丙硫唑對不同植物病原菌的活性及降毒素作用研究

徐文昌,朱敏杰

(四川省簡陽市植保植檢站,四川 簡陽 641400)

殺菌劑在整個植物病害防控中扮演著重要的角色,作用迅速且高效穩定,殺菌劑的生產和使用量占比在逐年加大[1]。近年來殺菌劑新品種的開發取得很大進展,如三唑類、酰胺類、嘧啶胺類、甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑等,其特點是不僅活性高、作用機理獨特、對環境友好[2-3]。但隨著殺菌劑應用比例的增長,植物病原菌的抗藥性也逐漸增強,因此仍需持續開發研究新的殺菌劑種類。丙硫唑(Albendazole)又名丙硫咪唑、丙硫多菌靈,化學名稱為5-丙硫基-1-H-苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯,是苯并咪唑(Benzimidazole)類的衍生化合,結構如圖1所示。丙硫唑最早由Gyuri和Theodorides合成,并于1977年由美國Smith Kline公司研制成功并上市,該藥在臨床上被廣泛用于治療蠕蟲感染導致的疾病菌,對人體及動物寄生蟲如線蟲、吸蟲、絳蟲等均有很強的驅殺作用[4]。作為殺菌劑防治植物病害方面少有報道,并多以其他殺菌劑復配的形式使用。

圖1 丙硫唑的結構式

小麥赤霉病主要是由禾谷鐮刀菌(FusariumgraminearumSchw)引起的一種真菌性病害,在生產中造成小麥產量和品質的顯著降低[5]。小麥受到赤霉菌侵染后,病菌會迅速在穗部擴展,在籽粒灌漿成熟過程中不斷繁殖生長并在籽粒中產生多種毒素[6],包括雪腐鐮孢菌烯醇(NIV)化學型、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)與15-乙酰脫氧雪腐鐮孢菌烯醇(15-ADON)化學型等,對小麥生產和人畜健康構成嚴重威脅[7]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)是已知的單端孢霉烯族化合物中毒性最強的一種,可引起人和動物的嘔吐、腹瀉、頭暈等的中毒癥狀,嚴重時可損害造血系統而導致死亡[8]。此外,DON具有細胞毒性、免疫毒性、遺傳毒性及致疇性和致癌性等,具有致癌、致畸和致突變作用[9-10]。目前尚未有報道丙硫唑影響小麥赤霉病菌產毒素量相關研究。毒素的檢測方法有理化檢測法、免疫化學測定法,現已建立了薄層色譜(Thin layer chromatography,TCL)、氣相色譜(Gas chromatography,GC)、高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)等方法[11-12]。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

FgNIV：產NIV毒素的禾谷鐮孢菌(F.Graminearum)、Fg15ADON：產15AD毒素的禾谷鐮孢菌(F.graminearum)、草莓灰霉病菌(Botrytiscinerea)、蘋果黑斑病菌(Alternariaalternata)、黃瓜褐斑病菌(Corynesporacassiicola)、葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、蘋果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、草坪枯萎病菌(Rhizoctoniasolani)、梨樹黑星病菌(Venturiapirina)、馬鈴薯早疫病菌(Alternariasolani)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobromae)、葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)、小新殼梭孢菌(Neofusicoccumparvum)、以上15種病原菌由四川農業大學無公害農藥研究實驗室提供。

1.2 供試殺菌劑

98%丙硫唑原藥、10%丙硫唑懸浮劑、75%三環唑可濕粉劑由貴州道元生物技術有限公司提供。

1.3 丙硫唑對14種不同植物病原菌的室內毒力測定

采用菌絲生長速率法[13],以丙硫唑原藥作為藥劑處理組,將直徑為5mm的供試菌分別接種于含10個濃度梯度(0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL)的平皿中央,28℃恒溫培養,待對照平板上菌落長到培養皿2/3左右,十字交叉法測定菌落直徑(mm)計算抑制率,根據抑制率,按機率值分析法,并通過軟件計算菌絲生長的EC50值。

