菊花組培快繁體系的初步建立

王健蓉 吳嘉純 王春丹 林天友 蘇鎮(zhèn)祥 陳桂玲 曾寶珰

(汕頭市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣東 汕頭 515000)

菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)是菊科菊屬多年生宿根草本植物，是中國傳統(tǒng)名花之一，在中國已有3000多年的栽培歷史。菊花花色豐富，花形優(yōu)美，品種多樣，現(xiàn)已成為世界普遍栽培的花卉，不僅具有觀賞價值，還有藥用和茶用價值。汕頭市濠江區(qū)東湖社區(qū)有栽培菊花的傳統(tǒng)。20世紀(jì)80年代，村民將菊花從外地引進(jìn)東湖，采摘的鮮菊花通過傳統(tǒng)手工的蒸烘方式制成干品，用于泡酒和泡茶，贈送親朋好友。后來便發(fā)展成家家戶戶都有種植。傳統(tǒng)使用扦插的方法進(jìn)行菊花繁殖，如蔡曉霖[1]采用扦插的方式繁育茶用“福白菊”種苗。為深入探索東湖小黃茶菊(下稱“東湖”菊花)種苗規(guī)模化生產(chǎn)及復(fù)壯提純的有效過程，本試驗采用組培的方法對“東湖”菊花生長條件或再生體系進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇“東湖”菊花中生長發(fā)育良好、沒有病害感染、健壯的優(yōu)良單株，采集新鮮、未木質(zhì)化的莖段作為誘導(dǎo)材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預(yù)處理

選用健康單株，取其莖段作為誘導(dǎo)材料，去除葉片，留有帶腋芽莖段，用流水沖洗干凈，然后在超凈工作臺用75%酒精浸泡30s，再用0.1%升汞溶液消毒10min，用無菌水沖洗4～5次，瀝干水分。

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)

消毒好的莖段切成帶有2～3個腋芽，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS加6-BA 0.2mg·L-1加糖30g·L-1加瓊脂粉5g·L-1，pH值為5.8中培養(yǎng)。每瓶培養(yǎng)基接種單個莖段，置于溫度為24℃±2℃，光照強度1000lx，光照時間12h培養(yǎng)室中培養(yǎng)，30d后統(tǒng)計污染率和萌發(fā)率。計算公式：

污染率(%)=污染瓶數(shù)/接種總瓶數(shù)×100

萌發(fā)率(%)=長芽株數(shù)/接種總株數(shù)×100

1.2.3 增殖培養(yǎng)

菊花莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)30d后，腋芽已經(jīng)萌發(fā)成叢生芽。設(shè)置含有不同質(zhì)量濃度6-BA的MS培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)基分別為MS加6-BA 0.2mg·L-1加糖30g·L-1加瓊脂粉5g·L-1(A1)、MS加6-BA 0.5mg·L-1加糖30g·L-1加瓊脂粉5g·L-1(A2)、MS加6-BA 1.0mg·L-1加糖30g·L-1加瓊脂粉5g·L-1(A3)、MS加6-BA 2.0mg·L-1加糖30g·L-1加瓊脂粉5g·L-1(A4)、MS加糖30g·L-1加瓊脂粉5g·L-1(A5)，pH值為5.8。其中，以A1～A4為處理組，A5為對照組。置于溫度為24±2℃，光照強度1000lx，光照時間12h培養(yǎng)室中培養(yǎng)。30d后統(tǒng)計污染率、萌發(fā)率和出芽指數(shù)。計算公式：

出芽指數(shù)=總芽數(shù)/接種總株數(shù)

1.2.4 生根培養(yǎng)

將增殖培養(yǎng)30d的叢生芽切分成單芽，每個單芽達(dá)3～4cm時即可進(jìn)行生根培養(yǎng)。采用不同促進(jìn)根部生長的激素進(jìn)行生根效果比較，培養(yǎng)基分別為1/2MS加IBA 0.1mg·L-1加活性炭0.1g·L-1加糖30g·L-1加瓊脂粉5g·L-1(B1)、1/2MS加NAA 0.1mg·L-1加活性炭0.1g·L-1加糖30g·L-1加瓊脂粉5g·L-1(B2)、1/2MS加IBA 0.1mg·L-1加NAA 0.1mg·L-1加活性炭0.1g·L-1加糖30g·L-1加瓊脂粉5g·L-1(B3)，pH值為5.8，溫度為24±2℃，光照強度4000～6000lx，光照時間12h。30d后統(tǒng)計污染率、生根率、單株平均根數(shù)和單株平均根長。計算公式：

生根率(%)=生根株數(shù)/接種總株數(shù)×100

單株平均根數(shù)=總根數(shù)/生根株數(shù)

單株平均根長=總根長/生根株數(shù)

1.2.5 出瓶移栽

經(jīng)過30d的生根培養(yǎng)后，菊花組培苗可以脫瓶栽植。取出組培苗，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到泥炭土∶河沙=1∶1的基質(zhì)中，噴藥消毒，30d后統(tǒng)計成活率。計算公式：

成活率(%)=成活株數(shù)/移栽總株數(shù)×100

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010整理，應(yīng)用SPSS 22.0軟件的One-Way NOVOA模塊進(jìn)行方差分析和LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 “東湖”菊花的誘導(dǎo)培養(yǎng)

