流式微球技術高通量篩查中重度盆腔內異癥患者細胞因子譜的變化

俞麗娜,歐陽志斌,張 琳,蔣錦杏,齊 暉,任莉莉,鄧春艷△

(深圳市人民醫院/暨南大學第二臨床醫學院/南方科技大學第一附屬醫院:1.生物治療室;2.婦科,廣東 深圳 518020)

子宮內膜異位癥(內異癥)是指子宮內膜組織出現在子宮腔以外的部位,并不斷種植、生長引發的疾病,是引起育齡期婦女不孕及慢性盆腔疼痛的主要原因之一[1]。其雖是一種良性病變,但在生物學行為上卻具有增生、浸潤、復發、轉移等惡性特征,現有的激素和手術治療等手段均難以解決復發率高的問題,嚴重影響廣大女性身心健康[2]。內異癥的發病機制至今尚不明確,隨著基礎研究的不斷深入,免疫和炎癥因素在其發病中的作用越來越受到重視[3-4]。近年來,有研究表明,由免疫細胞分泌細胞因子導致腹腔內環境改變可能是內異癥發病的關鍵。內異癥患者血清、腹腔液、局部異位病灶中各種細胞免疫成分發生了功能性改變,導致免疫監視、防御功能缺陷,機體無法清除異位的子宮內膜,復雜的炎性反應生成大量的炎性細胞因子,促進異位內膜的侵襲和增殖,以及局部增生、粘連[5-6]。既往關于內異癥中細胞因子水平的文獻報道尚具有一些爭議,且局限于數量較少的某些特定細胞因子,較少對外周血和腹膜液細胞因子水平的相關性進行分析。因此,本研究采用流式熒光微球高通量篩查技術,同時檢查了包括γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、 IL-10、IL-12p70、IL-17A、IL-17F、IL-22、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、TNF-β等14種細胞因子水平在中重度內異癥婦女外周血和腹腔液中的水平,觀察了內異癥患者循環和局部細胞因子譜的改變及各因子之間的相關性,以有助于進一步闡明內異癥的免疫發病機制,旨在為疾病預防、早期診斷和治療提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選取2019年3月至2021年10月本院婦科收治的內異癥患者28例作為內異癥組,年齡24～48歲,月經規律,月經周期28～32 d,無其他內外科合并疾病,術前3個月內未服用激素類藥物;經術中腹腔鏡檢查及病理檢測確診,按美國生育學會分期法[7]為Ⅲ～Ⅳ期盆腔內異癥。選擇同期在本院進行健康體檢女性30例作為對照組,年齡26～49歲。2組研究對象年齡、體重指數(BMI)等一般資料比較,差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。見表1。本研究已獲本院倫理委員會審批,2組研究對象均簽署本研究知情同意書。

表1 2組研究對象一般資料比較

1.1.2儀器與試劑 IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IL-17F、IL-22、TNFα、TNFβ流式免疫熒光發光法檢測試劑均由天津曠博同生生物技術有限公司提供,流式細胞儀購自常州必達科生物科技有限公司(型號BeamCyte-1026)。

1.2方法

1.2.1標本采集 2組研究對象均于末次月經結束后7 d內留取標本。采集2組研究對象體檢時、術前1 d用乙二胺四乙酸抗凝的空腹靜脈血2 mL,3 000 r/min離心10 min分離血漿,-80 ℃冰箱保存備用。內異癥組患者于腹腔鏡手術開始時經穿刺針或注射器吸取子宮膀胱陷凹和直腸子宮陷凹腹腔液,置于無菌管內,以3 000 r/min離心10 min取上清液-80 ℃保存備用,有血液污染者棄置不用。28例內異癥患者中留取腹腔原液標本18例。

1.2.2細胞因子檢測 采用高通量細胞因子檢測實驗試劑盒利用液相芯片與雙抗夾心相結合的原理。采用兩種不同尺寸(4、5μm)、14種不同熒光強度的微球群上分別包被IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IL-17F、IL-22、TNFα、TNFβ特異性抗體(捕獲微球),可與樣本中相應的細胞因子特異性結合,加入生物素標記的檢測抗體,形成抗體捕獲微球-細胞因子-檢測抗體的免疫復合物;之后加入藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)標記的鏈霉親和素,在流式細胞儀上檢測相應熒光,通過免疫復合物的熒光強度得到待測樣本中相應細胞因子含量,采用FCAP Array V3軟件(美國BD公司)進行標準曲線繪制和分析。

