枳漆酶基因家族鑒定及其響應(yīng)鹽脅迫的表達分析

徐小勇 顧銘洲 梁夢鴿 姜麗娟

摘要：漆酶（LAC）是植物木質(zhì)素生物合成中催化木質(zhì)素單體聚合的關(guān)鍵酶，在調(diào)控植物生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。對枳漆酶基因家族進行鑒定和分析，并探究其在鹽脅迫下的表達模式，可為進一步研究枳漆酶基因功能提供重要的參考信息。采用生物信息學(xué)手段鑒定枳漆酶基因家族成員，對其家族成員的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化關(guān)系、啟動子順式作用元件等進行分析，并通過qRT-PCR方法分析其鹽脅迫表達模式。結(jié)果表明，枳基因組中共有20個LAC基因家族成員，其中18個分布在5條已知染色體上，2個分布在未知染色體上，被預(yù)測定位到細胞膜和細胞核中；共有6～14個外顯子，5～13個內(nèi)含子，9～11個motif；系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果顯示，20個枳LAC基因家族成員與17個擬南芥LAC基因家族成員共分成7個亞組，20個枳LAC基因家族成員分布在其中的6組；20個枳LAC基因家族成員與擬南芥LAC基因間存在19對共線性關(guān)系；啟動子區(qū)域含有24種順式作用元件，其中厭氧誘導(dǎo)元件、干旱響應(yīng)元件和茉莉酸甲酯響應(yīng)元件數(shù)量最多；16個枳LAC基因在鹽脅迫下顯著上調(diào)表達，推測枳漆酶基因參與了鹽脅迫響應(yīng)。

關(guān)鍵詞：枳；漆酶基因；進化樹；順式作用元件；鹽脅迫

中圖分類號：S188+.3??文獻標(biāo)志碼：A??文章編號：1002-1302（2023）09-0052-08

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2018YFD1000107）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金［編號：CX（21）3024］。

作者簡介：徐小勇（1979—），男，江西奉新人，博士，副教授，主要從事果樹生物技術(shù)研究。E-mail：xyxu@yzu.edu.cn。

漆酶（Laccase，LAC，EC 1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，屬于銅藍氧化酶家族，可催化酚類等多種底物的氧化，并將氧氣還原成水［1］。漆酶最早在1883年由日本學(xué)者Yoshida從漆樹的漆液中發(fā)現(xiàn)［2］，之后在細菌、真菌、昆蟲和其他植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)［3］。已有研究發(fā)現(xiàn)，漆酶參與植物細胞壁木質(zhì)素生物合成途徑的最后階段，即木質(zhì)素單體的聚合［4］。因此，漆酶在植物生長發(fā)育、生物和非生物脅迫響應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用［4］。

漆酶由多基因編碼，隨著眾多植物基因組數(shù)據(jù)的公布，不少物種已經(jīng)完成了漆酶基因家族的鑒定。例如，在模式植物擬南芥中，17個漆酶基因被鑒定出來，其中AtLAC4、AtLAC11和AtLAC17與木質(zhì)素合成有關(guān)［5-6］；在水稻（Oryza sativa）基因組中，共有30個LAC［7］；在柳枝稷草（Panicum virgatum）中共鑒定出49個LAC［8］；在梨（Pyrus bretschneideri）中共鑒定出40個LAC［9］；在茶樹（Camellia sinensis）中共鑒定出43個LAC［10］；在荔枝（Litchi chinensi）中共鑒定出61個LAC［11］；在桃（Prunus persica）、茄（Solanum melongena）中皆鑒定出48個LAC［12-13］。值得注意的是，漆酶基因在逆境脅迫中的作用正獲得越來越多的關(guān)注。一般而言，漆酶基因在脅迫下會富集表達，特別是在鹽脅迫條件下。例如，玉米ZmLAC1、擬南芥AtLAC2、水稻OsChI1和胡蘿卜DcLAC1在鹽脅迫下都顯著上調(diào)表達，而過表達漆酶基因能提高植物的耐鹽性［14-17］。

