血清miR-1246、CXCL12和CXCR4水平預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后預(yù)后的效能

戴 斌,曾穎鷗,喬 弟,鄔云龍,王 勐,王 強(qiáng)

上海市浦東新區(qū)周浦醫(yī)院胸外科,上海 201318

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤,其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%～85%,由于該病發(fā)病較為隱匿,在確診時(shí)大多數(shù)患者已處于中晚期,總體生存率仍較低,5年生存率僅為15%～17%[1]。因此,發(fā)掘早期診斷和篩查肺癌的指標(biāo),對(duì)于改善患者預(yù)后具有重要意義。微小RNA(miRNA)是一類非編碼小分子RNA,長(zhǎng)度為 20～22 nt,廣泛存在于真核細(xì)胞中, 越來(lái)越多的研究證實(shí),miRNA在癌癥發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,可能涉及細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡[2]。研究證實(shí)miRNA與肺癌具有一定的聯(lián)系,miR-1246通過(guò)與CXC趨化因子受體4(CXCR4)結(jié)合具有抑制肺癌遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用,但其在肺癌預(yù)后評(píng)價(jià)中的價(jià)值仍不清楚[3]。本研究通過(guò)檢測(cè)NSCLC患者血清miR-1246、趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(CXCL12)和CXCR4水平,分析3項(xiàng)指標(biāo)預(yù)測(cè)NSCLC預(yù)后的價(jià)值,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年1月至2020年6月在本院接受手術(shù)治療的98例NSCLC患者為NSCLC組,其中男72例,女26例;年齡45～79歲,平均(59.85±6.73)歲,病理類型包括腺癌35例,鱗癌44例,其他19例;分化程度包括低分化37例,中高分化61例;臨床分期Ⅰ期15例,Ⅱ期47例,Ⅲ期28例和Ⅳ期8例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移55例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例。納入標(biāo)準(zhǔn):所有NSCLC均經(jīng)病理檢查證實(shí);臨床資料完整;術(shù)前未接受放療和化療。排除標(biāo)準(zhǔn):存在其他部位轉(zhuǎn)移性腫瘤;術(shù)前接受過(guò)放療或者化療;合并血液性和免疫性疾病;合并心、肝、腎等重要臟器功能不全;合并肝炎、結(jié)核和肺部急慢性感染;存在智力障礙或者精神疾病。選擇同期在本院診斷為肺部良性疾病的75例患者為肺良性疾病對(duì)照組,其中男53例,女22例;年齡45～79歲,平均(58.18±6.28)歲。納入同期本院75例健康體檢者為健康對(duì)照組,其中男55例,女20例;年齡45～79歲,平均(58.28±7.03)歲。3組年齡、性別等基線資料比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。所有研究對(duì)象簽署知情同意書(shū),本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1血液標(biāo)本收集 NSCLC患者入院后(術(shù)前)和手術(shù)后7 d(術(shù)后),肺良性疾病患者入院當(dāng)日,健康體檢者體檢當(dāng)日抽取肘靜脈血約5 mL,在室溫下靜置約20 min,然后以3 000 r/min離心10 min,離心半徑為15 cm,取上清液約3 mL,放置在-80 ℃的冰箱中待測(cè),采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清CXCL12和CXCR4水平。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 采用TaqMan miRNA試劑盒提取細(xì)胞總的RNA,采用qRT-PCR檢測(cè)血清中的miR-1246水平。并根據(jù)目標(biāo)基因的mRNA序列,設(shè)計(jì)引物,采用Primer express 3.0軟件設(shè)計(jì)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板。miR-1246擴(kuò)增引物序列如下:正向引物5′-CCUGCUCCAAAAAUCCAUU-3′;反向引物5′-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3′。U6擴(kuò)增引物序列如下:正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′;反向引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反轉(zhuǎn)錄后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,采用qRT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件為85 ℃ 3 min,85 ℃ 20 s,42 ℃ 40 s,總共循環(huán)35次,采用2-ΔΔCt計(jì)算miR-1246水平。

1.2.3隨訪 通過(guò)查閱病史、電話、微信和門(mén)診復(fù)查等方式對(duì)NSCLC患者進(jìn)行隨訪,每例患者均隨訪兩年,主要了解患者是否有NSCLC復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和死亡等不良預(yù)后情況,并將患者分為預(yù)后良好組和預(yù)后不良組。

1.2.4觀察指標(biāo) 比較3組研究對(duì)象血清miR-1246、CXCL12和CXCR4水平的變化。分析血清miR-1246、CXCL12和CXCR4水平與NSCLC臨床特征和預(yù)后的關(guān)系,以及3項(xiàng)指標(biāo)對(duì)NSCLC術(shù)后兩年內(nèi)發(fā)生預(yù)后不良的預(yù)測(cè)價(jià)值。

