基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及代謝產(chǎn)物分析白首烏對乙醇性肝損傷的作用機(jī)制

宋婉鈺 李勇 李春陽 馮進(jìn) 吳承東 馬永強(qiáng)

摘要：通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)闡述一年生、多年生白首烏代謝產(chǎn)物對乙醇性肝損傷的作用機(jī)制。使用液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析白首烏提取物的化學(xué)組成，通過PubChem數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)查找方法篩選出具有生物活性的成分，預(yù)測成分靶點(diǎn)、獲取疾病靶點(diǎn)并通過構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，篩選關(guān)鍵成分及核心靶點(diǎn)，最后對交集靶點(diǎn)進(jìn)行富集通路分析與分子對接及可視化處理。經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)，白首烏含有25種已認(rèn)證的生物活性因子，其在多年生白首烏中的含量顯著高于一年生白首烏（活性成分有20種）；一年生白首烏中含量顯著高于多年生白首烏（活性成分有5種），驗(yàn)證了白首烏主要活性成分中的多糖類、氨基酸類能與潛在作用靶點(diǎn)發(fā)生相互作用。最后得出，一年生白首烏中的成分是通過減少細(xì)胞色素活性及減輕炎癥反應(yīng)來抑制乙醇性肝損傷及相關(guān)疾病，多年生白首烏中的成分則是通過影響基因表達(dá)及能量代謝途徑來實(shí)現(xiàn)保護(hù)肝臟的功能。

關(guān)鍵詞：白首烏；代謝產(chǎn)物分析；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接；乙醇性肝損傷

中圖分類號：R285.5??文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??文章編號：1002-1302（2023）09-0166-09

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金［編號：CX（20）2006）］。

作者簡介：宋婉鈺（1996—），女，山東黃縣人，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：wanyu18545546152@126.com。

通信作者：李春陽，博士，研究員，研究方向?yàn)闋I養(yǎng)與活性功能。E-mail：lichunyang968@126.com。

白首烏（Cynanchum auriculatum Royle ex Wight）是蘿藦科鵝絨藤屬植物耳葉牛皮消的塊根，別稱隔山消、隔山撬、白人參、和平參、白木香、山花旗等，廣泛分布于華東、中南及河北、陜西、甘肅等地［1］。我國95%的白首烏產(chǎn)自江蘇濱海地區(qū)，2010年濱海白首烏獲得國家質(zhì)監(jiān)總局地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品認(rèn)證，并于2012年成為江蘇省地理標(biāo)志產(chǎn)品。

目前，有關(guān)一年生白首烏功效的報(bào)道較多，主要集中在抗腫瘤［2］、保肝護(hù)肝［3］與免疫調(diào)節(jié)［4］等方面，而關(guān)于多年生白首烏活性成分組成、含量及生物功能性差異等方面的研究則鮮見報(bào)道。本研究基于液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（liquid chromatography-time of flight mass spectrometry，LC-QTOF/MS）及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，對一年生白首烏與多年生白首烏提取物的活性組成、含量進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究，同時(shí)對兩者生物活性功能進(jìn)行比較及預(yù)測，以期為白首烏產(chǎn)品開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)提供有效的理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

白首烏由鹽城果老首烏科技有限公司提供。分析純乙醇（批號：20200319），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2?儀器與設(shè)備

LC-QTOF/MS高效液相色譜（安捷倫1260）串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（AB SCIEX TOF 5600+），購自安捷倫科技有限公司；FD-2A真空冷凍干燥機(jī)，購自北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；L3-5K臺式低速離心機(jī)，購自湖南可成儀器設(shè)備有限公司；RE52-A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自上海亞榮生化儀器廠。

1.3?試驗(yàn)方法

1.3.1?LC-QTOF/MS分析白首烏提取液?將一年生白首烏、多年生白首烏凍干后研磨成粉末。稱取相同質(zhì)量的白首烏粉末，以乙醇為溶劑，熱回流提取1.5 h，提取溫度為70 ℃，于4 500 r/min離心15 min并收集上清液。將白首烏殘?jiān)?jīng)過2次提取離心后，合并2次離心所得上清液，減壓濃縮至無醇味，冷藏靜置2 h，過濾，得到白首烏提取液。