2 結 果

2.12組研究對象血漿細胞因子水平比較 與對照組比較,內異癥組患者血漿IL-1β、IL-2水平明顯降低,IL-4、IL-6、IL-8、IL-17A、TNF-α、TNF-β水平,以及IL-17A/IL-10、IL-17F/IL-10比值均明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.05);2組研究對象血漿IFN-γ、IL-5、IL-10、IL-12p70、IL-17F、IL-22,以及IFN-γ/IL-4、IL-22/IL-10比值比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2、3。采用PCA方法對數據進行降維及可視化處理后可見2組研究對象血漿細胞因子譜清晰可分。見圖1。

圖1 2組研究對象血漿14種細胞因子PCA分數圖

表2 2組研究對象血漿細胞因子水平比較(pg/mL)

表3 2組研究對象血漿部分細胞因子比值比較[M(P25,P75)]

2.2內異癥患者血漿細胞因子相關性 內異癥患者血漿IL-4與IL-17A、IL-22與IL-17F、TNF-β與IL-1β分別呈正相關(r=0.623、0.473、0.429,P<0.001、0.011、0.023);對照組研究對象血漿IFN-γ與IL-2、IL-4分別呈正、負相關(r=0.467、-0.416,P=0.009、0.022),IL-6與IL-22、TNF-α均呈正相關(r=0.555、0.417,P=0.001、0.022),IL-17F與IL-12p70、IL-22、TNF-α均呈正相關(r=0.488、0.600、0.438,P=0.006、<0.001、0.016),IL-22與IL-12p70、IL-17F、TNF-α均呈正相關(r=0.447、0.600、0.725,P=0.013、<0.001、<0.001)。

2.3內異癥患者腹腔液細胞因子水平 腹腔液細胞因子水平見表4。內異癥患者腹腔液IL-5與IL-1β、IL-22均呈正相關(r=0.478、0.502,P=0.045、0.034),IL-6與IFN-γ、IL-4、IL-8均呈正相關(r=0.553、0.559、0.523,P=0.017、0.016、0.026),IL-12p70與IL-10呈負相關(r=-0.507,P=0.032),IL-17A與IL-10呈正相關(r=0.548,P=0.019),IL-17F與IFN-γ呈正相關(r=0.591,P=0.010)。

表4 內異癥患者腹腔液細胞因子水平(pg/mL,n=18)

2.4內異癥患者腹腔液與血漿細胞因子的相關性 腹腔液IFN-γ與血漿IFN-γ、IL-17F均呈正相關(r=0.607、0.594,P=0.008、0.010),腹腔液IL-8與血漿IL-8、TNF-α均呈正相關(r=0.820,P<0.001),腹腔液IL-10與血漿TNF-α呈正相關(r=0.635,P=0.005),腹腔液IL-12p70與血漿IFN-γ呈正相關(r=0.517,P=0.028),腹腔液IL-17A與血漿TNF-α呈正相關(r=0.678,P=0.002),腹腔液IL-17F與血漿IFN-γ、TNF-β均呈正相關(r=0.490、0.525,P=0.039、0.025),腹腔液TNF-α與血漿TNF-α呈正相關(r=0.765,P<0.001),腹腔液TNF-β與血漿IL-Iβ、TNF-β均呈正相關(r=0.506、0.725,P=0.032、0.001),腹腔液IL-2與血漿IL-17A呈負相關(r=-0.498,P=0.035)。

3 討 論

越來越多的證據表明,在內異癥的發生、發展過程中多種免疫細胞功能發生紊亂,循環或局部相關細胞因子水平也出現異常[8]。本研究選取健康體檢女性作為對照,采用流式高通量檢測技術同時檢測中重度內異癥患者血漿和腹腔液樣本中14種細胞因子水平,以評價細胞因子譜改變在內異癥發病中的重要性。2組研究對象年齡比較,差異無統計學意義(P>0.05),排除了年齡因素對體內細胞因子水平的可能影響;2組研究對象BMI比較,差異接近統計學意義(P=0.054),內異癥組患者BMI顯示出與既往研究[9]一致的降低趨勢。