柑橘是世界第一大果樹，也是我國栽培面積最大、經(jīng)濟價值較高的果樹。然而柑橘以露地栽培為主且對環(huán)境條件要求較高，易受多種生物、非生物逆境脅迫的影響，極大程度地限制了我國柑橘產(chǎn)業(yè)的良性健康發(fā)展。因此，亟待開展柑橘抗逆基因挖掘與鑒定研究［18-21］。枳是蕓香科枳屬小喬木，具有抗寒、抗旱、適應(yīng)性強等優(yōu)點，是我國目前應(yīng)用最多、最廣的柑橘砧木。本研究根據(jù)已公布的枳基因組數(shù)據(jù)［22］，采用生物信息學(xué)手段鑒定枳漆酶基因家族成員，分析其理化特征、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化關(guān)系、啟動子順式作用元件和鹽脅迫表達模式，以期挖掘與鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)的漆酶基因，為枳LAC基因功能研究提供理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗時間與地點

本試驗于2022年3月在揚州大學(xué)園藝園林學(xué)院實驗室內(nèi)完成。

1.2?枳漆酶基因家族的鑒定

枳（Poncirus trifoliata L.）基因組序列、蛋白質(zhì)序列及其注釋信息均下載自CPBD數(shù)據(jù)庫（http：//citrus.hzau.edu.cn/）。從植物參考基因組數(shù)據(jù)庫Ensembl（http：//plants.ensembl.org）中下載擬南芥的基因組相關(guān)數(shù)據(jù)（基因組序列和注釋信息）。

以擬南芥的17個LAC蛋白序列作為查詢序列，設(shè)置檢索閾值（E-value）為10-5，通過TBtools軟件的BLAST功能搜索枳蛋白數(shù)據(jù)庫，獲得候選枳LAC蛋白序列，通過NCBI、SMART數(shù)據(jù)庫（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進行蛋白保守結(jié)構(gòu)域的鑒定。通過在線工具Expasy-ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）對枳LAC基因家族成員進行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測。使用在線軟件Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）對枳LAC蛋白家族進行亞細胞定位預(yù)測。

1.3?枳LAC基因家族基因結(jié)構(gòu)和motif 分析

通過在線工具MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）進行motif分析，motif數(shù)目設(shè)置為10個，其他均為默認值，利用TBtools軟件對基因結(jié)構(gòu)和motif數(shù)據(jù)進行可視化作圖。

1.4?枳和擬南芥LAC基因家族的系統(tǒng)進化樹分析

使用枳、擬南芥的LAC蛋白序列，用Mega X進行多序列比對，并用最大似然法（Maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap參數(shù)設(shè)置為1 000，其他參數(shù)選擇默認值。用Evolview在線軟件對系統(tǒng)發(fā)生樹進行編輯和美化。

1.5?枳和擬南芥LAC基因家族的共線性分析

用MCScanX 程序?qū)﹁住M南芥的基因組信息進行比對，并通過TBtools軟件的Multiple SystenyPlot工具分析其共線性關(guān)系。

1.6?枳LAC基因啟動子順式作用元件分析

選取枳LAC基因轉(zhuǎn)錄起點上游2 000 bp的序列作為啟動子區(qū)域，利用在線工具PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）獲得每個枳LAC基因啟動子區(qū)域中所有的順式作用元件，并篩選出重要的響應(yīng)元件，進行統(tǒng)計分析。

1.7?植物材料和鹽脅迫處理

選擇發(fā)育一致的45日齡枳幼苗，將幼苗在含有300 mmol/L氯化鈉的溶液中進行鹽脅迫處理，處理后0～5 d采收根系。所有樣本直接收集到液氮中，于-80 ℃保存，直至提取RNA。每個試驗設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)采5株幼苗樣品。

1.8?RNA提取和qRT-PCR檢測

采用乙二胺四乙酸（EDTA）法提取總RNA，用凝膠電泳和生物分析儀檢測RNA質(zhì)量，用TransScript逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa公司產(chǎn)品），具體操作參照制造商的說明書。qRT-PCR的基因特異性引物序列見表1。以2 μL cDNA為模板，用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ Plus （2×）（TaKaRa公司產(chǎn)品）進行25 μL PCR反應(yīng)，每個引物濃度為10 μmol/L。采用CFX96實時熒光定量PCR儀（BIO-RAD）進行qRT-PCR檢測，以柑橘β肌動蛋白基因（ACTB）為內(nèi)控基因。反應(yīng)過程如下：95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃延伸時間30 s，根據(jù)特定引物設(shè)置的退火溫度（T）下退火30 s，共40個循環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)束后，于65～95 ℃進行熔化曲線分析。所有qRT-PCR分析重復(fù)3次。采用2ΔΔCT法評估基因的表達水平。