2 結(jié) 果

2.13組血清miR-1246、CXCL12和CXCR4水平比較 NSCLC組術(shù)前血清miR-1246水平明顯低于肺良性疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組,肺良性疾病對(duì)照組也明顯低于健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NSCLC組中,術(shù)后miR-1246水平較術(shù)前明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NSCLC組術(shù)前血清CXCL12和CXCR4水平較肺良性疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組明顯升高,肺良性疾病對(duì)照組明顯高于健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NSCLC組中,術(shù)后血清CXCL12和CXCR4水平較術(shù)前明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組血清miR-1246、CXCL12和CXCR4水平比較

2.2不同特征NSCLC患者3項(xiàng)指標(biāo)水平比較 低分化、Ⅲ+Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者血清miR-1246水平明顯低于高中分化、Ⅰ+Ⅱ期和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而低分化、Ⅲ+Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者血清CXCL12和CXCR4水平明顯高于高中分化、Ⅰ+Ⅱ期和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);血清miR-1246、CXCL12和CXCR4水平在不同年齡、性別、吸煙情況、病理類型和腫瘤最大徑NSCLC患者中比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同特征NSCLC患者3項(xiàng)指標(biāo)水平比較

續(xù)表2 不同特征NSCLC患者3項(xiàng)指標(biāo)水平比較

2.3不同預(yù)后NSCLC患者3項(xiàng)指標(biāo)水平比較 根據(jù)患者兩年的隨訪情況將98例NSCLC患者分為預(yù)后不良組(39例)和預(yù)后良好組(59例)。預(yù)后不良組血清miR-1246水平明顯低于預(yù)后良好組,而預(yù)后不良組血清CXCL12和CXCR4水平明顯高于預(yù)后良好組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同預(yù)后NSCLC患者3項(xiàng)指標(biāo)水平比較

2.43項(xiàng)指標(biāo)對(duì)NSCLC患者預(yù)后不良的預(yù)測(cè)效能 根據(jù)NSCLC患者是否發(fā)生預(yù)后不良進(jìn)行二元Logistic回歸分析,得方程Y=-8.45×XmiR-1246+0.46×XCXCL12+0.12×XCXCR4-5.76為聯(lián)合檢測(cè)指標(biāo),聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度為82.1%,特異度為84.7%,曲線下面積(AUC)為0.910,其AUC明顯高于miR-1246(Z=3.131,P=0.002)、CXCL12(Z=2.998,P=0.003)和CXCR4(Z=3.022,P=0.003)單獨(dú)檢測(cè),而3項(xiàng)指標(biāo)之間的AUC比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見(jiàn)表4和圖1。

表4 3項(xiàng)指標(biāo)對(duì)NSCLC患者預(yù)后不良的預(yù)測(cè)效能

圖1 3項(xiàng)指標(biāo)對(duì)NSCLC患者預(yù)后不良的預(yù)測(cè)效能的ROC曲線

3 討 論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)步,對(duì)NSCLC發(fā)病機(jī)制的研究不斷深入,研究者發(fā)現(xiàn)血清腫瘤標(biāo)志物對(duì)NSCLC的診斷和預(yù)后評(píng)估具有重要的意義。NSCLC在發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中存在多種癌基因和抑癌基因相互作用,且這些基因的生物學(xué)行為表現(xiàn)為階段性變化[4-5]。miRNA 在各種腫瘤中發(fā)揮著重要作用[6]。miR-1246作為miRNA家族的一名成員,已在許多癌癥中被報(bào)道出現(xiàn)異常表達(dá),包括卵巢癌、宮頸癌、肝癌、多發(fā)性骨髓瘤和肺癌[7-9]。一項(xiàng)研究表明,miR-1246在多發(fā)性骨髓瘤CD138 細(xì)胞中呈明顯高表達(dá)[10]。另外,在宮頸癌和胰腺癌等腫瘤中出現(xiàn) miR-1246的低表達(dá),發(fā)揮抑癌作用[11]。本研究證實(shí),NSCLC組術(shù)前血清miR-1246水平明顯低于肺良性疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組,并且NSCLC組術(shù)后血清miR-1246水平較術(shù)前明顯升高,說(shuō)明miR-1246在肺癌中是一種抑癌基因,參與了肺癌的發(fā)生、發(fā)展,在肺癌進(jìn)展中為關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因。因此,血清miR-1246有成為早期發(fā)現(xiàn)肺癌和治療靶標(biāo)的潛力。低分化、Ⅲ+Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC患者血清miR-1246水平明顯低于高中分化、Ⅰ+Ⅱ期和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC患者(P<0.05),并發(fā)現(xiàn)不同年齡、性別、吸煙情況、病理類型和腫瘤最大徑NSCLC患者血清miR-1246水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究結(jié)果顯示,預(yù)后不良組血清miR-1246水平明顯低于預(yù)后良好組,且血清miR-1246為0.76時(shí),其預(yù)測(cè)NSCLC患者兩年內(nèi)發(fā)生預(yù)后不良的靈敏度為89.7%,特異度為57.6%,AUC為0.785,說(shuō)明其對(duì)NSCLC發(fā)生預(yù)后不良具有較高的預(yù)測(cè)效能。

