分光光度法快速測定醬油中半胱氨酸

劉毅 袁莉 儲(chǔ)文 袁嘉怡 馬衛(wèi)興

摘要：基于半胱氨酸與陽離子染料堿性品紅發(fā)生加成反應(yīng)，首次提出堿性品紅加成反應(yīng)褪色分光光度法測定半胱氨酸含量的新方法。在硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液中，半胱氨酸與堿性品紅發(fā)生加成反應(yīng)形成無色的硫醚衍生物，溶液褪色，吸光度減小，加成產(chǎn)物最大吸收波長在 542 nm處，據(jù)此建立了分析方法。半胱氨酸的濃度C與吸光度差值ΔA呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性范圍為1.00～10.00 mg/L，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3，表觀摩爾吸光系數(shù)為1.525×104 L/（mol·cm）。方法成功應(yīng)用于市售醬油樣品中半胱氨酸含量的測定，醬油樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)平均回收率為97.1%和98.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.85%、1.23%，不同醬油樣品測定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）均小于3%。建立的方法操作簡單，專屬性強(qiáng)，檢測成本低，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于醬油中半胱氨酸的快速測定。

關(guān)鍵詞：半胱氨酸；堿性品紅；醬油；加成反應(yīng)；褪色分光光度法

中圖分類號(hào)：TS264.21? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號(hào)：1000-9973（2023）04-0166-04

Abstract： Based on the addition reaction of cysteine with the cationic dye basic fuchsin， a new method for the determination of cysteine content by fading spectrophotometry of basic fuchsin addition reaction is proposed for the first time. In borax-sodium hydroxide buffer solution， the addition reaction between cysteine and basic fuchsin forms a colorless thioether derivative， the solution fades， the absorbance decreases， and the maximum absorption wavelength of the addition product is at 542 nm. Based on this， the analytical method is established. The concentration C of cysteine shows a good linear relationship with the absorbance difference ΔA， with a linear range of 1.00～10.00 mg/L， the correlation coefficient r=0.999 3 and the apparent molar absorbance coefficient of 1.525×104 L/（mol·cm）. The method is successfully applied to the determination of cysteine in commercially available soy sauce samples. The average recovery rates of the spiked recovery tests of soy sauce samples are 97.1% and 98.3% with the relative standard deviations of 0.85% and 1.23%， and the relative standard deviations （n=6） of the determined values of different soy sauce samples are all less than 3%. The established method is simple to operate， has strong specificity， low cost， accurate and reliable results， and can be used for the rapid determination of cysteine in soy sauce.

Key words： cysteine； basic fuchsin； soy sauce； addition reaction； fading spectrophotometry

醬油是一種由小麥、大豆經(jīng)生物發(fā)酵制成的傳統(tǒng)調(diào)味品，在增加菜肴的色澤和鮮味的同時(shí)，醬油具有改善人體胃液分泌和促進(jìn)消化的能力[1-2]。隨著人們生活水平的提升，消費(fèi)者對(duì)醬油的質(zhì)量也愈加關(guān)注。氨基酸作為醬油的重要營養(yǎng)成分，種類高達(dá)26種[3]，半胱氨酸就是其中之一。L-半胱氨酸（L-cysteine，cys）是一種天然存在于果蔬、牛奶、肉制品中的氨基酸，具有抗氧化作用，同時(shí)能夠清除人體人體內(nèi)金屬離子和有毒物質(zhì)[4]，在食品、制藥行業(yè)備受關(guān)注，具有很大的應(yīng)用潛力。半胱氨酸缺乏會(huì)導(dǎo)致頭發(fā)脫色、嗜睡、肝損傷、皮膚損傷、肌肉和脂肪減少等癥狀[5-6]，而半胱氨酸過高可能會(huì)引起老年癡呆、心血管疾病等[7]。因此，建立一種快速高效的分析方法測定半胱氨酸具有重要意義。