2?結(jié)果與分析

2.1?LAC基因家族成員鑒定及其對應(yīng)蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測

通過BLAST和保守結(jié)構(gòu)域鑒定方法，共在枳基因組中發(fā)現(xiàn)20個LAC基因成員（表2），根據(jù)其在染色體的分布將其命名為PtrLAC1～PtrLAC20（圖1）。其中，PtrLAC1位于3號染色體上，PtrLAC2、PtrLAC3位于4號染色體上，PtrLAC4、PtrLAC5位于5號染色體上，PtrLAC6～PtrLAC13位于6號染色體上，PtrLAC14～PtrLAC18位于8號染色體上，PtrLAC19、PtrLAC20位于未知染色體上。枳LAC基因編碼的氨基酸長度介于553～1 112之間，相對分子量介于60.55～120.82之間，等電點介于5.02～9.88之間，親水性介于-0.247～0.000之間。此外，枳LAC蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)位于26.00～38.14范圍，都低于40.00，表明這20個LAC基因成員都是穩(wěn)定的。用在線軟件Plant-mPLoc進行亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示，所有枳LAC蛋白都位于細胞膜上，此外，發(fā)現(xiàn)PtrLAC7位于細胞核上。這揭示枳LAC蛋白可能參與細胞壁的木質(zhì)素合成。

2.2?枳PtrLAC基因結(jié)構(gòu)和motif分析

如圖2所示，枳LAC基因共有6～14個外顯子、5～13個內(nèi)含子。總體而言，基因之間的基因結(jié)構(gòu)差異較小，多數(shù)為6個外顯子、5個內(nèi)含子。基因結(jié)構(gòu)比較特殊的基因為PtrLAC7、PtrLAC13，有較多外顯子、內(nèi)含子。Motif分析發(fā)現(xiàn)，枳LAC蛋白含有 9～11個motif。除PtrLAC7、PtrLAC13外，所有枳LAC蛋白具有相同Motif。有趣的是，PtrLAC13缺失motif 2，而PtrLAC7相較于其他枳LAC基因家族成員多1個motif 8。

2.3?系統(tǒng)進化樹及共線性分析

為了探究枳PtrLAC基因與模式植物擬南芥的進化關(guān)系，構(gòu)建它們的系統(tǒng)進化樹（圖3）。根據(jù)進化樹的結(jié)果，將其分為7個亞組。PtrLAC10、PtrLAC11、PtrLAC12、PtrLAC14、PtrLAC15、PtrLAC16、PtrLAC19和PtrLAC20在第1組；PtrLAC3、PtrLAC6、PtrLAC13和PtrLAC17在第2組；PtrLAC1在第4組；PtrLAC7、PtrLAC8和PtrLAC9在第5組；PtrLAC4在第6組；PtrLAC2、PtrLAC5和PtrLAC18在第7組。上述結(jié)果表明，枳LAC基因家族可能存在功能多樣性。共線性分析結(jié)果顯示，枳和擬南芥LAC基因間存在19對共線性關(guān)系（圖4），暗示這些LAC基因?qū)赡軄碜怨餐淖嫦龋哂邢嗨频墓δ堋?/p>

2.4?啟動子區(qū)域順式作用元件分析

順式作用元件分析結(jié)果表明，枳LAC基因啟動子區(qū)域共有24種順式作用元件，包括生長發(fā)育元件、激素響應(yīng)元件和逆境響應(yīng)元件三大類型（圖5）。其中逆境響應(yīng)元件類型最多，共有11個。生長發(fā)育元件主要有分生組織特異性元件（CAT-box，70% LAC成員）和玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控元件（O2-site，35% LAC成員）。激素響應(yīng)元件主要有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（CGTCA-motif或TGACG-motif，90% LAC成員）、脫落酸響應(yīng)元件（ABRE，80% LAC成員）和生長素響應(yīng)元件（AuxRR-core，50% LAC成員），表明枳LAC基因可能受到多種激素的調(diào)控表達。逆境響應(yīng)元件主要有厭氧誘導(dǎo)元件（ARE，所有LAC成員）、干旱響應(yīng)元件（MBS，90% LAC成員）和低溫響應(yīng)元件（LTR，50% LAC成員），暗示枳LAC基因可能響應(yīng)多種逆境脅迫。