1.3.1.1?LC-QTOF/MS條件?參考劉啟月等的方法［5］。色譜柱：XSelect HSS T3（4.6 mm×150.0 mm，3.5 μm）；正電離模式流動相A為0.1%甲酸/水，流動相B為乙腈；負(fù)電離模式流動相A為0.005 mol/L乙酸銨，流動相B為乙腈。質(zhì)譜條件：QTOF/MS全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍為50～1 000 質(zhì)荷比；正、負(fù)電離模式的源電壓分別為 5 500、4 500 V；簾氣、霧化器和加熱氣體的流動壓力分別為25、50、50 psi；正、負(fù)模式離子源電壓分別為30、-30 V。

1.3.1.2?LC-QTOF/MS數(shù)據(jù)處理?用MS-DI-AL軟件進(jìn)行相似性匹配來鑒定化合物。化合物鑒定后，采用RStudio進(jìn)行主成分分析，隨后通過Excel 2016的T TEST公式進(jìn)行計(jì)算，將表現(xiàn)為顯著（P<0.05）的數(shù)據(jù)采用TBtools進(jìn)行聚類分析。基于一年生、多年生白首烏差異代謝物，進(jìn)一步通過PubChem網(wǎng)站、類藥五原則（lipinski rules）［6］及相關(guān)參考文獻(xiàn)對差異代謝物進(jìn)行進(jìn)一步分析注釋，篩選出具有生物活性功能的差異代謝物。

1.3.2?成分靶點(diǎn)預(yù)測及疾病靶點(diǎn)篩選?從PubChem網(wǎng)站獲得各個(gè)成分的Smiles化學(xué)結(jié)構(gòu)式，首先將Smiles化學(xué)結(jié)構(gòu)式上傳到Swiss Target Prediction網(wǎng)站，選擇“Homo sapiens”作為研究物種，獲得該成分可能的靶點(diǎn)蛋白信息。同時(shí)將Smiles化學(xué)結(jié)構(gòu)式上傳到Similarity Ensemble Approach （SEA）網(wǎng)站，獲得預(yù)測靶點(diǎn)信息，再通過Excel篩選出“HUMAN”作為研究物種，得到可能的靶點(diǎn)信息。最后將2個(gè)數(shù)據(jù)庫得到的成分靶點(diǎn)蛋白信息進(jìn)行去重，整合取并集，分別得到一年生白首烏、多年生白首烏潛在的作用靶點(diǎn)。

在KEGG DISEASE網(wǎng)站上檢索乙醇性肝損傷，得到“Alcoholic liver disease”，再以“Alcoholic liver disease”為關(guān)鍵詞，分別在Therapeutic Target Database（TTD）、PharmGKB、Drugbank和Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，可得到與乙醇性肝損傷相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，對得到的靶點(diǎn)進(jìn)行去除假陽性、去重處理，得到與乙醇性肝損傷相關(guān)靶點(diǎn)的總和。

用Venny 2.1.0軟件繪制Venn圖，將成分與疾病的靶點(diǎn)蛋白相交，得到作為活性成分緩解抑制疾病的靶點(diǎn)。將活性成分與UniProt網(wǎng)站中獲取的靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2中繪制白首烏-成分-疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3.3?PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建?通過STRING 11.5數(shù)據(jù)庫，繪制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）。通過RStudio，將數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)以大于中位值作為關(guān)鍵靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選后，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2中，對目前的相互作用靶點(diǎn)進(jìn)行拓展，發(fā)現(xiàn)直接靶點(diǎn)與間接靶點(diǎn)之間產(chǎn)生的內(nèi)在聯(lián)系，進(jìn)而進(jìn)行全面考察，最終得到治療疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)及其對應(yīng)的活性成分。

1.3.4?富集分析?將活性成分的靶點(diǎn)蛋白通過DAVID數(shù)據(jù)庫中的“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”基因名進(jìn)行識別，以“Homo sapiens”為研究對象，得到GO、KEGG及WIKI數(shù)據(jù)；再利用Bioinformatics網(wǎng)站中的富集分析工具對靶點(diǎn)進(jìn)行信號通路分析。