1.4 10%丙硫唑懸浮劑對香蕉葉斑病田間防效測定

試驗設3個處理：每667m2施用10%丙硫唑懸浮劑1500倍(A1),1000倍(A2)、500倍(A3)和對照藥劑250g/L戊唑醇水乳劑1250倍(B)及清水對照(CK),每個處理3個重復,隨機排列。除試驗設計外,各處理區其他管理方式一致。施藥前調查紋枯病的發病基數;分別施藥3次并在末次施藥的后20 d調查香蕉葉斑病發生情況,采用隨機5點取樣法,每個點5株苗選取中間3株,每株掛牌標記調查所有葉片的葉斑。各取樣點檢查每張葉片上所有病斑所占整張葉片的面積,按病斑面積比例分級記錄,統計小區調查總葉片數和病級值,計算病情指數及防治效果。

香蕉葉斑病病情分級標準：0級：葉片無病斑;1級：葉片病斑面積占全葉片5%以下;3級：葉片病斑面積占全葉片6%～15%;5級：葉片病斑面積占全葉片16%～25%;7級：葉片斑面積占全葉片26%～50%;9級：葉片病斑面積占全葉片50%以上。

相對防治效率=

1.5 丙硫唑對小麥赤霉病菌毒素產生的影響

1.5.1 樣品的制備 在250mL三角瓶中加入100mLGYEP培養基,每瓶接種5×104個孢子,然后于28℃,黑暗條件下,在200 rpm的搖床上培養,24h后加入相應劑量的藥劑,每個菌株進行4個處理,分別為：不加藥劑的空白處理、加入EC20濃度的藥劑處理以及加入EC50濃度的藥劑處理,每處理3次重復。繼續搖培7 d后,培養物用尼龍布及濾紙過濾,得菌絲與濾液,菌絲烘干稱重,濾液量得總體積并記錄。取30mL濾液用等體積乙酸乙酯萃取2次,合并有機相后減壓蒸餾干燥,用1mL乙腈溶解,轉移到新離心管,待測。

1.5.2 樣品檢測 高效液相色譜分離的條件為：色譜柱為Shim-pack GIST(5μm C18,4.6×250mm);柱溫25 °C;進樣量5μL;流速0.8mL/min：檢測波長218 nm：流動相：A為超純水,B為乙腈,采用線性梯度洗脫：0～10min,A相為85%;10～22min,A相降為75%;22～30min,22～30min,A相升至85%。采用以上色譜條件對樣品進行定性定量分析。平衡色譜柱,單次樣品運行時間30min。采用以上色譜條件對樣品進行定性定量分析。

液體培養基GYEP中的菌絲產量通過干菌絲稱量獲得。液體搖培條件下,菌株產毒素能力用單位干菌絲量的總毒素產生量來衡量,單位為μg/mL。

1.6 數據處理

采用Excel和SPSS等軟件處理數據。

2 結果與分析

2.1 丙硫唑對14種不同植物病原菌的室內毒力測定

通過丙硫唑對14種不同植物病原菌的室內毒力測定見表1,結果表明丙硫唑對14種植物病原菌均有一定的抑菌作用,其中對馬鈴薯早疫病菌、可可毛色二孢菌、小新殼梭孢菌、葡萄座腔菌有顯著的抑菌作用,其EC50分別為6.1976μg/mL、6.5518μg/mL、15.4846μg/mL、20.3559μg/mL。

表1 丙硫唑對14種不同植物病原菌的室內毒力測定

2.2 10%丙硫唑懸浮劑對香蕉葉斑病的田間防效

通過表2可知,在末次施藥后20d,各處理組對香蕉葉斑病的田間防治效果分別為57.76%、71.06%、80.45%、72.20%。末次藥后20 d防效的差異顯著性分析表明,10%丙硫唑懸浮劑的3種濃度防治效果存在極顯著差異,濃度越高,防治效果越好。但10%丙硫唑懸浮劑1000倍稀釋液與對照250g/L戊唑醇水乳劑1250倍稀釋液間防治效果沒有顯著差異。

