日糧中添加不同比例葡萄籽對多浪羊十二指腸細菌菌群結構的影響

高 帆,馬忠杰,許貴善,2,王 彥,彭婉婉,馮昕煒,2,袁國宏

(1.塔里木大學動物科學與技術學院,新疆阿拉爾 843300;2.塔里木畜牧科技兵團重點實驗室,新疆阿拉爾 843300)

0 引 言

【研究意義】新疆南疆植被覆蓋度低、生態環境脆弱、飼草料質次量少[1-2]。新疆是我國第一大葡萄產區,2019年新疆水果產量為1 604.75×104t,其中葡萄產量為313.17×104t[3]。葡萄皮渣是釀酒葡萄榨汁后或葡萄酒發酵后的剩余物,占葡萄漿果的10%左右,其中葡萄籽占葡萄皮渣的50%左右。我國每年生產的葡萄皮渣在快速增加,但能被用作飼料的皮渣量僅占25%[4]。開發與利用有上升空間[5]。【前人研究進展】葡萄皮渣含有較豐富的粗蛋白質、粗脂肪、碳水化合物和功能性多酚化合物,在反芻動物飼料中可替代一定比例的玉米、豆粕及粗飼料,或作為飼料添加劑應用[5]。郝小燕等[6]研究了葡萄皮渣對綿羊肉品質、肌肉抗氧化性的影響結果顯示,葡萄皮渣可降低背最長肌剪切力,對羊肉pH、肉色、蒸煮損失及肌內脂肪含量無顯著影響。腸道微生物在刺激新生動物腸道免疫系統的建立[7],以及參與宿主免疫調節方面發揮重要作用[8],另外在動物營養物質降解與利用方面也具有重大意義[9]。細菌作為腸道菌群數量最大的一類,其多樣性極高[10]。腸道細菌菌落受遺傳[11]、季節[12]、飼料[13,14]和飼養方式[15]等多種因素影響。【本研究切入點】在反芻動物腸道中大量微生物之間相互作用從而實現了對飼料養分的高效利用。正常穩定的腸道菌群是機體健康的重要保證,在促進腸道形態結構發育、維持正常免疫功能及抵御外源致病因子侵襲等方面發揮著重要作用[16]。葡萄籽中含有原花青素單寧,Lee等[17]在研究原花青素對體外腸道菌群的影響中發現,原花青素能夠有效抑制腸道致病菌,而對益生菌的影響較小。需研究日糧中添加不同比例葡萄籽對多浪羊腸道細菌菌群結構的影響。【擬解決的關鍵問題】選取25只3月齡體重(20±1.5) kg的健康多浪羊為試驗動物,研究在日糧中添加不同比例的葡萄籽對多浪羊腸道細菌結構的影響,為葡萄籽在反芻動物飼料中的開發與利用提供理論依據和基礎參數。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗于2020年7～10月在塔里木大學動物科學與技術學院實驗站進行。

參考美國 NRC(2007)體重30 kg、日增重200 g/d的肉羊營養需要,按照“等能等氮”的原則,設計5種添加不同比例葡萄籽的日糧:0%,(對照組,A組)、4%,(B組)、8%(C組)、12%(D組)、16%(E組)。試驗所用葡萄籽來自伊犁某葡萄酒廠,自然干燥后用錘片粉碎機粉碎,與其他各飼料原料在混合機內攪拌混勻備用。預混料為每千克全價料提供維生素A 1 300 IU,維生素D 400 IU,維生素E 7.5 mg,鐵12.0 mg,銅3.6 mg,錳12 mg,鋅12.5 mg,硒0.2 mg,碘1.0 mg,鈷0.4 mg。代謝能為計算值,葡萄籽單寧參考盧珍珍[18]文獻進行估測,其余營養均為實測值。表1

表1 5種葡萄籽飼糧組成及營養水平(干物質基礎)

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

采用完全隨機設計。選用3月齡左右、體重(20±1.5) kg的健康多浪羊公羔25只,按照體重相近的原則隨機分成5組,每組5只羊。預飼15 d,正飼90 d。試驗開始前打掃圈舍,并用84消毒液對羊舍的棚頂、地面、圍欄等設施噴灑消毒。試驗羊打耳號、剪毛、并用螨凈進行藥浴,配合使用口服驅蟲藥阿苯達唑每只羊半片,外加伊維菌素注射液進行驅蟲處理。試驗羊單欄飼養,日糧按照先精后粗的順序飼喂。在試驗過程中根據每只多浪羊采食和健康情況及時調整飼喂量。每天飼喂2次(10:00和20:00),試驗羊自由采食,第2 d飼喂前保證料槽內有大于0%小于5%的剩料。每日清晨清理食槽、水槽,更換潔凈的飲水。

