聊紅椿炭疽病病原菌的分離鑒定

李曉龍，張文亮,2，官萌嬌，劉 冰，管圓圓，任愛芝，趙培寶*

（1.聊城大學農學院，山東聊城 252000；2.莘縣自然資源和規劃局，山東莘縣 252000）

聊紅椿是我們團隊經過多年選育得到的紅果臭椿新品種（證書號：20190262），翅果顏色鮮紅，燦爛如霞，具有較高的觀賞價值和廣闊的推廣前景[1]。紅果臭椿是臭椿的一個變種，大型落葉喬木，對土壤的適應力強，可以改善環境，不僅果實艷麗，而且木材優良，用途廣泛，是城鄉綠化的優良樹種[2]。

王教敏調查采集臭椿的病樣組織進行分離觀察，經過致病性測定發現炭疽病的致病菌致病性強，嚴重影響臭椿的生長，降低臭椿的價值[3]。王樹和等在河南省的調查發現臭椿炭疽病主要為害葉片，病斑呈圓形褐色，經過病斑組織分離、形態學觀察、柯赫氏驗證、多位點基因系統發育分析發現炭疽病的致病菌是果生炭疽菌[4]。有很多植物都會得炭疽病，韓小勇等采用柯赫氏法則對紫山藥炭疽病病斑組織進行分離，對病原菌進行鑒定，得到6 株致病菌，不同的致病菌致病力不同，其中致病力最強的是暹羅炭疽菌[5]。張世才等通過對重慶加工型辣椒的炭疽病進行調查，并對病原菌進行分離和鑒定，確定致病菌為膠孢炭疽菌，并進行了毒力測定找到了防治辣椒炭疽病的有效藥劑[6]。

本研究于2020年在聊城大學生態園采集病葉，經分離純化得到一種炭疽菌，進一步經致病性測定、形態學及分子鑒定，確定炭疽病的致病菌是暹羅刺盤孢（Colletotrichum siamense），該研究結果為聊紅椿炭疽病防治奠定了基礎，也可為聊紅椿的推廣提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在2020 年8—10 月在聊城大學植物園內采集聊紅椿葉部病害樣本；致病性測定供試健康幼苗是實驗室培養的聊紅椿幼苗，生長時間120 d，健康無病害，長勢一致。真菌培養采用PDA 培養基，所用化學藥品為國產分析純，分子試劑購自泰安聯星公司。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺、上海博訊BSG-250 光照培養箱、高壓蒸汽滅菌鍋、PCR 儀、Olympus 光學顯微鏡、恒溫水浴鍋、培養皿等。

1.3 病原菌的分離和純化

聊紅椿葉部病斑分離采用組織分離法。用無菌水對剛采集的新鮮病葉進行清洗，用解剖刀從葉片病健交界處切取數塊邊長為5 mm 正方形病組織[7]。將葉片生病組織分別放入75%的酒精中2～3 s，以達到表面消毒和淋濕組織表面目的，然后用5%次氯酸鈉對葉片表面消毒3～5 min，放入含有無菌水的培養皿中清洗3 遍，用無菌的吸水紙去掉組織表面水分。用滅菌的鑷子將材料移入PDA 培養基，每皿放5 片，將培養皿翻轉放入25 ℃培養箱培養。等到培養皿材料邊緣長出菌絲物，用接種針進行單胞分離來純化病原菌，直至培養出整齊一致的單個菌落[8]。

1.4 病原菌的形態學鑒定

菌落形態觀察，在超凈工作臺上將分離純化好的菌絲接種于PDA 培養皿上，在25 ℃培養箱倒置培養，每天觀察記錄菌落的形態特征[9]，用相機記錄菌落顏色變化；形態特征顯微觀察，用無菌針挑取少量病原菌制成臨時載玻片，在顯微鏡下觀察菌絲是否有隔、分生孢子的大小、顏色變化等形態特征[10]，記錄并拍照。

1.5 病原菌的分子生物學鑒定

收集菌絲，采用OMIGA 公司的DNA 試劑盒提取病原菌DNA[11-13]，然后進行PCR 擴增，回收擴增片段，由濟南博尚公司進行測序，最后進行序列分析。ITS引物為通用引物（見表1）。

表1 ITS引物

PCR 反應程序為：預變性94 ℃，5 min；然后每循環為94 ℃，30 s；50 ℃，45 s；72 ℃，45 s，32 個循環；繼續72 ℃，延伸5 min，反應結束后電泳檢測。表2為PCR擴增體系。

表2 PCR擴增體系

電泳檢測正確后切膠回收目的條帶，方法為在凝膠成像系統下用刀片切下目的條帶，移至離心管（1.5 mL），采用DNA 凝膠回收試劑盒膠回收DNA 片段[14]。將純化回收后擴增片段送濟南博尚生物技術有限公司測序。

將測序公司反饋的有效序列在NCBI 網頁進行BLAST同源性比對，選取同源序列DNA 序列，構建系統發育樹，根據親緣關系來判斷菌株所屬真菌種類[15-16]。

1.6 病原菌的致病性鑒定

采用柯赫氏法則進行致病性測定[17-18]，方法為在超凈工作臺上，用無菌打孔器打取5 mm 的圓形菌餅若干，將菌餅小心的貼合在健康無病害、長勢一致的聊紅椿幼苗葉片上，每棵幼苗選取3 個葉片處理，同時放置空白PDA 菌餅的葉片作為對照，每組3 棵重復。貼合完用透明袋遮住整棵幼苗，放到25 ℃環境下培養，每天記錄觀察幼苗發病情況并拍照。對出現病斑葉片的幼苗，觀察其發病癥狀是否與接種植物的癥狀一致，并再次從病葉上病健交界分離純化致病菌，與從大田分離到的病原菌進行對照。