1.3.5?成分-靶點(diǎn)分子對接驗(yàn)證?在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫中獲取靶點(diǎn)蛋白的3D結(jié)構(gòu)，在PyMOL 2.5.0軟件中進(jìn)行去除水分子、游離配體后，將其命名為受體文件；在PubChem數(shù)據(jù)庫中獲取小分子成分的3D結(jié)構(gòu)，通過Open Babel軟件進(jìn)行格式轉(zhuǎn)化，將其命名為配體文件。最后將受體蛋白、配體通過AutoDock 4進(jìn)行分子對接。以最低結(jié)合能為標(biāo)準(zhǔn)篩選可能的分子對接結(jié)構(gòu)，最后通過PyMOL 2.5.0軟件對對接結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2?結(jié)果與分析

2.1?代謝產(chǎn)物分析

對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA）與聚類分析。由圖1可以看出，一年生白首烏（OA）、多年生白首烏（OB）表現(xiàn)為明顯的離散型，表明兩者在成分組成、含量方面確實(shí)存在顯著差異。這可能是因?yàn)殡S著栽培年限的增加，白首烏次級代謝產(chǎn)物的種類、含量發(fā)生了顯著變化。

如圖1所示，一年生白首烏（a01、a02和a03）與多年生白首烏（b01、b02和b03）中含量存在顯著差異的成分有117種，其中烯丙基丁酮、檸檬酸及鳥氨酸等多種氨基酸成分在多年生白首烏中的含量顯著高于一年生白首烏中的含量，而煙酰胺、蔗糖及膽堿等成分在多年生白首烏中的含量卻顯著低于一年生白首烏中的含量（P<0.05）。

通過對117種存在含量差異的成分進(jìn)行Lipinski篩選，以相對分子量＜500、脂水分配系數(shù)＜5、氫鍵供體數(shù)＜5、氫鍵受體數(shù)＜10和旋轉(zhuǎn)鍵＜10為標(biāo)準(zhǔn)，找出了67種符合標(biāo)準(zhǔn)的成分，又根據(jù)在PubChem網(wǎng)站中的查找結(jié)果及參考大量文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)白首烏含有25種已認(rèn)證的生物活性因子，其中在多年生白首烏中含量顯著高于一年生白首烏的活性成分有20種，在一年生白首烏中含量顯著高于多年生白首烏的活性成分有5種。對各成分進(jìn)行功能注釋，并將結(jié)果匯總于表1，發(fā)現(xiàn)上述20種多年生白首烏成分主要具有緩解乙醇性肝損傷和抗腫瘤等功能，而一年生白首烏中的5種活性成分則主要表現(xiàn)為抗氧化及保肝護(hù)肝等功能。

2.2?成分靶點(diǎn)預(yù)測及疾病靶點(diǎn)篩選

將一年生白首烏中5種活性成分的Smiles化學(xué)結(jié)構(gòu)式上傳到Swiss Target Prediction網(wǎng)站和SEA網(wǎng)站，得到預(yù)測靶點(diǎn)，進(jìn)行去重整合后，得到189個(gè)作用靶點(diǎn)。從TTD、OMIM、PharmGKB及DrugBank這4個(gè)數(shù)據(jù)庫中搜索與乙醇性肝損傷相關(guān)的靶點(diǎn)，去除假陽性及去重后，得到583個(gè)疾病靶點(diǎn)，將一年生白首烏中的活性成分靶點(diǎn)和乙醇性肝損傷疾病靶點(diǎn)相交，得到11個(gè)相交靶點(diǎn)（圖2-A）。同時(shí)，對多年生白首烏中20種活性成分的701個(gè)作用靶點(diǎn)與乙醇性肝損傷疾病靶點(diǎn)相交，得到35個(gè)相交靶點(diǎn)（圖2-B）。將相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件后，得到白首烏-成分-疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。如圖2-C、圖2-D所示，在一年生白首烏中，間可他酮有5個(gè)靶點(diǎn)，煙酰胺有2個(gè)靶點(diǎn)，谷氨酸有3個(gè)靶點(diǎn)；在多年生白首烏中，腺苷、色氨酸各有10個(gè)靶點(diǎn)，海戈寧、酪氨酸各有9個(gè)靶點(diǎn)，丹皮酚有5個(gè)靶點(diǎn)，賴氨酸有4個(gè)靶點(diǎn)，焦谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、哌啶甲酸及對羥基苯甲酸甲酯分別有3個(gè)靶點(diǎn)，谷氨酰胺、天冬酰胺及剩余氨基酸分別有2個(gè)靶點(diǎn)。

