接種于含有滅菌松針的2%水瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)孢觀察。待病原菌產(chǎn)孢后，挑取分生孢子器制成臨時玻片，用顯微鏡觀察其形態(tài)，拍照并測量分生孢子大小，與文獻(xiàn)報道的相關(guān)病原菌進(jìn)行比對分析。

1.5?病原菌分子生物學(xué)鑒定

收集培養(yǎng)7?d的病原菌菌絲體，采用改良的CTAB法［4］提取菌絲DNA。分別利用真菌通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′），EF1

728F（5′CATCGAGAAGTTCGAGAAGG3′）和EF1986R（5′TACTTGAAGGAACCCTTACC3′），Bt2a（5′GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC3′）和Bt2b（5′ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC3′）對病原菌的rDNAITS、EF1α和βtubulin基因進(jìn)行擴(kuò)增;擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將獲得的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，并提交序列至GenBank。下載GenBank中已發(fā)表的色二孢及葡萄座腔菌相關(guān)菌株序列信息，利用MEGA?7.0軟件的最大似然法（maximum?likelihood，ML）構(gòu)建3基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所用菌株及登錄號見表1。

2?結(jié)果與分析

2.1?病害田間調(diào)查與病原菌分離純化

2019年至2020年對遼寧省興城市梨樹枝枯病田間病害發(fā)生情況調(diào)查表明，該病害主要危害梨樹主干和當(dāng)年生幼嫩枝條，并且主要危害新建梨園中2～3年生幼樹，梨園病株率為25%。當(dāng)年生梨樹枝條染病部位黑褐色，病斑呈梭形沿枝條上下擴(kuò)展。梨樹主干枝枯癥狀多在矮化砧木處開始發(fā)生，病原菌從矮化砧木修剪傷口處侵染，沿主枝維管束組織擴(kuò)展，導(dǎo)致主干枝條組織壞死，枝干外部呈現(xiàn)棕褐色至黑褐色病斑，病斑偶爾凹陷，發(fā)病梨樹枝干組織表面著生黑色小顆粒狀物即為病原菌的子實(shí)體。發(fā)病嚴(yán)重的梨樹整株枯死，將枝條橫切后，可見木質(zhì)部一側(cè)維管束組織壞死，變?yōu)樽睾稚蚝谏▓D1）。通過對發(fā)病枝條組織分離培養(yǎng)，獲得形態(tài)學(xué)表現(xiàn)一致的疑似病原分離株25株，編號為pearbot1～pearbot25。選取代表性菌株pearbot1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2?分離株致病性測定

在健康梨樹有傷離體枝條和果實(shí)表面接種分離株pearbot1均可引致枝枯病癥狀的發(fā)生。梨樹離體枝條接種后2?d，接種點(diǎn)部位出現(xiàn)黑褐色水漬狀病斑，病斑凹陷并向兩端擴(kuò)展，5?d后接種枝條一側(cè)木質(zhì)部組織變?yōu)楹谏９麑?shí)接種后2?d，接種點(diǎn)部位呈圓形黑褐色水漬狀病斑，切開發(fā)病果實(shí)，可見果肉組織變?yōu)楹诤稚o傷接種以及接種PDA的對照枝條及果實(shí)未出現(xiàn)任何癥狀（圖2）。從接種后發(fā)病的枝條及果實(shí)上重新分離到該病原菌，根據(jù)柯赫氏法則，分離株是引起梨樹枝枯病的病原菌。

2.3?病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將代表性分離株pearbot1在PDA平板上25℃暗培養(yǎng)，菌落生長速度較快，培養(yǎng)2?d菌落直徑可達(dá)8.0?cm。菌落生長初期呈白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，邊緣整齊;后期菌落呈灰色至黑色，菌絲呈簇狀直立生長，生長至培養(yǎng)皿皿蓋處（圖3a）。分離株在含滅菌松針的2%水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)15?d后產(chǎn)生分生孢子器。分生孢子器散生、單室、近球形、器壁黑色、近炭質(zhì);分生孢子單胞、橢圓形、兩端鈍圓，初期無色透明，后期轉(zhuǎn)為棕色，分生孢子大小為（24.82±3.09）μm?×（10.69±1.15）μm?（n=20）（圖3b）。根據(jù)上述形態(tài)學(xué)特征將所獲病原菌分離株初步鑒定為色二孢屬Diplodia真菌。

