慶大霉素誘導糞腸球菌耐藥及其對氯霉素協(xié)同敏感相關特性研究

孫瑤 徐雯雅 周翠 吳慶 陳櫟江 徐春泉 葉建中 周鐵麗

摘要：目的 通過研究慶大霉素誘導糞腸球菌耐藥突變株對氯霉素協(xié)同敏感（collateral sensitivity， CS）的相關特性，為基于協(xié)同敏感治療策略的臨床應用提供依據。方法 采用慶大霉素通過梯度濃度平板對3株慶大霉素敏感的糞腸球菌臨床分離株和1株糞腸球菌標準菌株ATCC29212進行體外實驗誘導耐藥（experimental evolution）；通過微量肉湯稀釋法測定慶大霉素誘導后耐藥突變株對常見抗菌藥物的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentrations， MICs），分析抗菌藥物間交叉敏感性；PCR檢測誘導耐藥菌株氨基糖苷類修飾酶編碼基因攜帶情況；通過瓊脂平板稀釋法測定慶大霉素誘導耐藥（evolved gentamicin-resistant）菌株和親本菌株對其協(xié)同敏感藥物（氯霉素）的防耐藥突變濃度（mutant prevention concentration， MPC），最后，測定氯霉素對慶大霉素誘導耐藥菌株和親本菌株的時間殺菌曲線。結果 結果顯示4株糞腸球菌親本菌株經過慶大霉素誘導后，對慶大霉素MICs升高了16～

64倍，并對阿米卡星表現(xiàn)出交叉耐藥；誘導耐藥菌株及其親本菌株均未檢出aac（6'）-Ie-aph（2"）-Ia。此外，研究發(fā)現(xiàn)誘導后菌株對氯霉素表現(xiàn)出協(xié)同敏感。氯霉素對慶大霉素誘導耐藥糞腸球菌及其親本菌株的MPC均大于1024 μg/mL，突變選擇窗較寬；時間殺菌曲線顯示當氯霉素濃度為親本菌株的1/2×MIC或1/4×MIC時，慶大霉素誘導耐藥菌株的生長被有效抑制，而親本菌株則不能被抑制。結論 基于協(xié)同敏感性制定抗菌藥物治療策略可能有助于有效清除耐藥病原菌并延長抗菌藥物的使用壽命。

關鍵詞：糞腸球菌；協(xié)同敏感；慶大霉素；氯霉素；誘導耐藥

中圖分類號：R978.1 ?文獻標志碼：A

Study on the characteristics of collateral sensitivity to chloramphenicol

of evolved gentamicin-resistant Enterococcus faecalis

Sun Yao， Xu Wen-ya， Zhou Cui， Wu Qing， Chen Li-jiang， Xu Chun-quan， Ye Jian-zhong， and Zhou Tie-li

（Laboratory Medicine Center， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000）

Abstract Objective To study the characteristics of collateral sensitivity to chloramphenicol of evolved gentamicin-resistant Enterococcus faecalis， and to provide foundation for clinical application of treatment strategies based on collateral sensitivity （CS）. Methods Three clinically isolated antimicrobial susceptible Enterococcus faecalis and E. faecalis standard strain ATCC29212 were used to adaptation laboratory evolution in vitro with gentamicin gradient concentration plates. The minimum inhibitory concentrations （MICs） of evolved gentamicin -resistant strains were determined by the microbroth dilution method， and the cross susceptibilities between antimicrobials were analyzed. The prevalence of aminoglycoside modifying enzyme encoding gene was detected by PCR in the evolved resistant strains. The agar plate dilution method was performed to determine the mutant prevention concentration （MPC） of evolved gentamicin-resistant strains and parental strains to the collateral sensitivity drug （chloramphenicol）. Finally， the time-kill curve of chloramphenicol on the strains before and after evolution of gentamicin was determined. Results The results showed that the MICs of four strains of E. faecalis were increased 16～64 fold after evolution to gentamicin， and they showed cross-resistance to Amikacin. aac（6'）-Ie-aph（2"）-Ia had not been detected in all evolved resistant strains and their parental strains. Interestingly， the evolved resistant strains exhibited collateral sensitivity to chloramphenicol. The MPC of chloramphenicol in E. faecalis before and after evolution to gentamicin was higer than 1，024 μg/mL， indicating a wide mutant selection window （MSW）. The time-kill curve showed that when the concentration of chloramphenicol was 1/2×MIC or 1/4×MIC of the ancestral strain， the evolved resistant strains were effectively inhibited， while the parental strains could not be effectively inhibited. Conclusion ?Antimicrobials therapy strategies based on collateral sensitivity possibly help to effectively eliminate drug-resistant pathogens and prolong the lifespan of antimicrobial drugs.