“東湖”菊花初代誘導(dǎo)培養(yǎng)，污染率為0%，萌發(fā)率為100%。帶腋芽的菊花莖段接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，約14d后腋芽萌動，30d后新芽可生長約6～8cm。

2.2 “東湖”菊花的增殖培養(yǎng)

由表1可知，“東湖”菊花增殖培養(yǎng)30d后，含有不同質(zhì)量濃度6-BA的MS培養(yǎng)基均對菊花腋芽萌發(fā)起誘導(dǎo)效果，而對出芽數(shù)量則有所差別，如圖1所示。5種增殖培養(yǎng)基中菊花莖段的萌發(fā)率均達(dá)到100%，且腋芽均能萌發(fā)成叢生芽。A1和A2培養(yǎng)基中叢生芽的長勢好，A3培養(yǎng)基中叢生芽長勢一般，新芽較矮。A4培養(yǎng)基叢生芽矮小，部分新芽玻璃化，生長異常。A1和A5的出芽指數(shù)無顯著差異，但A1添加6-BA能促進(jìn)叢生芽快速伸長。A3的出芽指數(shù)最高，達(dá)到4.42，叢生芽數(shù)量多，葉色青，但是長勢一般，新芽矮小。

表1 “東湖”菊花的增殖培養(yǎng)調(diào)查結(jié)果

注：圖片編號a～e分別對應(yīng)增殖培養(yǎng)基A1～A5。

2.3 “東湖”菊花的生根培養(yǎng)

截取3～4cm的菊花莖段進(jìn)行生根培養(yǎng)，約14d后開始長根，培養(yǎng)30d后，根系長滿培養(yǎng)基底部。由表2可知，3種培養(yǎng)基的污染率均為0%，生根率均達(dá)到98%。3種培養(yǎng)基的單株平均根數(shù)和平均根長均無顯著差異，單株平均根數(shù)為5條以上，單株平均根長達(dá)到9cm以上。

表2 “東湖”菊花的生根培養(yǎng)調(diào)查結(jié)果

2.4 “東湖”菊花組培苗移栽

將菊花組培苗洗凈根部培養(yǎng)基，根部用1000倍多菌靈溶液浸泡后，移栽到泥炭土∶河沙=1∶1的基質(zhì)中，澆足定根水后，置于光照強度為15000lx的苗棚中，約7d時間，后移至自然光環(huán)境中，每天噴水2次，見圖2。30d后成活率達(dá)到100%，葉片綠，苗壯，長勢好。

圖2 “東湖”菊花組培苗移植成活情況

3 結(jié)論與討論

本研究以“東湖”菊花的帶芽莖段為外植體探索組織培養(yǎng)條件，試驗結(jié)果表明，增殖階段以MS為基本培養(yǎng)基，不添加6-BA并不影響菊花腋芽萌發(fā)，而添加不同質(zhì)量濃度的6-BA則能促使腋芽萌發(fā)的同時使葉芽快速增殖，形成大量叢生芽。相比基本培養(yǎng)基，添加0.2mg·L-1的6-BA能使菊花莖段快速伸長；添加1.0mg·L-1的6-BA雖能大量增殖葉芽，但菊花莖段生長受抑制；而添加0.5mg·L-1的6-BA既能大量增殖葉芽，又能使菊花莖段伸長。因此，選擇MS加6-BA 0.5mg·L-1加糖30g·L-1加瓊脂粉5g·L-1作為“東湖”菊花增殖階段的最適培養(yǎng)基。同樣以菊花莖段為試材的已有報道[2-8]，增殖培養(yǎng)基中6-BA添加濃度為1.0～3.0mg·L-1，本研究選擇的增殖培養(yǎng)基中6-BA僅0.5mg·L-1，濃度低，這是基于菊花的新芽增殖和莖段伸長效果進(jìn)行挑選的，也與菊花的品種特性有關(guān)。

生根階段以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加0.1mg·L-1的IBA或NAA均能有效誘導(dǎo)生根，單株根數(shù)達(dá)到5～6根，平均根長達(dá)到9cm以上，根多且長，有利于后期組培苗移栽馴化。

“東湖”菊花作為草本植物，具有觀賞、藥用、茶用等價值，既可美化人居環(huán)境，提升農(nóng)村風(fēng)貌，又有極高的藥用價值，醫(yī)藥行業(yè)對藥用菊花的需求也日益增長。目前，“東湖”菊花仍屬于小范圍、小規(guī)模生產(chǎn)，并未實現(xiàn)規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，如何有效利用東湖本地的菊花種質(zhì)資源產(chǎn)出更多高品質(zhì)的菊花，成為“東湖”菊花發(fā)展的首要問題。隨著菊花組織培養(yǎng)[9，10]的技術(shù)日益成熟，借助這一技術(shù)可快速提高菊花種苗產(chǎn)量，保證菊花種苗質(zhì)量。此外，隨著菊花栽培面積不斷擴(kuò)大，病害狀況日趨加重，菊花病害日漸成為菊花產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的限制因素。病毒病是嚴(yán)重影響菊花健康生產(chǎn)的因素之一，菊花感染病毒后，病毒的累積導(dǎo)致菊花品種退化，長勢變差，產(chǎn)量和質(zhì)量不理想[11]。因此，今后有必要開展菊花脫毒苗的組培技術(shù)研究，包括菊花的脫毒手段、病毒檢測以及各個階段的組織培養(yǎng)等多方面的技術(shù)仍需要探索。