NK細(xì)胞聯(lián)合PD-1單抗殺傷結(jié)直腸癌細(xì)胞的研究

王丙萍 段金凱 張雙 高艷偉 任猛 陳良全 高維實(shí)

結(jié)直腸癌是十分常見的消化道惡性腫瘤之一。近年在全球范圍內(nèi),結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率有逐漸升高的趨勢,且50歲以下年輕人群發(fā)病率上升[1-2]。對(duì)于晚期患者,通常治療后疾病有進(jìn)展且預(yù)后較差。因此,探索安全、有效的結(jié)直腸癌治療手段及策略是十分迫切的。

腫瘤免疫治療在近年來發(fā)展迅猛,是目前癌癥治療中最受矚目的治療手段。關(guān)于PD-1/PD-L1抑制劑的應(yīng)用在腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、膀胱癌、肺癌、食管癌、霍奇金淋巴瘤和結(jié)直腸癌的治療中取得了十分重大的突破,被FDA批準(zhǔn)可以應(yīng)用于臨床治療[3-7]。然而免疫檢查點(diǎn)抑制劑在結(jié)直腸癌治療方面的應(yīng)用還處于不斷探索的階段。NK細(xì)胞過繼性回輸在多種癌癥的治療中取得了令人滿意的效果[8]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑與NK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用,在治療白血病和非小細(xì)胞肺癌患者時(shí)是安全、有效且具有生存獲益[9-10]。并且許多研究表明,NK細(xì)胞在PD-1信號(hào)通路阻斷療法中發(fā)揮著十分重要的作用。

本研究通過檢測NK細(xì)胞及PD-1單抗+NK細(xì)胞殺傷五種結(jié)直腸癌細(xì)胞系的效率及最佳效靶比,探討PD-1抑制劑聯(lián)合NK細(xì)胞回輸治療結(jié)直腸癌的可行性,為探索結(jié)直腸癌治療策略提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

結(jié)直腸癌細(xì)胞株LOVO、Caco-2、HT-29、HT-115和HRT-18購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所;Lonza X-VIVO15培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、F-12K培養(yǎng)基、McCoy′s5A培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Gibco公司;誘導(dǎo)劑IL-2、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21、OKT3購自美國R&D公司;抗人CD16單克隆抗體購自中國北京同立海源生物科技有限公司;PD-1單克隆抗體(Nivolumab)購自中國大連美侖;Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購自中國TBDTM公司;熒光標(biāo)記單克隆抗體:CD3-FITC、CD56-PE、鼠抗人IgG-FITC購自美國BD公司;CCK-8試劑盒購自中國博士德生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 結(jié)直腸癌細(xì)胞株的培養(yǎng) LOVO、Caco-2、HT-29結(jié)直腸癌細(xì)胞株的培養(yǎng)液分別為F-12K、RPMI-1640、McCoy′5A培養(yǎng)基,HT-115和HRT-18結(jié)直腸癌細(xì)胞株的培養(yǎng)液均為DMEM高糖培養(yǎng)基,FBS濃度均為10%。細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁90%左右傳代培養(yǎng),0.25%胰蛋白酶在37℃時(shí)消化的時(shí)間分別是LOVO、HT-29、HT-115為2 min,Caco-2為1.5 min、HRT-18為3 min。

1.2.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)分離 Ficoll密度梯度離心法分離PBMCs,收集血漿,置于56℃水浴鍋內(nèi)保持30 min,之后置于4℃冰箱內(nèi)10 min進(jìn)行冷卻,離心后收集上清保存于4℃?zhèn)溆?收集白膜層,加入PBS清洗,離心棄上清液,用VIVOTM15培養(yǎng)基重懸PBMCs細(xì)胞,顯微計(jì)數(shù),取樣進(jìn)行流式檢測。

1.2.3 NK細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增 接種日期為第0天,調(diào)整PBMCs細(xì)胞密度為1.5 M/mL,加入自體血清10%,IL-2 1 000 IU/mL,IL-7 10 ng/mL,IL-15 50 ng/mL,IL-18 10 ng/mL,IL-21 50 ng/mL,OKT3 10 ng/mL,Anti-CD16 10 ng/mL,90% VIVOTM15培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,細(xì)胞接種密度≤1.5 M/mL,放入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3～14天補(bǔ)液:每次補(bǔ)液調(diào)整細(xì)胞密度為0.5～1.0 M/mL,自體血漿10%,加入IL-2 1 000 IU/mL。第14天收獲:流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果,合格后收獲細(xì)胞。