Key words Enterococcus faecalis; Collateral sensitivity; Gentamicin; Chloramphenicol; Evolved resistance

抗菌藥物在人類醫(yī)療、畜牧業(yè)以及農業(yè)上的廣泛使用甚至濫用，使得細菌幾乎對所有抗菌藥物均出現(xiàn)耐藥并迅速播散[1]。新型抗菌藥物的研發(fā)難度大、周期長[2]，人們迫切需要尋找新的對策來對抗或者延緩耐藥性的產生。近年來研究不斷強調基于進化的策略（evolution-based strategies）在優(yōu)化和延長現(xiàn)有藥物療效方面的前景，包括藥物循環(huán)使用、聯(lián)合用藥、抗菌藥物管理等[3]。近期多項研究表明協(xié)同敏感（collateral sensitivity，CS）可能成為一種有效的手段延緩或者逆轉抗菌藥物的耐藥性[4]。

交叉敏感性（cross susceptibility）包括交叉耐藥（cross resistance）及協(xié)同敏感，指耐藥突變導致細菌耐藥的同時對另外一種抗菌藥物敏感性降低或者升高。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)[5]在細菌及癌癥中均有多種藥物顯示出協(xié)同敏感現(xiàn)象。不斷有研究發(fā)現(xiàn)[6]基于協(xié)同敏感現(xiàn)象制定交替或者聯(lián)合用藥策略能夠一定程度上延緩細菌耐藥的發(fā)生。然而，協(xié)同敏感發(fā)生機制及其發(fā)生規(guī)律尚不明確。部分研究顯示[7]協(xié)同敏感譜表現(xiàn)出高度異質性和非重復的特性，使得利用這一機制制定用藥策略復雜化。我們前期研究[8]采用5類8種抗菌藥物對糞腸球菌進行體外誘導耐藥，結果顯示交叉耐藥及協(xié)同敏感現(xiàn)象廣泛存在。

目前，協(xié)同敏感相關研究主要集中在最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）水平，僅少數研究[9]開始著眼于闡釋防耐藥突變濃度（mutant prevention concentration，MPC）水平對細菌的作用。MPC指防止特定大小菌群中一步耐藥突變菌株選擇性富集的最低抗菌藥物濃度。MIC至MPC之間的濃度范圍稱為突變選擇窗（mutant selection window，MSW），當抗菌藥物濃度落在MSW中時能夠選擇性富集一步耐藥突變株[10]。有研究表明[13]交叉敏感性的發(fā)生能夠引起MSW的改變。協(xié)同敏感菌株可能能夠縮小MSW，從而防止耐藥突變株被選擇性富集并有效清除耐藥細菌。

目前，國內外對于協(xié)同敏感現(xiàn)象及其臨床用藥策略的研究仍較少，并且主要集中于大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌等[9]，罕有腸球菌相關研究。腸球菌作為一種臨床常見條件致病菌，可引起人類尿路感染、血流感染等多種感染性疾病，是最重要的醫(yī)院獲得性感染病原菌之一。因此，本部分研究內容針對慶大霉素誘導耐藥引起氯霉素敏感性升高的糞腸球菌菌株進行MPC測定和時間殺菌實驗，了解協(xié)同敏感菌株在各抗菌藥物濃度水平下的清除效率，為臨床制定有效清除感染耐藥病原菌的合理方案提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