2 結果與分析

2.1 聊紅椿葉部病害田間癥狀

對聊城大學生態園中的聊紅椿葉部病害進行了田間癥狀觀察，發現炭疽病是其重要病害之一，主要為害葉片。發病初期葉片顏色由綠轉為紅色，在葉尖及葉緣形成大小不同的褐色病斑，呈不規則形狀，如病情較重則葉部病斑極易碎裂、脫落，形成穿孔癥狀（見圖1）。病害也易造成葉片提早脫落，影響樹勢。

圖1 聊紅椿葉部病害的田間癥狀特征

2.2 病原菌的分離與形態學鑒定

采用組織分離法分離聊紅椿葉部病害病原菌[19]，得到多個病原菌株，其中A2 菌株從菌落形態初步判定屬于炭疽病菌，菌株在28 ℃條件下生長良好，產生白色菌絲，向四周輻射狀生長（見圖2a），隨著培養時間延長，慢慢形成圓形菌落，經7～8 d 長滿培養皿（見圖2b）。

圖2 菌株A2形態特征

初期菌絲為白色絮狀，菌絲絨毛狀茂盛濃密，菌落邊緣光滑規則。培養15 d 后菌落顏色變暗，形成橘紅色的團狀物質，這就是病原菌的分生孢子梗與分生孢子（見圖2c）；在顯微鏡下檢測觀察到菌絲有隔，分生孢子是長橢圓形單胞，兩端鈍圓（見圖2d）。

2.3 病原菌的分子學鑒定

采用DNA提取試劑盒提取菌株的DNA，利用引物ITS4/ITS5 對真菌的DNA 擴增rDNA-ITS 序列，通過1%瓊脂糖凝膠電泳可檢測到清晰的條帶，菌株A2 的rDNA-ITS 序列大小在600 bp 左右條帶（見圖3），符合進一步的測序條件。

圖3 菌株A2的rDNA-ITS擴增片段電泳

經過測序得到了A2 菌株的ITS 序列，將獲得的ITS 序列在NCBI 網站上進行BLAST，將菌株A2 的相應序列與所得到的同源性較高的部分序列進行比對，構建系統進化樹，如圖4 所示，菌株A2 的rDNA-ITS序列與暹羅刺盤孢（登陸號：MW322808.1）同源性最高，達到100%，結合菌株A2的各種形態分析結果，綜合鑒定致病菌A2是暹羅刺盤孢。

圖4 菌株A2的rDNA-ITS序列構建的發育樹

2.4 病原菌的致病性鑒定

將分離到的暹羅刺盤孢菌餅放置到聊紅椿健康葉片4 d 后（見圖5a），病斑開始在葉片與菌餅接觸的邊緣長出。接種7 d后將菌餅去除（見圖5b、圖5c），病斑清晰可見，隨著侵染時間增加，病斑面積逐漸擴大，對比田間癥狀發現生成的病害癥狀特點和聊紅椿炭疽病病情一致，表明暹羅刺盤孢是聊紅椿炭疽病的病原菌。

圖5 暹羅刺盤孢菌致病性測定

3 結論與討論

紅果臭椿作為臭椿中的一個新品種，適應性好、樹形美觀，每年夏季果實紅艷讓人賞心悅目，觀賞價值很高，極具市場開發前景，是庭院綠化和街道美化的良好樹種[20-24]。但是在聊城大學生態園觀察到聊紅椿葉片在多雨季節易于感染葉部病害，產生病斑，嚴重的還會導致葉片脫落，影響樹木的生長與觀賞性[25]，值得深入研究，本研究通過對葉部病害病原菌的分離鑒定初步確定為炭疽病。

炭疽病是一種重要的真菌病害，寄主范圍廣，對植物的危害很大，已在多種植物上報道了炭疽病，例如山藥炭疽病[26]、葡萄炭疽病[27]、廣西油茶炭疽病[28]、芒果炭疽病[29]等。暹羅刺盤孢是炭疽病病原菌的一種，暹羅刺盤孢引起的植物炭疽病也已有報道，例如曹雪仁等對海南橡膠樹暹羅刺盤孢菌遺傳結構進行了分析[30]；徐丹丹等從美麗崖豆藤分離鑒定了暹羅刺盤孢菌[31]；李河等鑒定到油茶炭疽病是由暹羅刺盤孢菌引起的[32]。炭疽病是一種真菌，對真菌的分離鑒定一般是通過病原菌分離形態學觀察[33-34]、致病性鑒定[35]、分子生物性鑒定[36]等途徑來確定，特別是對于近似種較多的炭疽菌需要結合形態學和分子生物學來進行區別鑒定。

本研究通過病原菌分離與形態學鑒定，觀察到菌絲為白色絮狀，菌絲絨毛狀茂盛濃密，菌落邊緣光滑規則，后期形成橘紅色的團狀物質，分生孢子是長橢圓形單胞，兩端鈍圓，與李文等描述的百日草炭疽病菌特征相似，初步確定為炭疽病[37]。經致病性測定和分子生物學鑒定，菌株A2 的rDNA-ITS 序列與暹羅刺盤孢（登陸號：MW322808.1）同源性達到100%，最終確定引起聊紅椿炭疽病的病原菌是暹羅刺盤孢菌。本研究結果為聊紅椿炭疽病的防治和新品種快速推廣奠定了基礎。