目前測定半胱氨酸含量的方法有高效液相色譜法[8-9]、熒光法[10-11]和電化學(xué)法[12-13]等，大多需要昂貴的高精密儀器或者操作繁瑣、樣品處理復(fù)雜。單獨(dú)測定醬油中半胱氨酸的方法未見報(bào)道。紫外可見分光光度法由于操作簡單、成本低廉已廣泛應(yīng)用于物質(zhì)的定量分析。本研究發(fā)現(xiàn)在硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液中，半胱氨酸的巰基可與陽離子染料堿性品紅（basic fuchsin）發(fā)生加成反應(yīng)，生成無色的硫醚衍生物，溶液褪色，吸光度減小。通過對(duì)溶液酸度、試劑用量、反應(yīng)時(shí)間等影響因素進(jìn)行優(yōu)化，建立了能夠快速測定半胱氨酸含量的方法，并確定了醬油中半胱氨酸的定量分析方法，結(jié)果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

752N型紫外可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；BS210S分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；PHS-3C精密酸度計(jì) 上海虹益儀器儀表有限公司。

L-半胱氨酸對(duì)照品、氫氧化鈉、硼砂：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190606，純度≥98.5%；堿性品紅：阿拉丁試劑（上海）有限公司；實(shí)驗(yàn)用水：超純水；醬油：市售欣和醬油、李錦記醬油、海天醬油。

1.2 試劑配制

半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（100.0 mg/L）：稱取0.100 0 g半胱氨酸于100 mL棕色容量瓶中，加水溶解后定容至刻度，搖勻，得到1.000 g/L半胱氨酸儲(chǔ)備液，放入冰箱中儲(chǔ)存。臨用時(shí)吸取儲(chǔ)備液 10.0 mL置于100 mL棕色容量瓶中，定容至刻度，搖勻，得到100.0 mg/L的半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

堿性品紅溶液（5.00×10-4 mol/L）：稱取堿性品紅0.169 2 g于100 mL燒杯中，加水溶解后轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。

硼砂-氫氧化鈉緩沖液：pH9.3～10.1，由0.05 mol/L硼砂溶液和0.20 mol/L氫氧化鈉溶液按一定比例混合配制，然后用酸度計(jì)調(diào)節(jié)pH。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

在室溫下，取2支同一型號(hào)的10 mL比色管，其中一支加入一定量的半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液，另一支不加半胱氨酸做空白試驗(yàn)。然后于2支比色管中分別加入濃度為5.00×10-4 mol/L的堿性品紅溶液1.25 mL、pH 9.8的硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液2.00 mL，加水至刻度，搖勻。立刻置于分光光度計(jì)中，以水作參比，用1 cm比色皿于波長542 nm處測量吸光度（其中含半胱氨酸的為A，空白的為A0），并計(jì)算出吸光度差值ΔA=A0－A。

2 結(jié)果討論

2.1 吸收光譜

按照1.3的實(shí)驗(yàn)方法，在波長400～620 nm范圍內(nèi)用分光光度計(jì)測定半胱氨酸與堿性品紅反應(yīng)前后的吸光度，繪制吸收光譜，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，曲線1為空白溶液的吸收光譜，在硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液中，堿性品紅的最大吸收峰位于542 nm。曲線2為測定液的吸收光譜，加入半胱氨酸后，半胱氨酸與堿性品紅發(fā)生加成反應(yīng)，溶液的紅色變淺，吸光度減小，故本體系為褪色反應(yīng)。且反應(yīng)后溶液的最大吸收波長也位于542 nm，故選擇542 nm為測定波長。

2.2 酸度的影響

取半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL、堿性品紅溶液1.00 mL，控制不同pH（pH 9.3～10.1）的硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液加入量為1.00 mL，考察緩沖溶液pH值對(duì)體系褪色程度（ΔA）的影響，結(jié)果見圖 2。