實驗菌株為3株對慶大霉素敏感的糞腸球菌臨床分離株（菌株編號分別為FC254、FC446和FC490，分別分離自創(chuàng)面、膽汁及膿液標本）、24株慶大霉素高水平耐藥的糞腸球菌臨床分離株和1株糞腸球菌標準菌株ATCC 29212，臨床菌株為分離自溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院的非重復標本，由法國梅里埃MALDI-TOF MS質譜儀和VITEK?2 Compact型全自動微生物分析儀進行菌種鑒定和抗菌藥物敏感性初步測定。標準菌株糞腸球菌ATCC29212購自衛(wèi)生部臨檢中心。

1.2 線性梯度平板法體外誘導耐藥

線性梯度平板的制備參考文獻[8]。將加入抗菌藥物的15 mL LB瓊脂培養(yǎng)基（例如終濃度為1×MIC）傾注于90 mm培養(yǎng)皿中，將平皿傾斜放置；瓊脂凝固后使培養(yǎng)皿水平放置，加入另外不含藥的15 mL LB瓊脂培養(yǎng)基，放置擴散12 h，所得梯度平板濃度即0～1×MIC，如圖1。

將過夜培養(yǎng)的4株待測菌株以無菌生理鹽水調成1.5×108 CFU/mL菌懸液；取100 μL上述菌液均勻涂布于瓊脂平板表面（起始梯度平板濃度：0～2×MIC），每4 d傳代1次；4 d后挑取高濃度端生長菌落保種，新鮮梯度平板上；當包括最高濃度處全板均有細菌生長后，提高最高抗菌藥物濃度為原濃度5倍進一步誘導；傳代10代，共40 d，同時將親本菌株在不含抗菌藥物LB瓊脂平板上傳代，作為空白平行對照。每株待測菌株分別平行誘導3系（lineage）。分別取第3次、第6次和第9次傳代菌株進行藥物敏感性的監(jiān)測；慶大霉素體外誘導耐藥菌株在不含抗菌藥物平板上連續(xù)傳代10代，觀察其藥物敏感性改變是否穩(wěn)定存在。

1.3 ?抗菌藥物敏感性試驗

采用微量肉湯稀釋法測定誘導耐藥菌株及其親本菌株對包括慶大霉素在內的13種抗菌藥物的抗菌藥物敏感性，即慶大霉素、阿米卡星、青霉素、氨芐西林、亞胺培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星、萬古霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素和呋喃妥因；確認慶大霉素高水平耐藥糞腸球菌臨床分離株對慶大霉素的MICs值。抗菌藥物購自溫州市康泰生物科技有限公司。操作規(guī)范及折點判讀參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）標準2021版。采用糞腸球菌質控菌株ATCC 29212進行質控。

1.4 氨基糖苷類修飾酶編碼基因PCR檢測

采用Biospin細菌基因組DNA提取試劑盒提取慶大霉素誘導耐藥菌株及其親本菌株、24株慶大霉素高水平耐藥糞腸球菌臨床分離株的基因組DNA。PCR擴增氨基糖苷類修飾酶aminoglycoside modifying enzymes， AMEs）編碼基因aac（6'）-Ie-aph（2"）-Ia。引物序列為F：CAGAGCCTTGGGAAGATGAAG；R：CCTCGTGTAATTCATGTTCTGGC，產物大小為

348 bp。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，Gel-Red染色后凝膠成像觀察結果。

1.5 防耐藥突變濃度的測定

根據參考文獻[11]中瓊脂平板稀釋法檢測慶大霉素誘導耐藥糞腸球菌和親本菌株對氯霉素的防耐藥突變濃度。以誘導耐藥糞腸球菌對氯霉素的MIC為基準，采用倍比稀釋方法進行含抗菌藥物的平板配制，藥物濃度自 MIC到1024 μg/mL；將待測菌株37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取單個純菌落于20 mL MH 肉湯培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)18～24 h，3000 r/min離心

