LY294002對類脂A誘導的人冠狀動脈內皮細胞縫隙連接蛋白43表達的影響

孔海全,李明遠,巫相宏△

(1.廣西醫科大學第一附屬醫院心血管內科,廣西 南寧 530000;2.右江民族醫學院附屬醫院心血管內科,廣西 百色 533000)

動脈粥樣硬化(AS)是一種慢性炎癥性疾病,炎癥的促進和緩解機制的平衡決定了最終的臨床結果[1]。縫隙連接蛋白43(Cx43)主要分布于內皮細胞及心肌細胞中,Cx43介導的縫隙連接通訊對心血管系統的發育和正常功能具有重要作用[2]。脂多糖發揮作用的主要活性成分是類脂A(KLA),脂多糖可激活并損傷內皮細胞,引起內皮細胞功能障礙,從而導致AS[3]。已有研究證實了脂多糖可促進大鼠血管組織和血管內皮細胞Cx43表達升高[4]。LY294002是一種人工合成的ClassⅠ磷酸肌醇3激酶(PI3K)特異性抑制劑,可通過競爭性拮抗ClassⅠ PI3K中P110催化亞基和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的結合使PI3K失去活性而阻斷PI3K信號通路的活化[5]。已有研究表明,LY294002具有抵抗腫瘤細胞惡性生長同時抑制腫瘤血管生成[6]、減少細胞炎癥因子的產生[7]等作用。本研究觀察了PI3K通路特異性抑制劑——LY294002對KLA刺激的人冠狀動脈內皮細胞(HCAEC)Toll樣受體 4(TLR4)、PI3K和Cx43蛋白及mRNA表達的影響,探討了LY2940002通過抑制TLR4/PI3K信號通路對KLA誘導內皮細胞炎性損傷反應的影響,旨在為預防AS提供新思路和方法。

1 材料與方法

1.1材料 HCAEC細胞株、內皮細胞培養基(ECM)均購自美國Sciencell公司,LY294002購自美國CST公司,TLR4激動劑——KLA購自美國Avanti Polar Lipids公司,CCK8法試劑盒購自中國美侖公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 原代HCAEC為中國 Procell普諾賽公司產品(貨號CP H087),通過廣西卓一代理商購買。細胞培養基成分為100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素、10%胎牛血清和100 U/mL內皮細胞生長添加劑。細胞培養環境保持在37 ℃、5%二氧化碳條件下,1～3 d換液1次,待細胞密度至80%以上即可傳代,選取同代細胞進行實驗。

1.2.2CCK8法檢測細胞活力

1.2.2.1檢測KLA對HCAEC活力的影響 根據加入KLA的不同質量濃度分為5組,即0、0.01、0.05、0.10、0.20 mg/L組,每個質量濃度設5個復孔。分別在培養孔中加入細胞培養基和相應質量濃度的KLA,置于37 ℃、5%二氧化碳培養箱中24 h,然后終止培養,每孔加入10 μL CCK8溶液,在培養箱中培養4 h,使用酶標儀讀取吸光度(A)值。

1.2.2.2檢測LY294002對HCAEC活力的影響 采用與1.2.2.1項同樣的方法檢測0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L LY294002對HCAEC活力的影響。為防止不同代數細胞活力的誤差,使用同一代數HCAEC進行實驗。根據細胞活力確定后續KLA和LY294002的最適實驗質量濃度。

1.2.3分組及干預 將HCAEC分為以下4組進行后續Western Blot實驗,每項實驗均獨立重復3次以上。(1)空白對照組(Con組)不進行其他任何處理,使用基礎培養基正常培養 HCAEC 24 h。(2)TLR4激動組(KLA組)使用含 KLA的基礎培養基培養 HCAEC 24 h。(3)PI3K抑制組(LY組)使用含LY294002的基礎培養基培養HCAEC 24 h。(4)KLA+LY組先加入LY294002預處理4 h后加入KLA培養HCAEC 24 h。

1.2.4Western Blot法檢測HCAEC TLR4、PI3K、Cx43 蛋白表達 將細胞裂解液加入細胞中并在冰上裂解細胞10 min,離心后收集上清液;采用BCA法測定蛋白表達水平。每孔40 μg蛋白,在聚丙烯酰胺凝膠電泳處理后轉膜,封閉,加入一抗孵育過夜,第2天加入二抗,孵育1 h 后進行顯影處理,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參,使用Odyssey雙色紅外激光成像系統掃描,以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH校正后的灰度值比值作為其相對表達水平。

2 結 果

2.1不同質量濃度KLA、LY294002 HCAEC存活率比較 0.01、0.05 mg/L KLA HCAEC存活率[分別為(99.30±2.54)%、(97.06±2.96)%]與0 mg/L[(100.02±1.79)%]比較,差異均無統計學意義(t=0.524、1.918,P=0.614、0.091);0.10、0.20 mg/L KLA HCAEC存活率[分別為(88.04±3.07)%、(67.98±3.57)%]均明顯低于0 mg/L,差異均有統計學意義(t=7.529、17.950,P均<0.001)。最終選擇 KLA 0.05 mg/L作為對 HCAEC炎性刺激的工作質量濃度。2.5 μmol/L LY294002 HCAEC存活率[(100.16±1.73)%]與0 μmol/L[(100.52±2.17)%]比較,差異均無統計學意義(t=0.284,P=0.784);5.0、10.0、20.0 μmol/L LY294002 HCAEC存活率[分別為(80.85±1.74)%、(70.92±2.09)%、(49.18±1.76)%]均明顯低于0 μmol/L,差異均有統計學意義(t=15.820、21.989、41.112,P均<0.001)。最終選擇2.5 μmol/L作為后續實驗的處理質量濃度。不同質量濃度KLA、LY294002對HCAEC活力的影響見圖1。