2.4?病原菌多基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析

擴(kuò)增代表菌株pearbot1核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（ITS）、α延伸因子序列（EF1α）和微管蛋白序列（βtubulin），分別得到大小為555、260?bp和432?bp的基因片段。BLAST序列比對結(jié)果顯示，菌株的3段保守基因分別與色二孢Diplodia?seriata相關(guān)基因相似性達(dá)到99%，將所有序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號分別為OM018671、OM063100和OM063099。

下載NCBI數(shù)據(jù)庫中色二孢屬以及葡萄座腔菌科其他屬相關(guān)物種的ITS、EF1α和βtubulin相關(guān)序列，利用MEGA軟件選擇最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖4可以看到分離株pearbot1與色二孢的模式菌株CBS121885T、CBS112876T和CBS112555T的序列聚在同一個分支，而與其他種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，該獨(dú)立分支自舉支持率達(dá)到100%（圖4）。結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征，將該病原菌鑒定為色二孢Diplodia?seriata。

3?結(jié)論與討論

本研究對遼寧省興城市矮化密植梨園中的梨樹枝枯病進(jìn)行病害診斷，分離獲得病原菌分離株并且在梨樹枝條和果實(shí)上驗(yàn)證了其致病性。通過傳統(tǒng)真菌形態(tài)學(xué)特征結(jié)合多基因的系統(tǒng)發(fā)育分析對病原菌進(jìn)行了鑒定，確定引致該病害的病原菌為色二孢?Diplodia?seriata，田間病害調(diào)研及實(shí)驗(yàn)室病菌培養(yǎng)過程中均未發(fā)現(xiàn)其有性階段。

Diplodia?seriata是葡萄座腔菌科真菌中的重要一員，廣泛分布于世界上大多數(shù)熱帶及溫帶地區(qū)［56］。D.seriata是一種重要的植物病原真菌，寄主范圍十分廣泛，可以侵染梨和蘋果等多種植物的枝干和果實(shí)，引起葉斑病、果實(shí)黑腐病、枝干潰瘍及枝枯病等多種病害，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［78］。近年來，色二孢屬真菌作為葡萄、蘋果和梨樹等重要經(jīng)濟(jì)果樹病原菌在國內(nèi)外被廣泛報道［911］，D.seriata引起梨樹潰瘍和枝枯等癥狀分別在中國、土耳其和美國有發(fā)生報道［5，?1314］。由于葡萄座腔菌科真菌極少在田間和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)產(chǎn)生有性階段，該科真菌分類主要依賴無性型分生孢子器和分子孢子形態(tài)特征［1516］。隨著DNA序列分析及多基因分子系統(tǒng)學(xué)的發(fā)展，基于形態(tài)學(xué)特征和分子特征的該科真菌系統(tǒng)分類逐漸得到了廣泛應(yīng)用，也極大地促進(jìn)了植物病原真菌系統(tǒng)分類學(xué)的發(fā)展［17］。我們在田間調(diào)研發(fā)現(xiàn)，矮砧密植栽培秋子梨時，矮化砧木存在剪鋸口，而傷口是該病原菌侵染的重要途徑。Slippers等［18］的研究表明，D.seriata等葡萄座腔菌科真菌通常作為一種弱寄生菌或內(nèi)生真菌存在于寄主體內(nèi)，在本研究中僅有傷枝條接種發(fā)病也印證了這一觀點(diǎn)，因此在梨樹枝枯病的防治過程中更應(yīng)高度重視梨樹砧木嫁接傷口的保護(hù)，避免病原菌從該處侵入寄主危害主干。本文研究結(jié)果為進(jìn)一步探索由色二孢引起的梨樹枝枯病的致病機(jī)制和綜合防治提供了理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：田?喆）