1.2.4 流式細(xì)胞檢測 免疫熒光標(biāo)記法進(jìn)行流式細(xì)胞分析,取NK細(xì)胞PBS洗滌后懸浮細(xì)胞,加入CD3-FITC和CD56-PE,4℃避光孵育30 min。PBS洗滌后流式細(xì)胞儀分析檢測,用異硫氰酸(FITC)標(biāo)記IgG作為陰性對(duì)照,根據(jù)流式細(xì)胞分析圖中CD3-CD56+的百分比,確定NK細(xì)胞所占比例。

1.2.5 CCK-8法檢測殺傷效率 分別以NK細(xì)胞、NK+PD-1單抗為效應(yīng)細(xì)胞,靶細(xì)胞分別為五種結(jié)直腸癌細(xì)胞系。靶細(xì)胞接種培養(yǎng)12 h后,加入效應(yīng)細(xì)胞。NK+PD-1單抗為效應(yīng)細(xì)胞的處理方式是106個(gè)NK細(xì)胞加入6 μg PD-1單抗在培養(yǎng)箱中培育2 h。兩組均按效靶比0.1∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1的比例分別加入效應(yīng)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組,同時(shí)設(shè)置單獨(dú)靶細(xì)胞孔和每種比例的單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞孔,3個(gè)復(fù)孔。共同培養(yǎng)24 h后,加入CCK-8試劑孵育3.5 h后用酶標(biāo)儀測定450 nm波長的OD值,以此方法檢測NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性,公式如下:

殺傷率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞OD值)/單獨(dú)靶細(xì)胞組OD值]×100%。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,組內(nèi)比較采用兩因素方差分析,組間比較采用方差分析結(jié)合事后檢驗(yàn)Bonfferoni法進(jìn)行兩兩比較,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NK細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果

健康人外周血分離PBMCs后,經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴(kuò)增NK細(xì)胞。第0天為散落的顆粒狀細(xì)胞(圖1A),3～4天后聚集成團(tuán),出現(xiàn)細(xì)胞集落(圖1B),培養(yǎng)10～14天后,細(xì)胞重新分散為單個(gè)細(xì)胞(圖1C)。經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定CD3-CD56+細(xì)胞(圖1D-I),外周血中占比較少的NK細(xì)胞(10.97%±3.28%),擴(kuò)增到占比(83.20%±8.54%),細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增倍數(shù)為(251.66±19.05)倍,NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)為(1 940.17±402.22)倍。

圖1 NK細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果

2.2 效應(yīng)細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系Caco-2的殺傷效果

NK細(xì)胞效靶比0.1∶1、0.5∶1、1∶1和2∶1組對(duì)靶細(xì)胞Caco-2殺傷效率顯著高于其它效靶比組(P<0.05);PD-1單抗+NK細(xì)胞效靶比0.1∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1組對(duì)靶細(xì)胞Caco-2殺傷效率顯著高于其它效靶比組(P<0.05);效靶比2:1時(shí)NK細(xì)胞組與PD-1單抗+NK細(xì)胞組對(duì)靶細(xì)胞Caco-2的殺傷效率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(表1,圖2A)。

表1 NK細(xì)胞及PD-1單抗+NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞Caco-2的殺傷效率(%)

圖2 NK細(xì)胞、PD-1單抗+NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞LOVO、Caco-2、HT-29、HT-115、HRT-18在不同效靶比時(shí)的殺傷效率(%)

2.3 效應(yīng)細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系LOVO的殺傷效果

NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞LOVO在效靶比為1∶1、2∶1、5∶1、10∶1和15∶1時(shí)殺傷率顯著高于其它效靶比組(P<0.05);PD-1單抗+NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞LOVO在效靶比為2∶1、5∶1、10∶1和15∶1時(shí)殺傷率顯著高于其它效靶比組(P<0.05);NK細(xì)胞組與PD-1單抗+NK細(xì)胞組對(duì)靶細(xì)胞LOVO的殺傷效率,在各個(gè)效靶比中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2,圖2A),此結(jié)果表明PD-1單抗的加入并不能提高NK細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系LOVO的殺傷效率。

表2 NK細(xì)胞及PD-1單抗+NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞LOVO的殺傷效率(%)

2.4 效應(yīng)細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT-29的殺傷效果

NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞HT-29在效靶比為5∶1、10∶1、15∶1和20∶1時(shí)殺傷率顯著高于其它效靶比組(P<0.05);PD-1單抗+NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞HT-29在效靶比為5∶1、10∶1、15∶1和20∶1時(shí)殺傷率顯著高于其它效靶比組(P<0.05);效靶比5∶1和10∶1時(shí)NK細(xì)胞組與PD-1單抗+NK細(xì)胞組對(duì)靶細(xì)胞HT-29的殺傷效率,存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(表3,圖2A)。

表3 NK細(xì)胞及PD-1單抗+NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞HT-29的殺傷效率(%)

