黃芩苷對豬源腸外致病性大腸桿菌的體內保護作用

任明星，肖 涌，付書林，宗冰冰，2，3，邱銀生

（1.武漢輕工大學動物科學與營養工程學院，武漢 430023；2.農業農村部畜禽細菌病防治制劑創制重點實驗室，武漢430064；3.畜禽病原微生物學湖北省重點實驗室，武漢 430064）

豬源腸外致病性大腸桿菌（Extraintestinal pathogenicEscherichia coli，ExPEC）是威脅養豬業的重要病原體之一，會導致較大的經濟損失［1］。豬源ExPEC 可引起豬腦膜炎、關節炎、肺炎和敗血癥等致命性感染［2，3］。隨著中國養豬業的快速發展，豬Ex-PEC 的分離率逐年提高。抗生素在臨床上廣泛應用于治療ExPEC 引起的感染。研究表明，動物體內多抗生素大腸桿菌的分離率顯著增加，95.2%的分離株對至少5 種抗生素具有耐藥性，60.3%的分離株對10 種以上抗生素具有耐藥性［4］。多重耐藥大腸桿菌的出現，使預防和控制其臨床感染變得更困難。然而，目前還沒有能有效地預防和治療豬ExPEC 菌株感染的措施。

Let U be the signal subspace matrix of covariance matrixSimilarly,there is a unique non-singularmatrix T,which satisfies

黃芩苷是一種從黃芩等藥用植物中分離的黃酮類化合物［5］，具有抗菌、抗炎、抗微生物及抗氧化等藥理作用［6］。研究表明，黃芩苷具有強大的生物活性，并具有重要的生物學功能，如對肺、子宮和其他器官具有抗炎、抗氧化和抗癌作用［7，8］，還能夠降低副豬嗜血桿菌毒力，調控炎癥信號通路，減弱炎癥反應達到抗菌效果［9，10］。黃芩苷可減輕金黃色葡萄球菌引起的人肺泡上皮A549 細胞損傷，降低其對A549 細胞的黏附，并顯著減弱小鼠巨噬細胞對金黃色葡萄球菌的炎癥反應［11］。黃芩苷能顯著降低雞的死亡率和減輕肺組織病理改變，達到對禽致病性大腸桿菌（APEC）誘導雞急性肺損傷的保護作用［12］。黃芩苷可通過干擾QS、生物膜的形成和毒力基因的表達來降低APEC 感染的雞Ⅱ型肺細胞的細胞損傷［13］。黃芩苷可以抑制生物膜的形成，減弱群體感應控制的毒力，并增強小鼠模型中銅綠假單胞菌的清除［14］。豬源ExPEC 危害嚴重且無有效預防和治療措施，已證明黃芩苷對大腸桿菌、銅綠假單胞菌和APEC 等多種細菌的毒力表型具有抑制作用［13-15］。因此，推測黃芩苷在豬源ExPEC 致病過程中發揮的作用。

本研究選用黃芩苷作為治療藥物，探討黃芩苷在豬源ExPEC 感染小鼠過程中發揮的作用，探究黃芩苷是否對豬源ExPEC 感染小鼠具有保護作用，以期為豬ExPEC 提供了一種新的潛在藥物治療方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥品 黃芩苷原料藥92%（生產批號：C031B180101），購自四川協力制藥股份有限公司。

菌株：試驗用菌株PCN033，為血清型O11 的強毒株，由華中農業大學譚臣教授饋贈，武漢輕工大學動物科學與營養工程學院實驗室保存。

1.1.2 試驗動物與菌株 試驗動物：五周齡昆明小鼠45 只，雌性，購自湖北省疾病預防控制中心，飼養3 d，期間按時更換墊料，保證充足的飼料和飲水。

存活率試驗感染后，稱量并記錄感染后小鼠的體重變化。感染初期（0~24 h），各組小鼠的體重均急劇下降，而黃芩苷治療組體重下降程度相對于感染組要緩慢；感染中期（24~36 h），各組小鼠的體重基本保持不變；感染中后期（36 h 后），各組小鼠的體重維穩，且有一定程度回升（圖1）。黃芩苷在豬源腸外致病性大腸桿菌感染早期，可以減緩小鼠體重下降，但是后期感染組小鼠和治療組小鼠的體重均開始回升。因此，體重變化僅能反映黃芩苷在感染初期對豬源腸外致病性大腸桿菌感染小鼠的體重下降程度有一定的減緩作用，但是否能達到最終的保護效果仍需進一步研究。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 存活率試驗：隨機將30 只小鼠分為3 組，每組10 只小鼠，分別為空白對照組、感染對照組和50 mg/kg 黃芩苷治療組。組織載菌量試驗：隨機將15 只小鼠分為3 組，每組5 只小鼠，分別為空白對照組（不感染不給藥）、感染模型組（感染后不給藥）、藥物治療組（感染后給藥）。