注:與0 mg/L KLA、0 μmol/L LY294002比較,aP<0.05。

2.2各組HCAEC TLR4、PI3K、Cx43 蛋白表達水平比較 KLA組HCAEC TLR4、PI3K、Cx43蛋白表達水平均明顯高于Con組,KLA+LY組HCAEC TLR4、PI3K、Cx43蛋白表達水平明顯低于KLA組,LY組HCAEC PI3K蛋白表達水平明顯低于Con組,差異均有統計學意義(P<0.05)。LY組HCAEC TLR4、Cx43蛋白表達水平與Con組比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1,圖2、3。

注:與Con組比較,aP<0.05 ;與 KLA 組比較,bP<0.05。

圖3 各組HCAEC TLR4、PI3K、Cx43蛋白表達水平比較

表1 各組HCAEC TLR4、PI3K、Cx43蛋白表達水平比較

3 討 論

近年來,AS逐漸被認為是脂質驅動的、慢性、低級別的動脈壁炎癥性疾病[8],抗炎越來越被認為是進一步降低AS性心血管疾病殘余風險的有吸引力的策略。TLR4信號通路可通過多途徑參與AS的進程,并參與一系列與AS相關的細胞因子、炎癥因子的合成與釋放等環節[9]。LI等[10]發現,Corilagin可通過抑制單核/巨噬細胞TLR4信號通路,減少促炎性細胞因子的釋放,改善AS斑塊的發展。WAHID等[11]發現,TLR4是炎性反應的關鍵上游調節因子,可驅動子宮激活和控制分娩時機,干預TLR4信號可能對有早產風險或足月后妊娠的婦女有治療作用。有研究發現,TLR4激動劑可通過Cx43半通道在巨噬細胞中觸發ATP的釋放,從而影響膿毒癥患者的預后[12]。另外有研究表明,TLR4通路激活后Cx43表達明顯增加,且呈劑量和時間依賴性[13]。本研究結果顯示,使用KLA刺激HCAEC后可激活其TLR4信號通路;而且KLA至少部分通過激活TLR4相關的PI3K通路上調Cx43的表達,與既往研究結果相似。

PI3K信號通路的激活可使細胞產生大量的炎性細胞因子,在機體炎性反應和AS的發展與消退中發揮著重要作用[14]。有研究表明,抑制PI3K、蛋白激酶B (Akt)、腫瘤壞死因子-α mRNA表達對高脂飲食喂養的ApoE基因敲除小鼠具有抗AS的作用[15]。EISENREICH等[16]發現,使用PI3K抑制劑抑制PI3K信號通路的傳導可抑制AS的形成,減少斑塊面積[17]。既往研究表明,PI3K/Akt信號通路參與了高果糖飼料誘導AS的發生、發展[18]。表明似乎抑制PI3K信號通路對抑制AS具有積極的作用。本研究結果顯示,PI3K抑制劑——LY294002能明顯抑制KLA誘導的TLR4、PI3K、Cx43的表達,但并不影響正常狀態下HCAEC TLR4、Cx43的表達,這一發現可能為將來LY294002的使用范圍提供方向。

Cx43的表達調控了內皮細胞的增殖、遷移和血管生成,抑制Cx43可降低細胞增殖和血管生成[19]。有研究發現,AS的冠心病患者Cx43、Cx46的表達均顯著上調[20]。有學者發現,小鼠Cx43的普遍減少對AS病變的進展和組成具有有益作用[21]。有研究表明,銀杏通過抑制Cx43的表達抑制AS進展[22]。有研究發現,腫瘤壞死因子-α通過下調Cx43誘導平滑肌細胞凋亡,促進AS斑塊的穩定。既往研究表明,降低Cx43可通過減少炎性反應和減少平滑肌細胞遷移和增殖限制急性血管損傷后新內膜的形成[23],血管緊張素Ⅱ上調Cx43促進人肺動脈平滑肌細胞的增殖和遷移[24],無翅型MMTV整合位點家族成員3A(Wnt3a)促進血管平滑肌細胞的收縮和分泌表型與Cx43的表達增加有關[25]。由此看來,Cx43在平滑肌細胞中似乎發揮著重要的作用。在AS易感的低密度脂蛋白受體缺陷小鼠中Cx43表達的整體降低可減慢AS斑塊形成的進程[25]。既往研究表明,下調Cx43表達可顯著降低單核細胞-內皮細胞黏附[26],而單核細胞-內皮黏附是AS發展的關鍵因素之一。另一方面值得注意的是,表達Cx43的不同細胞類型(平滑肌細胞、內皮細胞等)在AS發生中的確切作用仍有待于證實,但似乎減少血管Cx43表達的策略可能對AS具有保護作用[27]。提示下調Cx43似乎是抑制AS的重要途徑之一。本研究結果顯示,LY294002可抑制由KLA誘導的HCAEC Cx43高表達,表明LY294002在治療AS方面也許具有不小的潛力。

總之,使用LY294002可抑制由KLA誘導的HCAEC Cx43高表達,其機制至少部分與抑制TLR4/PI3K信號通路有關,為此 LY294002很可能成為治療AS的一個重要藥物,可能為治療AS提供新的方案和策略。