1.2.2 樣品采集與指標測定

屠宰后取十二指腸中段食糜兩管,分別用兩個10mL凍存管儲存,保存于-80℃冰箱。

解凍后使用TGuide S96 DNA 提取試劑盒完成核酸的提取。使用酶標儀(基因有限公司GeneCompang Limited,synergy HTX)對核酸進行濃度檢測,根據檢測進行擴增。

檢測合格后,根據全長引物序列合成帶有 Barcode 的特異引物27F_(16S-F) 5'- AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3'和1492R_(16S-R) 5'-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3'(北京百靈克生物科技有限責任公司)對十二指腸內容物基因組 DNA 中的 16S rDNA全長 PCR 擴增。反應混合物的總體積為30 μL,由1.5 μL模板 DNA、3 μL引物混合物(10 μM)、15 μL KOD OneTM PCR Master Mix,10.5 μL ddH2O。擴增程序如下:在 95℃變性2 min,隨后在 98℃ 10 s,55℃ 30s,72℃ 1 min 30 ses進行25個循環,并在 72℃延長2 min。擴增后 PCR 產物使用濃度1.8%的瓊脂糖進行電泳檢測(廠家:北京博美富鑫科技有限公司)對完整性進行檢測。最后PacBio Sequel 進行測序。(測序工作在百邁客公司進行)

1.3 數據處理

試驗數據經Excel 初步統計后,采用SPSS23.0軟件進行單因素方差分析,使用鄧肯法進行多重比較,結果以平均值±標準誤(SEM)表示,以P<0.05作為差異顯著的判斷標準。

2 結果與分析

2.1 Alpha多樣性

研究表明,所有樣品共測得171 045條CCS序列,每個樣品至少產生4 517條CCS序列,平均產生6 842條CCS序列。覆蓋指數結果顯示,測序深度已接近飽和狀態,測序深度可以代表樣品中細菌的真實信息。Alpha多樣性差異不顯著,D組的ACE指數、Shannon指數均高于其它四組,D組菌群豐富度和多樣性均高于其他組;而D組的Simpson指數最高,D組菌群多樣性是4組中最低的,C組Shannon最小,C組物種多樣性是4組中最高。表2

表2 5組多浪羊腸道細菌Alpha多樣性指標

2.2 樣品OTU統計與分析

研究表明,25個樣品測共測出OTU數量為1 038,統計分析試驗組與對照組差異均不顯著(P>0.05)。圖1

五組十二指腸食糜樣共有365條相同tags,分別占各組樣品OTU的43.76%(A)、45.17%(B)、54.40%(C)、57.57%(D)、55.39%(E)。A組獨有44條,B組獨有23條,C組獨有13條,D組獨有17條,E組獨有14條。與A組對比,B組有116條tags與A組不同,C組有134條,D組有121條,E組有123條。C組樣品菌群種類變化最大。圖2

圖1 樣品OTU個數分布

圖2 樣品維恩圖

2.3 Beta多樣性

研究表明,檢測到的總微生物的代表性貢獻率為30.04%,主成分2(PC2)為縱坐標,貢獻率為18.98%。不同顏色點代表不同分組的樣本,兩樣本點越接近,兩樣本物種組成越相似。隨著葡萄籽添加量的升高,各組多浪羊十二指腸腸道菌群相似度逐步提高,D組、E組菌群聚類較好,B組、C組菌群聚類一般,A組菌群聚類較差。圖3

圖3 PCoA分析

2.4 腸道細菌菌群分類學統計

研究表明,門水平上共測得22種菌門,屬水平上發現202種菌屬。在門水平上對照組(A)與試驗組(B、C、D、E)四組均以厚壁菌門(Firmicutes)為第1優勢菌門,D組相對豐度72.27%較其他四組占比最高,組間差異不顯著(P>0.05)。在門水平上擬桿菌門(Bacteroidetes)A組顯著高于其他4組(P<0.05),隨著葡萄籽的添加量的增加抑制了擬桿菌門(Bacteroidetes)的生長。Kiritimatiellaeota A組顯著高于B組與D組(P<0.05),并與C組E組差異不顯著(P>0.05)。表3

表3 腸道細菌門水平

占比最高的10個菌屬,占屬水平各組:A組(48.19%)、B組(55.51%)、C組(57.08%)、D組(56.97%)、E組(75.09%),總體水平呈上升趨勢,排名前10的優勢均屬豐度較高。在屬水平上Aeriscardovia為A、B、C、E四組第1優勢菌群占比最高,而D組第1優勢菌群為Lachnospiraceae_NK3A20_group(毛螺菌科NK3A20屬)。Christensenellaceae_R-7_group E組顯著高于其他B、C兩組(P<0.05)。Mogibacterium D組顯著高于C、E兩組(P<0.05)。uncultured_bacterium_o_WCHB1-41各組間差異顯著(P<0.05),其中A組顯著高于B、C兩組。表4