表2 10%丙硫唑懸浮劑對香蕉葉斑病的田間防效

2.3 丙硫唑對小麥赤霉病菌毒素產生的影響

2.3.1 建立標準曲線 采用高效液相色譜法同時將禾谷鐮孢菌復合種的毒素NIV、DON、15ADON、3ADON分開,如圖2所示,保留時間分別為NIV,4.084min;DON,6.212min;15ADON,22.190min;3ADON,26.784min。圖3為色譜檢測峰面積與標準工作液濃度建立的標準曲線,可見目標峰峰面積與質量濃度線性關系良好。

圖2 分離4種毒素的高效液相色譜圖

圖3 3種毒素的標準曲線

2.3.2 丙硫唑對FgNIV產NIV毒素含量的影響 結果如表3所示,產NIV毒素的禾谷鐮孢菌,分別經過EC20和EC50丙硫唑藥劑處理之后,其NIV毒素積累量明顯下降,相比CK對照組分別下降了17.28%和29.78%。產Fg15ADON毒素的禾谷鐮孢菌,分別經過EC20和EC50丙硫唑藥劑處理后,產DON、15ADON毒素積累量顯著降低。產DON毒素相比CK對照組分別下降了19.69%、36.35%,產15ADON毒素相比CK對照組分別下降了19.04%、31.56%。部分樣品檢測圖如圖4。

表3 丙硫唑對小麥赤霉病菌毒素含量的影響

圖4 部分樣品檢測圖注：a：NIV-CK;b：NIV-EC20處理;c：NIV-EC50處理;d：Fg15-CK產15ADON平均濃度;e：Fg15-EC20處理產15ADON平均濃度;f：Fg15-EC50處理產15ADON平均濃度;g：Fg15-CK產DON平均濃度;h：Fg15-EC20處理產DON平均濃度;i：Fg15-EC50處理產DON平均濃度。

3 討論

殺菌劑是目前植物病害防治中最高效的防治手段[14],丙硫唑又是一種低毒、高效的醫藥且在植物病害防治方面的研究較少。石婭瓊[15]發現10%丙硫唑懸浮劑對辣椒炭疽病和水稻稻瘟病等病害具有抑制作用。葉火春等[16]人研究得出丙硫唑與溴菌腈復配使用對杧果細菌性角斑病菌的防治有協同增效的作用。本研究通過室內毒力測定丙硫唑對14種植物病原菌均有一定的抑菌作用,說明丙硫唑具有廣譜殺菌性。10%丙硫唑懸浮劑的3種濃度防治效果存在極顯著差異,濃度越高,防治效果越好。同時10%丙硫唑懸浮劑1000倍稀釋液與對照250g/L戊唑醇水乳劑1250倍稀釋液間防治效果沒有顯著差異,說明10%丙硫唑懸浮劑對香蕉葉斑病具有較好的田間防治效果。

小麥受到赤霉菌侵染后在籽粒中產生多種毒素,包括雪腐鐮孢菌烯醇(NIV)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)與15-乙酰脫氧雪腐鐮孢菌烯醇(15-ADON)等。這類毒素具有細胞毒性,可以穿過生物屏障,影響消化、免疫、內分泌和神經系統,會引起嘔吐、腹痛、眩暈等癥狀[17-18]。現尚未有報道丙硫唑對小麥赤霉病菌產毒素影響相關的研究,本文通過高效液相色譜法發現,產NIV毒素的禾谷鐮孢菌,經過EC20、EC50丙硫唑藥劑處理之后,其NIV毒素積累量明顯降低,產Fg15ADON毒素的禾谷鐮孢菌經EC20、EC50藥劑處理后,產DON、15ADON毒素積累量明顯降低,說明一定濃度的丙硫唑對小麥赤霉病菌有降毒素的作用。