2.3?PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將多年生白首烏及一年生白首烏與乙醇性肝損傷的共同靶點(diǎn)上傳至STRING 11.5數(shù)據(jù)庫中，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。將結(jié)果通過RStudio以大于中位值作為關(guān)鍵靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選后得到核心靶點(diǎn)。圖 3-A 為一年生白首烏成分干預(yù)下的乙醇性肝損傷靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，其中CYP3A4、REN、NR3C1及IL6為一年生白首烏成分緩解抑制乙醇性肝損傷的4個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。圖3-B中的NOS3、EGFR、REN、NT5E、CYP3A4、PPARA、MTOR、FASN、PPARG、NR3C1、 ALB及ADORA2A為多年生白首烏成分緩解抑制乙醇性肝損傷的12個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.4?富集分析

通過Bioinformatics網(wǎng)站中的富集分析工具對一年生白首烏、多年生白首烏干預(yù)乙醇性肝損傷的靶點(diǎn)基因進(jìn)行分析，得到如圖4、圖5的富集結(jié)果。如圖4所示，一年生白首烏預(yù)防乙醇性肝損傷的靶點(diǎn)參與了對脂多糖、氨基酸和糖皮質(zhì)激素等的反應(yīng)過程，這些靶點(diǎn)主要集中在蛋白復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞外液等部位，具有結(jié)合類固醇、細(xì)胞增殖、中性粒細(xì)胞介導(dǎo)免疫、精氨酸分解代謝、正向調(diào)節(jié)趨化因子的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)血壓等功能，靶點(diǎn)主要集中在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑通路、尿素循環(huán)及轉(zhuǎn)錄因子在脂肪形成中的調(diào)控等相關(guān)途徑。由圖5可知，多年生白首烏預(yù)防乙醇性肝損傷的靶點(diǎn)參與了對過氧化氫、維生素A、有機(jī)氮化合物及固定激素等反應(yīng)過程，這些靶點(diǎn)主要集中在等離子體膜、細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞外液等部位，具有結(jié)合蛋白、激活轉(zhuǎn)錄因子及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能，這些靶點(diǎn)主要富集在胰島素、脂肪細(xì)胞因子、AMPK、HIF-1、mTOR、cAMP、PI3K-Akt與ErbB等信號通路及淀粉、蔗糖和藥物等代謝途徑。

2.5?分子對接驗(yàn)證

在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖中，多年生白首烏的12個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)對應(yīng)的成分為腺苷、海戈寧、腺嘌呤、丹皮酚（2-羥基-4-甲氧基苯乙酮）及L-焦谷氨酸等，由于靶點(diǎn)蛋白是執(zhí)行功能的主要物質(zhì)，因此選擇EGFR、REN、NT5E、MTOR、FASN、NR3C1及ADORA2A對應(yīng)的成分進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。在一年生白首烏中選擇CYP3A4、IL6對應(yīng)的煙酰胺、間可他酮進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。如圖6所示，所選分子對接的能量均小于0，同時(shí)每個(gè)成分都結(jié)合在靶點(diǎn)蛋白的空腔內(nèi) 因此可以推測每個(gè)組分在細(xì)胞內(nèi)都可以與靶點(diǎn)自發(fā)結(jié)合形成靶點(diǎn)-配體二元復(fù)合物。