2.5 效應(yīng)細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT-115的殺傷效果

從結(jié)果可以看出(表4,圖2A),效應(yīng)細(xì)胞和效靶比的交互作用對(duì)因變量殺傷效率的影響存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=4.366,P=0.002),即效應(yīng)細(xì)胞不同對(duì)殺傷效率的影響在不同效靶比之間存在差異。NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞HT-115在效靶比為2∶1、5∶1和10∶1時(shí)殺傷率顯著高于其它效靶比組(P<0.05);PD-1單抗+NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞HT-115在效靶比為2∶1、5∶1和10∶1時(shí)殺傷率顯著高于其它效靶比組(P<0.05);在效靶比為0.1∶1、0.5∶1時(shí)NK細(xì)胞組與PD-1單抗+NK細(xì)胞組對(duì)靶細(xì)胞HT-115的殺傷效率,存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表4 NK細(xì)胞及PD-1單抗+NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞HT-115的殺傷效率(%)

2.6 效應(yīng)細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系HRT-18的殺傷效果

NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞HRT-18在效靶比為0.1∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1和5∶1時(shí)殺傷率顯著高于其它效靶比組(P<0.05);PD-1單抗+NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞HRT-18在其它效靶比時(shí)顯著高于15∶1和20∶1的實(shí)驗(yàn)組(P<0.05);NK細(xì)胞組與PD-1單抗+NK細(xì)胞組對(duì)靶細(xì)胞HRT-18的殺傷效率,在各個(gè)效靶比中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表5,圖2A),此結(jié)果表明PD-1單抗的加入并不能提高NK細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系HRT-18的殺傷效率。

表5 NK細(xì)胞及PD-1單抗+NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞HRT-18的殺傷效率(%)

2.7 NK細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系殺傷效果的比較

由于PD-1單抗并不能增加NK細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系的殺傷效果,因此只比較了NK細(xì)胞對(duì)不同結(jié)直腸癌細(xì)胞系最高殺傷效率的差異性以及效靶比之間的差異性。從結(jié)果可以看出(圖2B),NK細(xì)胞對(duì)LOVO、HT-29的殺傷效率與Caco-2、HT-115的殺傷效率相比差異顯著(P<0.05),與HRT-18的殺傷效率相比差異極顯著(P<0.01)。不同細(xì)胞系最高殺傷效率的效靶比結(jié)果顯示,LOVO以及HT-29均為10∶1,Caco-2為0.1∶1,HT-115為2∶1,HRT-18為1∶1。每種殺傷效率最高的效靶比都有與其無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的效靶比組,通過統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,五種靶細(xì)胞均在效靶比為2∶1時(shí)有一個(gè)好的殺傷結(jié)果,而后隨著效靶比的增高有三種靶細(xì)胞(Caco-2、TH-115、HRT-18)的殺傷效率降低明顯。

3 討論

免疫檢查點(diǎn)是指在免疫細(xì)胞上表達(dá)的一系列分子,它能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的激活,是人體維持免疫穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)控機(jī)制。PD-1發(fā)揮作用是在免疫應(yīng)答的后期,通過影響干擾素γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因α(TNF-α)以及白細(xì)胞介素2(IL-2)等細(xì)胞因子的分泌進(jìn)而影響T細(xì)胞的增值。目前,在我國已經(jīng)上市的PD-1抑制劑帕博利珠單抗適用于各種類型的高突變負(fù)荷的錯(cuò)配修復(fù)缺失MSI型腫瘤,但對(duì)微衛(wèi)星穩(wěn)定MSS型結(jié)直腸癌患者不起作用[11]。然而對(duì)于結(jié)直腸癌患者,MSS型占絕大多數(shù),如何提高PD-1抑制劑對(duì)這部分患者的治療效果十分具有探討研究價(jià)值。

NK細(xì)胞參與天然免疫和適應(yīng)性免疫,是先天免疫系統(tǒng)中最具殺傷性的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞,能夠介導(dǎo)強(qiáng)大的抗病毒和抗腫瘤作用[12]。同時(shí)還具有強(qiáng)大的間接增強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用,是T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤功能的基礎(chǔ)[13]。有研究表明,NK細(xì)胞受損和細(xì)胞數(shù)量的減少,與各類腫瘤的進(jìn)展都具有相關(guān)性[14-15]。本研究通過細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴(kuò)增PBMCs的方法體外擴(kuò)增培養(yǎng)NK細(xì)胞,將外周血中數(shù)量占比較少(10.97%±3.28%)的NK細(xì)胞擴(kuò)增至占比(83.20%±8.54%),細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增倍數(shù)為(251.66±19.05)倍,NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)為(1 940.17±402.22)倍。本研究結(jié)果說明,通過細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法可以大量擴(kuò)增純度較高的NK細(xì)胞,為NK細(xì)胞的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