由圖2可知，pH為9.8～9.9時(shí)，ΔA達(dá)到最大值且較為平穩(wěn)，增加或減小pH，ΔA均有所減小，故選擇緩沖溶液最佳pH為9.8。改變pH 9.8緩沖溶液的用量，觀察ΔA的變化，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，緩沖溶液用量為1.50～2.50 mL時(shí)，ΔA達(dá)到最大值且相對(duì)平穩(wěn)，選擇2.00 mL為最佳用量。因此，選擇pH 9.8的硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液2.00 mL進(jìn)行試驗(yàn)。

2.3 堿性品紅用量的選擇

取半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL、pH 9.8的硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液2.00 mL，加入不同體積（0.50～2.00 mL）濃度為5.00×10-4 mol/L的堿性品紅溶液，按實(shí)驗(yàn)方法測定吸光度，考察堿性品紅用量對(duì)ΔA的影響。

由圖4可知，堿性品紅用量為0.75～1.75 mL時(shí)，ΔA達(dá)到最大值且較為平穩(wěn)，故選擇5.00×10-4 mol/L的堿性品紅溶液最佳用量為1.25 mL。

2.4 反應(yīng)時(shí)間的影響

選擇以上最佳條件，按照“1.3”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法每隔5 min測定一次吸光度值，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)ΔA的影響。結(jié)果表明，在室溫下，半胱氨酸能夠快速與堿性品紅發(fā)生加成反應(yīng)，溶液褪色。且隨著時(shí)間的增加，A、A0均減小，ΔA也減小。故本實(shí)驗(yàn)選擇即配即測法，配完溶液立刻用分光光度計(jì)進(jìn)行測定。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在上述選定的最佳條件下，在測定液中加入濃度為100.00 mg/L不同體積（0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL）的半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法，于最大吸收波長542 nm處測定吸光度，同時(shí)測定空白溶液的吸光度，并計(jì)算出吸光度差值ΔA，繪制工作曲線（見圖5）。半胱氨酸的濃度C與吸光度差值ΔA呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性范圍在1.00～10.00 mg/L，線性回歸方程為ΔA=0.126C+0.012，相關(guān)系數(shù)r為0.999 3，摩爾吸光系數(shù)為1.525×104 L/（mol·cm），可見本方法有較寬的線性范圍。

2.6 干擾實(shí)驗(yàn)

考察了醬油中存在的其他氨基酸是否會(huì)干擾測定結(jié)果。對(duì)于80.00 μg/10 mL的半胱氨酸，相對(duì)誤差不超過±5%，使以下倍數(shù)的其他氨基酸不造成干擾：谷氨酸、丙氨酸（200倍）；甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸（150倍）；纈氨酸、絲氨酸、賴氨酸（100倍）；蘇氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸（50倍），可見本方法具有良好的選擇性。

2.7 精密度實(shí)驗(yàn)

按照“1.3”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法，于542 nm處測定吸光度，平行測定10次，所得數(shù)據(jù)及分析處理結(jié)果見表1。回收率在97.3%～102%之間，平均回收率為99.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.95%，可見本方法的精密度較高。

2.8 樣品分析

2.8.1 醬油樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取5.00 mL 醬油于50 mL棕色容量瓶中，用超純水定容，搖勻，得到醬油樣品溶液。于10 mL比色管中加入1.00 mL醬油樣品溶液，按“1.3”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法測定吸光度，平行測定6次。

取5.00 mL醬油樣品于50 mL棕色容量瓶中，再加入適量濃度為100.0 mg/L的半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水定容，即得加標(biāo)后的醬油樣品溶液。按“1.3”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法移取1.00 mL測定吸光度，平行測定6次。

由回歸方程計(jì)算出醬油樣品中半胱氨酸的含量以及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的測定值。結(jié)果表明，醬油樣品中半胱氨酸的含量為0.260 mg/mL，不同加標(biāo)水平的平均加標(biāo)回收率分別為97.1%、98.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.85%、1.23%，符合國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 27417-2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》的規(guī)定。