1.2.2 存活率試驗 飼養3 d 觀察無異常后，進行攻毒和藥物處理。采用腹腔感染，細菌以106CFU 的劑量腹腔接種感染組和治療組小鼠（治療組皮下多點注射黃芩苷），接種同樣劑量PBS 溶液的小鼠作為空白對照組。觀察并記錄感染后小鼠的臨床表現、體重變化、采食量變化及存活情況等。

1.2.3 組織載菌量試驗 組織載菌量試驗（剖檢病變觀察、組織載菌量計數、病理切片），感染組和治療組小鼠接種107CFU 的菌液（治療組皮下多點注射黃芩苷），空白組小鼠注射等量PBS 溶液作為對照。感染6 h 后麻醉小鼠采血（EP 管中提前放入肝素鈉防止凝血），打開其胸腔，進行心臟灌流后分離臟器（EP 管中放有1 mL PBS 溶液和滅菌鋼珠），包括心臟、肝臟、脾臟、腎臟。觀察組織解剖病變后，將取出的臟器部分用于組織載菌量計數。經稱重、研磨后，取合適稀釋度均勻涂布于LB 固體平板上計數，計算出各菌株在臟器中的含菌量（CFU/g）。

1.2.4 組織病理學觀察 取灌流后各臟器的部分組織制備病理切片，將組織浸泡于4%多聚甲醛固定，切片、包埋、染色，最后在光學顯微鏡下觀察各組織病變。

歐陽鋒確實難受。難受得要命。他很想將上半夜發生的糗事原原本本地告訴妻子，好幾次話到嘴邊又給咽了回去。結婚兩年，七百多個日日夜夜，他與呂凌子互尊互愛相敬如賓，連臉都沒紅過一次。現在可好，自己闖了禍，犯了錯，木已成舟，鐵證如山，他不知道妻子一旦了解真相會有什么樣的反應，能否原諒自己。就算妻子呂凌子原諒自己，樓下兩口子又豈能善罷甘休？歐陽鋒感覺頭疼得厲害，像是要爆炸了一般。他后悔自己不該去赴約，如果不去赴約，這樣的事情無論如何也不會落在自己頭上；他更后悔自己不該講那個黃段子，如果不講那個黃段子，自己就不會喝那么多酒，如果不喝那么多酒，自己決不會進錯房門上錯床，胯下那根該死的玩意也不可能惹事生非……

黃芩苷治療組小鼠的心臟、肝臟、脾臟和腎臟中的細菌計數與感染PCN033 的小鼠相比降低。黃芩苷治療后，菌體在小鼠心臟、肝臟、脾臟和腎臟中的定殖能力極顯著下降（P＜0.01）（圖3）。組織載菌量試驗結果表明，黃芩苷抑制了豬源腸外致病性大腸桿菌在小鼠組織中的定殖。

2 結果與分析

2.1 小鼠體重變化

1.1.3 儀器 全自動樣品快速研磨儀購自上海凈信實業發展有限公司；LDZX-75L 型立式高壓蒸汽滅菌鍋購自上海申安醫療器械廠；ZHWY-103B 型迷你型多振幅軌道搖床購自上海智城分析儀器制造有限公司；PX224ZH 型電子天平購自奧豪斯儀器（上海）有限公司；ZRQSVP500 型Millipore-Q 超純水機購自美國默克有限公司。

2.2 小鼠臨床癥狀及存活率

組織載菌量剖檢時發現感染PCN033 的小鼠組織器官有不同程度的病變，且黃芩苷治療后有一定程度好轉。感染PCN033 后，心肌纖維溶解甚至消失，炎性細胞滲出；肝細胞腫大變形；脾臟炎性細胞浸潤增多；腎間質炎癥細胞浸潤；與感染PCN033 的小鼠相比，黃芩苷治療組小鼠的心臟、肝臟、脾臟和腎臟中的病理變化均明顯減少。黃芩苷治療后，小鼠心臟、肝臟、脾臟和腎臟的病理變化均明顯減弱，表明黃芩苷治療后，PCN033 感染小鼠后各組織器官產生的病變明顯減弱（圖4）。

在跨文化商務溝通中，人們總是試圖成功而愉快地進行商務交流。不管買賣交易是否達成，中國文化中歷來講究買賣不成仁義在，所以在交易時與對方意見產生矛盾時，模糊限制語的使用使得交流能夠和諧進行。

圖2 感染組與治療組小鼠存活率

2.3 組織載菌量試驗結果

深度學習的本質是構建一種具有多種隱藏層的機器學習模型，通過進行海量的數據訓練，獲取具有價值的特征，最終實現正確的分類或準確的預測[12]。深度學習[13]正是通過應用基于卷積神經網絡[14]的學習機器設備，以日臻智能化的教學輔助手段，幫助學習者在掌握一定認知規律的基礎上進行高效度的知識強化訓練，使學習者的認知能力與學習成效得到更為有效的提升。