3 討 論

3.1 Venn

腸道微生物群落結構主要由宿主遺傳、性別、年齡及外界環境因素等決定[18,19]。研究結果表明,在相同品種的試驗動物以及相同飼養管理條件下,日糧中添加不同比例的葡萄籽對多浪羊腸道細菌影響差異不顯著(P>0.05),但通過維恩圖對5組腸道內容物樣比較發現,5組共有365條相同tags,與對照組A組相比C組有134條tags不同。在日糧中添加葡萄籽對多浪羊腸道細菌菌群有一定的影響。5組總體微生物組成相似,可能與多浪羊本身抗逆性強有關。

3.2 多樣性

Alpha多樣性反映微生物物種豐度及均勻度。Chao1指數和Ace指數側重于微生物豐度。香農指數和辛普森指數衡量物種多樣性,受微生物的均勻度和豐度的影響。相同物種豐度的情況下,辛普森指數值越小,香農指數值越大,樣品的物種多樣性越高[20]。試驗數據表明,日糧中添加不同比例葡萄籽對多浪羊細菌多樣性影響差異不顯著。各組樣品覆蓋率均達到湖羊瘤胃內微生物群落結構的98%以上,各組樣本的測序數據量合理,能較好地反映多浪羊腸道內細菌菌群情況。

3.3 腸道細菌分類學統計

腸道菌群組成的多樣性是由環境和宿主遺傳因素形成的復雜的多基因性狀[21]。動物的腸道內含有數以萬計的微生物,包括細菌、真菌、病毒和古生菌等,其中數量最的多的是細菌。這些微生物與宿主共代謝、共進化,形成互惠共生的復雜關系。腸道菌群能夠為動物機體提供營養和能量、調節免疫[22]、拮抗病原微生物、參與代謝、甚至影響宿主行為[23]。十二指腸優勢菌門主要是厚壁菌門與放線菌門,與前人研究相似[24]。擬桿菌門對纖維以外的其他物質降解起到非常重要的作用,厚壁菌門主要作用是分解纖維物質[25]。相比于對照組,添加葡萄籽顯著降低了擬桿菌門的豐度,與Sadet-Bourgeteau等[26]研究結果相似,隨著葡萄籽添加量增大抑制了擬桿菌門的豐富度,是由于葡萄籽中含有單寧,隨著單寧含量的遞增會抑制擬桿菌門的豐度,與趙夢迪等[25]研究相似。厚壁菌門總體差異不顯著,數據顯示隨著葡萄籽添加量的增加總體呈現上升趨勢,添加葡萄籽對厚壁菌門豐度有一定促進作用。放線菌門是抗生素、酶與酶制劑的重要產生菌[27],試驗數據表明放線菌門相對豐度五組間差異不顯著,添加不同比例葡萄籽B組、C組、E組放線菌門相對豐度均大于對照組,添加葡萄籽對放線菌門相對豐度有一定促進作用。A組、B組、C組、E組優勢菌屬為卡多威亞氏菌屬,五組間差異不顯著,Aeriscardovia是一種革蘭氏陽性菌[28]。短鏈脂肪酸在腸道發揮重要作用[29],如抗炎、抗腹瀉和增強胃腸機能等[30-32],腸道短鏈脂肪酸含量受制于與毛螺菌屬、瘤球菌屬、擬桿菌屬等[33]。研究中發現,隨著葡萄籽添加量的增加毛螺旋菌屬豐度顯著提高,瘤球菌屬、擬桿菌屬豐度也呈現上升趨勢,其中D組優勢均屬為毛螺菌科NK3A20屬,且顯著高于對照組。適宜的添加葡萄籽對抵抗炎癥有潛在的促進意義,與楊露等[34]研究相似。

4 結 論

4.1多浪羊十二指腸內容物在門水平上共測得22種菌門,屬水平上發現202種菌屬,其中優勢菌門均為厚壁菌門與放線菌門,優勢均屬為Aeriscardovia。

4.2隨著葡萄籽添加量的增加顯著提高了毛螺菌屬的豐度,抑制了擬桿菌門豐度,同時對放線菌門、瘤球菌屬、擬桿菌屬的豐度有促進作用。

4.3日糧中添加不同比例葡萄籽不影響多浪羊腸道細菌多樣性,影響部分菌群豐度。