一般來(lái)說(shuō),miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)不同的靶基因參與一系列生物過(guò)程。研究表明,miR-1246通過(guò)介導(dǎo)不同靶基因影響癌癥進(jìn)程,CXCR4是miR-1246的新靶基因,并受miR-1246的負(fù)調(diào)控[3]。本研究結(jié)果顯示,NSCLC組術(shù)前血清CXCR4水平明顯高于肺良性疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組,NSCLC組術(shù)后血清CXCR4水平較術(shù)前明顯降低,說(shuō)明CXCR4參與了NSCLC疾病的發(fā)生、發(fā)展。以往研究顯示,CXCR4在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá),同樣發(fā)現(xiàn)在NSCLC組織中呈高表達(dá),并與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn),不同腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況NSCLC患者血清CXCR4水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并且發(fā)現(xiàn)預(yù)后不良組血清CXCR4水平明顯高于預(yù)后良好組(P<0.05),說(shuō)明血清CXCR4水平與NSCLC的預(yù)后關(guān)系密切。CXCR4不僅在肺癌原發(fā)灶中高表達(dá),在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中同樣呈高表達(dá),而且在骨轉(zhuǎn)移等破壞區(qū)域也呈高表達(dá),在敲除CXCR4基因后能夠明顯抑制NSCLC在肺或者肝臟中的轉(zhuǎn)移[13-14]。本研究結(jié)果顯示,血清CXCR4為48.55 pg/mL預(yù)測(cè)NSCLC患者兩年內(nèi)預(yù)后不良的靈敏度為74.4%,特異度為74.6%,AUC為0.771,說(shuō)明CXCR4水平在預(yù)測(cè)NSCLC術(shù)后發(fā)生預(yù)后不良方面具有較高的效能。

本研究結(jié)果顯示,NSCLC組術(shù)前血清CXCL12水平明顯高于肺良性疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組,NSCLC患者術(shù)后血清CXCL12水平較術(shù)前明顯降低,說(shuō)明CXCL12水平升高與NSCLC疾病本身有關(guān)。CXCL12是重要的趨化因子超家族成員之一,能夠與特異性配體CXCR4結(jié)合,激活CXCL12/CXCR4軸細(xì)胞通路,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖[15]。本研究結(jié)果顯示,不同腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況NSCLC患者血清CXCL12水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并且發(fā)現(xiàn)預(yù)后不良組血清CXCL12水平明顯高于預(yù)后良好組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明血清CXCL12水平與NSCLC患者預(yù)后關(guān)系密切。現(xiàn)有研究證實(shí),CXCL12與CXCR4結(jié)合后,形成信息傳遞和細(xì)胞遷移的偶聯(lián)分子對(duì),參與了腫瘤新生血管的形成,能夠上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌,為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供了有利條件[16-17]。本研究結(jié)果還顯示,當(dāng)血清CXCL12為11.47 pg/mL時(shí),其預(yù)測(cè)NSCLC發(fā)生預(yù)后不良的靈敏度為71.8%,特異度為74.6%,AUC為0.788,說(shuō)明血清CXCL12水平在預(yù)測(cè)NSCLC預(yù)后不良方面具有較高的效能。另外,本研究結(jié)果顯示,聯(lián)合檢測(cè)血清miR-1246、CXCL12和CXCR4在預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后不良方面具有更高的效能,其靈敏度為82.1%,特異度為84.7%,AUC為0.910,其AUC明顯大于miR-1246、CXCL12和CXCR4單獨(dú)檢測(cè),說(shuō)明3項(xiàng)指標(biāo)之間存在某種互補(bǔ)關(guān)系。

綜上所述,miR-1246、CXCL12和CXCR4參與了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程,聯(lián)合檢測(cè)miR-1246、CXCL12和CXCR4在預(yù)測(cè)NSCLC術(shù)后兩年內(nèi)發(fā)生預(yù)后不良方面具有較高的效能。