從免疫學的觀點來看,內異癥不僅是一種炎癥性疾病,而是一種促炎和抗炎狀態相結合的疾病[10]。既往研究提示,內異癥患者血清、腹膜液和異位病變中存在異常的免疫和炎性反應,促炎性細胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL- 17A等)和抗炎性細胞因子(IL-10、IL-4等)水平均可升高[5,11],但也有一些研究提示,某些因子水平出現降低或無變化[12-13]。本研究結果顯示了細胞因子水平變化的復雜性,患者血漿促炎性細胞因子——TNF-α、IL-6、TNF-β和抗炎性細胞因子——IL-4均明顯升高,巨噬細胞相關細胞因子——IL-8和輔助性T淋巴細胞17(Th17)分泌的細胞因子——IL-17A也增加,但IL-1β、IFN-γ、IL-10卻沒有增加。研究結果的不一致性和復雜性可能與疾病分期、樣本量、檢測方法、采樣時間點等因素有一定的關系,但更可能與細胞因子之間相互調節的反饋機制有關。細胞因子通過自分泌、旁分泌和內分泌進行近距離和遠距離的通訊,形成一個復雜的對免疫細胞的作用網絡。這種相互作用網絡模式提示,對內異癥患者體內循環或局部細胞因子水平進行分析時將單個細胞因子水平變化孤立分析的方法具有一定的局限性,全面的細胞因子譜及相關性分析可能更有意義。本研究運用了PCA分析方法對來源于2組研究對象血漿的14種細胞因子數據進行了降維及可視化處理,從PCA分數圖可見,2組研究對象數據清晰可分,顯示了不一樣的細胞因子譜。今后在擴大樣本量和對照數據的基礎上有望通過結合PCA、聚類分析等統計學方法建立較好的細胞因子譜診斷模型。

本研究分別對2組研究對象血漿14種因子之間的兩兩相關性進行了分析,結果顯示,對照組研究對象血漿多對細胞因子間出現不同程度的相關性,內異癥組患者只有TNF β與IL-1β、IL-4與IL-17A、IL-22與IL-17F之間存在一定的相關性,提示健康者細胞因子網絡調控能通過相互調節更好地維持平衡,而內異癥患者體內免疫平衡被打破,更進一步證實了免疫紊亂在疾病進程中的作用。

據文獻報道,在內異癥中包括Th1、Th2、Th17和調節性T淋巴細胞(Treg)等在內的多種T淋巴細胞亞群均發生了數量或功能改變[14-15]。但既往的研究數據也出現了不一致的情況。如GOGACZ等[16]研究表明,內異癥患者腹腔液和血液Th17水平均升高,并與嚴重程度相關;KHAN等[17]卻發現,腹腔液Treg增多,腹腔液和外周血Th17比例相對降低;ANDREOLI等[18]和TAROKH等[5]則認為,IL-17水平高低與內異癥無關,但內異癥患者腹腔液和血清IL-17/IL-10、IL-17/IL-23比值均升高。相互沖突的結果提示,在尋找疾病的臨床免疫學機制時單一研究某一種T淋巴細胞可能很難解釋復雜的免疫現象,探討T淋巴細胞亞群相互之間的影響和調控也許更為重要。

已有研究表明,當Th1 和Th2 之間的平衡被打破并出現Th2 偏移時機體處于免疫抑制狀態,可加速內異癥患者病情進展[4,19]。本研究結果顯示,內異癥患者血漿IFN-γ/IL-4比值與對照組比較,雖然沒有統計學意義,但有降低的趨勢,符合內異癥Th1/Th2失衡的炎癥基礎。據文獻報道,內異癥患者腹腔液Th17比例增加,導致IL-17表達增加,促進慢性炎癥[20]。正常情況下機體Th17和Treg也存在平衡,當這一平衡被打破時可引起一系列免疫反應,引發相應疾病。目前,已有研究證實,腫瘤、自身免疫疾病、炎癥、感染等均與Th17/Treg失衡有關[21],對內異癥的發生、發展也具有重要影響[5,17,19]。本研究結果顯示,內異癥組患者血清IL-17A水平增加,且IL-17A/IL-10、IL-17F/IL-10比值均較對照組升高,是Th17與Treg比例失衡的必然結果。TAROKH等[5]指出,在內異癥患者的每個月經周期中T淋巴細胞亞群(Th17、Th1、Th2、Treg等)均在增加和抑制炎癥的免疫平衡調控中發揮作用。早期由于缺乏足夠的防御機制,Th17在先天免疫信號的作用下引發局部炎性反應,繼而產生Th1反應;隨后在激素發生變化后Th2可能成為主導細胞,并改變平衡,向激活Treg和組織修復方向發展。這種情況在每個月經周期中重復出現,數年后出現局部組織纖維化、嚴重的器官附著和內異癥[5]。

另一方面,在本研究選取的Ⅲ、Ⅳ期病例中多個腹腔液細胞因子水平之間,以及腹腔液與血漿中某些細胞因子之間均存在一定的相關性,尤其是IFN-γ、IL-8、TNF-α、TNF-β在腹腔液與血液中的水平具有各自對應的正相關性,更進一步證實了細胞因子網絡在循環和局部微環境中作用的復雜特點及這些細胞因子在疾病背景下的合作。

綜上所述,通過應用流式熒光微球高通量篩查技術證實了中重度內異癥患者循環和局部細胞因子譜的改變及各因子之間的相關性,將有助于從免疫應答整體的相互作用及整個細胞因子網絡水平探討內異癥的免疫發病機制,為疾病預防、早期診斷和治療提供新的依據。