2.5?鹽脅迫處理對枳LAC基因表達的影響

已有研究發(fā)現(xiàn)，多種植物的LAC基因在鹽脅迫下誘導(dǎo)表達［14-17］。因此，本研究采用qRT-PCR方法分析所有枳LAC基因在鹽脅迫處理下的表達模式。如圖6所示，鹽脅迫處理使得80%的枳LAC基因在不同時間點顯著上調(diào)表達，其中多數(shù)集中在處理后第1天（PtrLAC3、PtrLAC5、PtrLAC6、PtrLAC10、PtrLAC11、PtrLAC13、PtrLAC15和PtrLAC18）和第5天（PtrLAC1、PtrLAC4、PtrLAC9、PtrLAC14和PtrLAC19），僅PtrLAC2、PtrLAC7、PtrLAC12、PtrLAC17的相對表達量出現(xiàn)下調(diào)。值得注意的是，PtrLAC9的相對表達量在處理5 d時急劇升高（約為初始值的47倍）。由此推測，PtrLAC9基因是鹽脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵LAC基因之一。

3?討論與結(jié)論

植物漆酶參與木質(zhì)素單體的聚合，從而影響木質(zhì)素合成和組分，在植物的生長和發(fā)育、應(yīng)答生物或非生物脅迫反應(yīng)中具有重要調(diào)控作用。迄今，尚未見關(guān)于枳漆酶基因家族的研究報道。本研究通過生物信息學(xué)方法在枳中共鑒定出20個LAC基因（PtrLAC1～PtrLAC20）。但對多數(shù)植物而言，枳LAC基因成員的數(shù)目較少［7-13］。枳LAC基因在染色體上的分布不均勻，較集中在第6號、8號染色體上，與甜橙LAC基因的染色體定位一致［23］；共有6～14個外顯子、9～11個motif，主要定位在細胞膜上，這些特征在不同物種之間的差異較大［7-13，23］。值得注意的是，PtrLAC7定位到細胞膜和細胞核上，且多1個motif 8，暗示該基因可能具有特殊功能。

在本研究中，枳LAC基因啟動子區(qū)域的順式作用元件分析結(jié)果顯示，其啟動子區(qū)域含有24種順式作用元件，包括生長發(fā)育元件、激素響應(yīng)元件和逆境響應(yīng)元件，暗示著枳LAC基因可能受到多種植物激素和環(huán)境逆境誘導(dǎo) 并參與植物生長發(fā)育過程調(diào)

控。對于不同植物而言，LAC基因啟動子區(qū)域的順式作用元件在數(shù)量、種類上具有一定差異，尤其是富集的順式作用元件種類［8，10，24］。例如，茶樹LAC基因主要富集厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯和乙烯響應(yīng)元件［10］；多數(shù)柳枝稷草LAC基因存在脫落酸響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件和干旱響應(yīng)元件［8］；枳LAC基因富含干旱響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件和茉莉酸甲酯響應(yīng)元件。但上述預(yù)測的順式作用元件有待通過試驗驗證。

系統(tǒng)進化樹分析將20個枳LAC基因家族成員與17個擬南芥LAC基因家族成員分成7個亞組，與前人的研究結(jié)果［9，23］一致。同一亞組的枳LAC基因與擬南芥LAC基因可能具有相同或相似的功能。考慮到AtLAC4、AtLAC11和AtLAC17與木質(zhì)素合成有關(guān)，筆者推測PtrLAC6和PtrLAC17（與AtLAC4聚類）、PtrLAC13（與AtLAC11聚類）及PtrLAC14和PtrLAC15（與AtLAC17聚類）參與枳木質(zhì)素生物合成。此外，AtLAC7、AtLAC8和AtLAC9這3個基因在缺鐵、創(chuàng)傷或鹽脅迫下上調(diào)表達［25］。因此，我們預(yù)測同一亞組下的PtrLAC7、PtrLAC8和PtrLAC9可能與脅迫響應(yīng)相關(guān)。本研究的qRT-PCR分析結(jié)果顯示，PtrLAC8、PtrLAC9在鹽脅迫下顯著上調(diào)表達，而PtrLAC7顯著下調(diào)表達，可見這3個基因確實與鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)，但它們是否參與枳鹽脅迫響應(yīng)調(diào)控尚不清楚。目前筆者所在本課題組正在進行PtrLAC9的功能鑒定研究，有望進一步揭示其功能。

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