過繼性免疫治療是腫瘤免疫療法的一種,其原理是將人體內(nèi)的抗腫瘤免疫細(xì)胞采集后,經(jīng)過體外培養(yǎng)擴(kuò)增后回輸患者,以增強(qiáng)人體免疫系統(tǒng),從而達(dá)到抗腫瘤的目的。本研究結(jié)果顯示,當(dāng)達(dá)到最佳殺傷效率的效靶比后,隨著效靶比的增加,NK細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系的殺傷效率反而降低,此結(jié)果提示應(yīng)用NK細(xì)胞過繼回輸治療結(jié)直腸癌時(shí),并不是NK細(xì)胞越多越好,將效靶比控制在2∶1時(shí)可能是一個(gè)安全且治療效果最好的比例。

許多研究結(jié)果都說明NK細(xì)胞在PD-1信號(hào)通路阻斷療法中發(fā)揮著十分重要的作用。本研究結(jié)果表明,PD-1單抗與NK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用對(duì)Caco-2(效靶比2∶1)、HT-29(效靶比5∶1和10∶1)以及HT-115(效靶比0.1∶1和0.5∶1)細(xì)胞系的殺傷效率與單獨(dú)NK細(xì)胞相比差異顯著(P<0.05),其余各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示PD-1單抗可以聯(lián)合NK細(xì)胞過繼性回輸治療結(jié)直腸癌且有一定的治療意義。

LOVO細(xì)胞系是人源高轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)腸癌細(xì)胞系(來源于左鎖骨上區(qū)轉(zhuǎn)移灶,TNM Ⅳ期),HT-115細(xì)胞系來源于人的肺轉(zhuǎn)移病灶,兩種細(xì)胞系均屬于惡性程度較高的未分化細(xì)胞系,具有較強(qiáng)的侵襲和遷移能力。HT-29細(xì)胞系來源于中等程度分化的腺癌(人結(jié)腸原發(fā)灶,TNMⅠ期),惡性程度較低,侵襲和遷移能力較弱。HRT-18細(xì)胞系又名HCT-8,是人源的回盲部結(jié)直腸腺癌(結(jié)腸癌原發(fā)灶);Caco-2細(xì)胞系來源于人結(jié)腸腺癌,常被用于體外腸上皮屏障模型;這兩種細(xì)胞系均屬于高分化的結(jié)直腸癌細(xì)胞系。從結(jié)果可以看出,NK細(xì)胞對(duì)未分化細(xì)胞系LOVO以及中分化細(xì)胞系HT-29的殺傷效率最高,在效靶比為10∶1時(shí),幾乎可以達(dá)到100%的殺傷效果;對(duì)于未分化細(xì)胞系HT-115以及高分化細(xì)胞系Caco-2的殺傷效率在較低效靶比時(shí)(分別是0.1∶1和2∶1)也能達(dá)到70%以上的殺傷效果;然而對(duì)于惡性程度很低的高分化細(xì)胞系HRT-18,NK細(xì)胞對(duì)其最高殺傷效率僅能達(dá)到38.78%±8.94%,這些結(jié)果表明NK細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌的殺傷效率與其分化程度無關(guān)。除HRT-18細(xì)胞系外,NK細(xì)胞對(duì)其余四種細(xì)胞系的最高殺傷效率都達(dá)到了70%以上,提示NK細(xì)胞對(duì)大多數(shù)結(jié)直腸癌的殺傷效果較好,NK細(xì)胞過繼性回輸適用于結(jié)直腸癌的治療。本研究結(jié)果還提示了HRT-18結(jié)直腸癌細(xì)胞系的特殊性,因此需要后續(xù)進(jìn)行深入研究探索其作用機(jī)制。

本研究通過CCK-8法檢測NK細(xì)胞及PD-1單抗+NK細(xì)胞殺傷五種結(jié)直腸癌細(xì)胞系LOVO、Caco-2、HT-29、HT-115、HRT-18的效率及最佳效靶比,通過統(tǒng)計(jì)比較兩種效應(yīng)組對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系的殺傷效果。結(jié)果表明PD-1單抗與NK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用對(duì)結(jié)直腸癌有一定的治療意義,將效靶比控制在2∶1時(shí)可能是一個(gè)安全且治療效果最好的比例。本研究的結(jié)果為腫瘤免疫逃逸的研究提供了可作為目標(biāo)的研究細(xì)胞以及研究方向,為應(yīng)用NK細(xì)胞過繼性回輸治療結(jié)直腸癌的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。目前,科學(xué)家認(rèn)為腫瘤免疫治療是攻克人類腫瘤難題的一個(gè)極有希望的治療方法,對(duì)腫瘤免疫的深入研究將為攻克人類癌癥提供新的方向。