10 min 后將沉淀重懸并加入到200 mL MH肉湯培養(yǎng)基中，200 r/min震蕩培養(yǎng)6 h，再次以3000 r/min離心10 min，取沉淀調節(jié)菌液濃度為3.0×1010 CFU/mL；吸取100 μL上述菌液均勻涂布于每個含有倍比稀釋抗菌藥物的胰酶大豆瓊脂平板上，每個濃度接種4個平板，并以菌落計數方法計數確定每個平板細菌總接種量大于1.0×1010 CFU，將平板置于37℃孵育；于 24、48和72 h時分別觀察菌落生長情況，將72 h無菌落生長的最低藥物濃度稱為暫定MPC（MPCpr）；以MPCpr為基準，按抗菌藥物濃度的10%依次遞減配制各濃度含藥平板，重復上述MPCpr測定時操作，將72 h無菌落生長的最低藥物濃度稱為MPC。選擇指數（Selection index， SI）=MPC/MIC。

1.6 時間-殺菌實驗

將新鮮培養(yǎng)的待測純菌株以無菌生理鹽水調節(jié)菌懸液濃度并加入MH肉湯培養(yǎng)基中，使初始接種細菌濃度約為105～106 CFU/mL；向上述體系中加入抗菌藥物，使抗菌藥物終濃度為1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC、4×MIC 和16×MIC，并設置不含抗菌藥物的空白生長對照，置37℃培養(yǎng)；分別于0、2、4、6、8、10、12 和24 h對培養(yǎng)液進行菌落計數；以每毫升細菌數（CFU/mL）為縱坐標，以時間（h）為橫坐標，取3次重復實驗結果繪制各誘導耐藥菌株的時間-殺菌曲線。

2 結果

2.1 體外誘導糞腸球菌對慶大霉素藥物敏感性情況分析

4株親本菌株以慶大霉素進行誘導，每株菌設置3組平行，共獲得12系誘導耐藥菌株（GEN-FC254①、GEN-FC254②、GEN-FC254③、GEN-FC446①、GEN-FC446②、GEN-FC446③、GEN-FC490①、GEN-FC490②、GEN-FC490③、GEN-ATCC29212①、GEN-ATCC29212②和GEN-ATCC29212③）。相比誘導前親本菌株，12系誘導耐藥突變株對慶大霉素MICs提高了16～64倍；不含抗菌藥物平行傳代獲得的菌株MICs未見明顯改變。3組平行重復試驗誘導獲得的耐藥株間相比，MICs升高倍數無明顯差異。12系誘導耐藥菌株在不含抗菌藥物的平板上連續(xù)傳代10代后耐藥性均呈穩(wěn)定存在。

2.2 誘導耐藥菌株對其他各種藥物交叉敏感性情況分析

藥敏結果顯示慶大霉素誘導耐藥菌株對3種抗菌藥物敏感性發(fā)生明顯改變，即12系誘導耐藥菌株均對阿米卡星MICs升高大于8倍（誘導前4株糞腸球菌對阿米卡星MIC為64～128 μg/mL，慶大霉素誘導菌株均>1024 μg/mL），對氯霉素和紅霉素表現(xiàn)為不同程度的協(xié)同敏感性（MIC下降倍數≥4倍），其中以氯霉素較為顯著，MIC下降4～16倍，見圖2。3組平行誘導獲得的耐藥株間的藥物敏感譜無明顯差異，臨床菌株和標準菌株相比，誘導耐藥菌株藥物敏感譜同樣無明顯差異，具體見表1。提示經同種抗菌藥物誘導耐藥后，細菌對抗菌藥物敏感性的改變可能具有一定的規(guī)律性和可預測性。