2.8.2 不同醬油樣品中半胱氨酸含量的測定

選取了市售3種不同品牌和級(jí)別的醬油，分別為欣和醬油（特級(jí)，氨基酸態(tài)氮≥1.00 g/dL）、李錦記金標(biāo)生抽（一級(jí)，氨基酸態(tài)氮≥0.700 g/dL）、海天醬油（三級(jí)，氨基酸態(tài)氮≥0.400 g/dL）。分別取5.00 mL以上3種醬油于50 mL棕色容量瓶中，用超純水定容，搖勻，得到醬油樣品溶液A（欣和）、B（李錦記）、C（海天）。取3支10 mL比色管，編號(hào)為1#、2#、3#，分別加入1.00 mL醬油樣品溶液A、B、C，按“1.3”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法測定吸光度，各平行測定6次。通過回歸方程計(jì)算的測定結(jié)果見表3。欣和特級(jí)醬油、李錦記一級(jí)醬油和海天三級(jí)醬油中半胱氨酸的含量分別為0.377，0.261，0.153 mg/mL，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在3%以內(nèi)，符合定量分析的要求。

3 反應(yīng)機(jī)理

已有文獻(xiàn)對(duì)亞硫酸根離子使堿性品紅溶液褪色的機(jī)理做了討論[14-16]。張文德[17]利用亞硫酸鹽與堿性品紅的加成反應(yīng)，建立了分光光度法測定食品中游離型亞硫酸鹽及總亞硫酸鹽的含量。堿性品紅的分子結(jié)構(gòu)是一個(gè)三苯甲烷型的共軛體系，堿性品紅因生色基團(tuán)——共軛的“醌式”結(jié)構(gòu)而顯現(xiàn)顏色，亞硫酸根離子中的硫原子具有一對(duì)孤對(duì)電子，能夠與堿性品紅中心碳原子（C14）發(fā)生加成反應(yīng)，破壞共軛結(jié)構(gòu)，顏色消失。按照類比思維，半胱氨酸分子上的巰基硫原子具有兩對(duì)孤對(duì)電子，同樣能夠與堿性品紅發(fā)生加成反應(yīng)，生成無色硫醚衍生物：3-{[二（4-氨基苯基）-（3-甲基-4-氨基）苯甲基）]硫醚基}-2-氨基丙酸根，生色基團(tuán)的共軛結(jié)構(gòu)被破壞，溶液褪色（反應(yīng)機(jī)理見圖6）。隨著半胱氨酸濃度的增加，溶液的顏色越來越淺，測得的吸光度也逐漸減小，且半胱氨酸的濃度與褪色程度呈線性關(guān)系，通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了最佳反應(yīng)條件后建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，用對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定樣品中半胱氨酸的含量。

4 結(jié)論

本研究對(duì)基于堿性品紅加成反應(yīng)褪色分光光度法測定半胱氨酸含量的影響因素進(jìn)行了考察和優(yōu)化。通過對(duì)溶液酸度、試劑用量、反應(yīng)時(shí)間等影響因素的考察，得到了反應(yīng)的最佳條件：反應(yīng)在pH 9.8的硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液中進(jìn)行，緩沖溶液用量為2.00 mL，5.00×10-4 mol/L堿性品紅溶液用量為1.25 mL，采用即配即測法，建立了能夠快速測定半胱氨酸含量的方法，并確定了醬油中半胱氨酸的定量分析方法。該方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：該方法為一步反應(yīng)，原理簡單；使用的試劑種類較少，且材料廉價(jià)易得；儀器操作簡單且普及率高；具有較寬的線性范圍，較高的精密度和較強(qiáng)的專屬性，可以應(yīng)用于醬油中半胱氨酸含量的快速測定。

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