2.4 組織病理切片試驗結果

感染組和治療組小鼠相對于對照組均表現出一定程度的癥狀，如精神萎靡、蜷縮無力、食欲不振等，而治療組小鼠在感染初期與感染組癥狀程度相當，24 h 后治療組小鼠相對于感染組小鼠癥狀有一定程度好轉，與體重變化結果基本一致。感染組小鼠在24 h 出現死亡病例，而黃芩苷治療組小鼠全部存活。黃芩苷治療組小鼠存活率相對于感染組高10 個百分點（圖2）。雖然黃芩苷對豬源腸外致病性大腸桿菌感染的小鼠具有一定的保護作用，但是單獨使用黃芩苷治療豬源腸外致病性大腸桿菌并不能達到很好的治療效果。

其次，這部小說的結構也具有一定的象征意義。福斯特在寫作這部小說時，將隱喻和轉喻兩種修辭手法糅合于整部小說的結構中，因此，《印度之行》這部小說就具有了雙重結構。《印度之行》這部小說結構包括表層結構和深層結構，小說的表層結構是直線型的，這種結構形式能夠促使小說情節按照時間順序發展；小說的深層結構是循環型的，這種結構形式能夠深化小說的主題，揭示其主題思想。

3 小結與討論

ExPEC 由于其特殊的毒力因子而區別于腸內致病性大腸桿菌，在腸道定殖卻不致病，而是能夠引起腸外多種組織器官病變［1］。豬源ExPEC 在養豬業造成了重大的經濟損失［1，2］。中國養殖場中豬源Ex-PEC 的分離率逐漸提高，且大多分離株為多重耐藥菌株［4］。因此，迫切需要找尋新的治療方法來解決該問題。

黃芩苷是提取自中藥黃芩的一類黃酮類化合物，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性。研究表明，黃芩苷在抗炎、抗氧化、抗癌等過程中發揮重要的作用［7，8］，影響多種細菌的致病性［16，17］。黃芩苷通過抑制大腸桿菌1 型鞭毛系統相關基因的表達，降低黏附能力與遷移能力，抑制生物被膜的形成，使大腸桿菌侵襲能力下降［16］。黃芩苷能夠抑制副豬嗜血桿菌多種毒力基因的表達，降低其致病性［17］。目前，黃芩苷對動物源ExPEC 致病性的作用研究多集中在APEC，豬源ExPEC 的研究少有報道。因此，選用黃芩苷為研究對象，探究黃芩苷對豬源ExPEC感染小鼠是否具有保護作用。

豬源ExPEC PCN033 已在豬和小鼠中成功建立感染模型［2，18，19］。小鼠存活率試驗結果表明，在豬源ExPEC 感染小鼠后，可引起明顯的病變。黃芩苷治療后減弱小鼠的臨床病變，減緩小鼠的體重下降趨勢，減弱組織病理損傷，并一定程度上提高了小鼠的存活率，與黃芩苷在APEC 中的研究結果趨勢一致［12，13］。豬源ExPEC PCN033 已被報道在感染豬和小鼠后會引起多組織器官的炎癥病變［2，18，19］。研究表明，黃芩苷能抑制LPS 誘導上皮細胞炎性因子的表達來降低炎癥反應［20，21］。黃芩苷能夠調控炎性信號通路的表達來控制腦缺血再灌注引起的神經細胞損傷、抑制LPS 誘導的小鼠空腸炎癥損傷及人單核細胞炎癥反應［21-24］。為進一步探究黃芩苷減弱豬源ExPEC 致病性的機制，比較黃芩苷治療組和感染組的組織載菌量試驗以及組織病理切片。組織載菌量試驗結果顯示黃芩苷治療后，豬源ExPEC 在小鼠各組織中的定殖能力顯著減弱，病理切片結果顯示黃芩苷治療后，豬源ExPEC 在小鼠不同器官組織中產生的病理損傷顯著減弱，炎性病變顯著減弱，與之前的研究結果基本一致［12，21，22］。因此，黃芩苷對組織損傷的保護以及最終對小鼠的保護作用可能是黃芩苷影響了菌體在組織細胞中定殖能力，減弱了細菌的侵襲力。考慮到黃芩苷可通過抑制毒力基因的表達，減弱大腸桿菌的侵襲力［16］，推測黃芩苷可能通過抑制豬源的毒力因子從而減弱其致病性。結合黃芩苷在多種細菌中的抗炎作用［7，8，16］，推測黃芩苷可能是通過抑制相關炎性信號通路來降低豬源ExPEC感染后的炎癥反應，減輕組織細胞的損傷，從而達到對組織器官的保護作用，降低小鼠死亡率。

本研究初步證實黃芩苷對豬源ExPEC 的體內感染具有保護作用，黃芩苷抑制豬源ExPEC 致病性的具體機制還有待進一步研究。