2.3 氨基糖苷類修飾酶基因攜帶情況

PCR檢測結果顯示24株慶大霉素高水平耐藥糞腸球菌臨床分離株（MICs≥512 μg/mL）均攜帶aac（6'）-Ie-aph（2"）-Ia，而12株慶大霉素誘導耐藥菌株及其4株親本菌株均不攜帶該基因。

2.4 防耐藥突變濃度的測定

氯霉素對4株糞腸球菌親本菌株和12株慶大霉素誘導耐藥糞腸球菌的MPC均大于1024 μg/mL，遠高于MIC值，選擇指數均SI>512，防耐藥突變選擇窗MSW較寬。

2.5 時間殺菌實驗分析

時間殺菌實驗結果顯示抗菌藥物濃度為親本菌株氯霉素MICs的1/2×MIC或1/4×MIC時，誘導耐藥菌株可以被有效抑制，而親本菌株則不能被有效抑制生長（圖3），1/4×MIC抗菌藥物濃度時，誘導耐藥菌株僅在12 h后生長曲線開始升高；藥物濃度為1×MIC時，誘導耐藥菌株生長被抑制，而親本菌株仍能緩慢生長；當抗菌藥物水平為親本菌株氯霉素MICs的4倍及16倍時，誘導耐藥前后的菌株均被完全抑制生長，兩者時間殺菌曲線無明顯區(qū)別，見圖3。

3 ? ?討論

數十年來，多重耐藥病原菌的快速出現(xiàn)和流行給公共衛(wèi)生安全造成嚴重威脅。基于協(xié)同敏感現(xiàn)象制定抗菌藥物使用策略能夠有效減低耐藥的發(fā)生率甚至逆轉已經存在的耐藥性[8]。在本研究中通過慶大霉素對糞腸球菌進行體外誘導耐藥實驗，研究結果顯示交叉耐藥及協(xié)同敏感廣泛存在，相同作用機制的抗菌藥物之間存在交叉耐藥，而協(xié)同敏感發(fā)生于作用機制不同的抗菌藥物之間。然而，有研究顯示交叉耐藥不僅能發(fā)生于同種類抗菌藥物間，也可以發(fā)生于不同種類藥物之間。例如，Lázár等[13]研究發(fā)現(xiàn)拓撲異構酶基因gyrA突變的喹諾酮類耐藥的大腸埃希菌，能夠引起氨芐西林、頭孢西丁及妥布霉素等藥物的耐藥性升高，以及對呋喃妥因和多西環(huán)素敏感性的升高。協(xié)同敏感普遍存在，但在不同種細菌甚至同種細菌中也存在異質性，可能與細菌不同的基因背景、適合度代價以及可移動元件等因素有關[9]。研究顯示大腸埃希菌經氨基糖苷類藥物誘導耐藥后，對四環(huán)素和氯霉素發(fā)生協(xié)同敏感，可能與質子泵動力勢（proton-motive force，PMF）有關[14]。本研究中糞腸球菌對氯霉素協(xié)同敏感的機制尚待進一步闡明。

臨床病原菌對氨基糖苷類耐藥可以由多種耐藥機制引起，其中以氨基糖苷類修飾酶滅活抗菌藥物分子最為常見，即乙酰基轉移酶（aminoglycoside acetyltransferases，AACs）、腺苷酸/核苷酸轉移酶（adenylyltransferases or nucleotidyltransferases，ANTs）和磷酸轉移酶（phosphotransferases，APHs），其中以雙功能酶aac（6'）-Ie-aph（2"）-Ia最為常見[15]。本研究中臨床分離慶大霉素高水平耐藥糞腸球菌中均檢出aac（6'）-Ie-aph（2"）-Ia基因，誘導耐藥菌株及其親本菌株均未攜帶該基因，提示誘導耐藥菌株可能是由其他耐藥機制引起對慶大霉素耐藥，如30S核糖體蛋白編碼基因突變[3]、外排泵表達量升高[14]等。研究提示與可移動基因元件攜帶AMEs引起臨床菌株對慶大霉素耐藥不同，長期用藥引起的慶大霉素耐藥演變可能由其他多種機制介導，并引起對其他抗菌藥物協(xié)同敏感，為臨床選用發(fā)生協(xié)同敏感的藥物進行交替治療提供指導。