3?結(jié)論與討論

根據(jù)數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)果對差異成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測及比較，發(fā)現(xiàn)多年生白首烏對肝臟具有更好的保護(hù)作用。在多年生白首烏中，色氨酸、酪氨酸和賴氨酸等成分具有較多靶點(diǎn)，經(jīng)過關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選后，得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)對應(yīng)的成分為腺苷、海戈寧、腺嘌呤、丹皮酚及L-焦谷氨酸，表明這些成分在保護(hù)肝臟方面都具有一定作用，其中腺苷［7］、海戈寧［8］、腺嘌呤［9］、丹皮酚［10］及L-焦谷氨酸［11］起到了主要作用，而其他成分則通過促進(jìn)靶點(diǎn)與關(guān)鍵靶點(diǎn)的相互作用來保護(hù)肝臟。

有研究發(fā)現(xiàn)，一次性或長期大量飲用含有乙醇的飲品后，乙醇及其代謝物在人體內(nèi)代謝進(jìn)入肝臟，刺激各種細(xì)胞釋放出三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），被水解的一磷酸腺苷再用胞外CD73（5′-nucleotidase，NT5E）將其水解成腺苷，大量腺苷積聚后啟動免疫反應(yīng)，釋放出炎癥因子，使機(jī)體在短期內(nèi)形成乙醇性肝損傷，長期的炎癥因子刺激肝星狀細(xì)胞活化后分泌膠原，從而形成慢性乙醇性肝纖維化［12］。除循環(huán)腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）外，活化的肝星狀細(xì)胞高表達(dá)肝臟局部RAS能以不同分泌方式在肝細(xì)胞脂肪沉積、調(diào)節(jié)肝臟功能等方面發(fā)揮重要作用［13］，并且抑制CD73、CD39可以阻斷腺苷A2A（adenosine A2a receptor，ADORA2A）和腺苷A2B受體的激活及TGF-β/Smad3通路的形成，從而阻止星狀細(xì)胞的活化，緩解急性乙醇性肝損傷、慢性乙醇性肝纖維化。靶點(diǎn)表皮生長因子受體erbB1（epidermal growth factor receptor erbB1，EGFR）就是ATP-CD39-CD73信號通路和ATP代謝通路中緩解抑制乙醇性肝損傷的預(yù)防靶點(diǎn)［14］。長期大量攝入乙醇會過度激活肝細(xì)胞MTOR復(fù)合物1，表現(xiàn)為肝細(xì)胞蛋白磷酸化水平升高。依賴絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase，MTOR）相互作用蛋白的MTOR復(fù)合物1受到抑制時(shí)，會減弱由乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)積聚，阻止抑制脂肪酸氧化，對人類乙醇性脂肪變性、炎癥和肝損傷有潛在治療作用［15］。生脂基因激活、肝細(xì)胞中脂質(zhì)積聚是通過糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，NR3C1）的反式激活和N6-甲基腺苷去甲基化來減少脂質(zhì)積聚的，可以防止肝臟脂肪變性［16］。減少脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）含量及活性是預(yù)防乙醇性肝損傷及保護(hù)肝臟的關(guān)鍵［17］。因此，從NT5E、REN、ADORA2A、EGFR、MTOR、NR3C1以及FASN這些靶點(diǎn)的研究結(jié)果可以推測：多年生白首烏活性成分是通過影響基因表達(dá)及能量代謝途徑來達(dá)到保護(hù)肝臟的功能。

非乙醇性脂肪肝病和糖尿病與肝臟細(xì)胞色素P450 3A4（cytochrome P450 3A4，CYP3A4）活性降低有關(guān)，通過抑制CYP3A4酶含量對肝損傷具有保護(hù)作用［18］。植物提取物對肝臟有一定的保護(hù)作用，研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL6）就是通過減輕炎癥反應(yīng)來減少肝臟脂肪變性和肝細(xì)胞壞死的靶點(diǎn)之一，通過減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激可以保護(hù)肝臟，預(yù)防乙醇性肝損傷［19-20］。通過對CYP3A4、IL6這2個(gè)靶點(diǎn)的研究，推測一年生白首烏中的成分是通過減少細(xì)胞色素的活性及減輕炎癥反應(yīng)來抑制乙醇性肝損傷及相關(guān)疾病。分子對接的可視化結(jié)果顯示，通過分子之間的相互對接驗(yàn)證了上述靶點(diǎn)確實(shí)對乙醇性肝損傷起到了重要作用。

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