臨床上治療感染性疾病時常采用高于MIC的抗菌藥物濃度來清除致病菌，然而治療過程中當抗菌藥物濃度介于MIC之上而低于MPC，即落在MSW內時，耐藥突變株菌株則能夠被選擇性富集[16]，因此，臨床用藥時應使感染部位抗菌藥物濃度保持在MPC之上。有研究發(fā)現(xiàn)體外誘導耐藥菌株存在協(xié)同敏感現(xiàn)象，協(xié)同敏感菌株在MIC降低的同時MPC也相應減低[17]，較低的抗菌藥物濃度則達到防耐藥突變濃度，從而在防止耐藥突變株不被篩選富集的同時保證臨床用藥的安全性。然而，本研究中，慶大霉素誘導耐藥菌株相比親本菌株，氯霉素MIC降低到1/4～1/16，但誘導前后菌株MPC均達到1024 μg/mL以上，遠高于氯霉素的最高血藥濃度（Cmax=26 μg/mL）及安全用藥范圍[18]，防耐藥突變選擇窗MSW較寬，本研究中氯霉素MIC降低沒有能夠顯著減小其MSW，提示該理論可能并不適用于采用氯霉素治療糞腸球菌感染時耐藥突變株的清除。相同藥物對不同菌種的選擇指數SI不同，如氯霉素對大腸埃希菌的選擇指數SI為6.3，而對金黃色葡萄球菌的SI則為5.7[19]。本研究中氯霉素對糞腸球菌的選擇指數SI達512以上。因此，系統(tǒng)、全面地測定臨床常見抗菌藥物對不同病原菌的協(xié)同敏感及MPC值是臨床應用的前提。

有研究報道誘導耐藥菌株對其他抗菌藥物產生協(xié)同敏感現(xiàn)象時，在野生菌株MIC的16倍抗菌藥物濃度作用下，協(xié)同敏感菌株相比野生菌株能夠更快速地被有效清除[17]。本研究中時間殺傷實驗結果顯示在高于親本菌株MIC的抗菌藥物水平下，即4×MIC和16×MIC時，慶大霉素誘導耐藥前后菌株生長被抑制程度相似，24 h后菌落數仍保持在與接種菌量相當水平，這可能與氯霉素僅具有抑菌作用而無殺菌作用有關。而當抗菌藥物濃度低于MIC，即為1/4×MIC和1/2×MIC時，慶大霉素誘導耐藥菌株被有效抑制，而親本菌株則不能被有效抑制。該研究結果提示我們協(xié)同敏感現(xiàn)象的發(fā)生使得耐藥菌株能夠在較低的抗菌藥物濃度作用下被清除，尤其對存在較嚴重基礎疾病患者使用具有較強副作用二線藥物情況下，將能夠允許安全用藥的前提下有效清除耐藥菌株。

綜上所述，本研究顯示糞腸球菌經慶大霉素體外誘導耐藥能夠快速獲得耐藥性，并對氯霉素協(xié)同敏感。低水平氯霉素能夠有效抑制協(xié)同敏感菌株的生長，這為基于協(xié)同敏感的交替用藥策略的應用奠定基礎，協(xié)同敏感的發(fā)生發(fā)展規(guī)律及其發(fā)生機制仍有待進一步的闡釋。

參 考 文 獻

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收稿日期：2021-09-24

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目（No. 81802069）

作者簡介：孫瑤，女，生于1990年，主管技師，主要研究方向為臨床微生物耐藥機制研究，E-mail： sunyaowzmu@163.com

通訊作者，E-mail： wyztli@163. com