副溶血弧菌病原學(xué)流行規(guī)律以及特征分析

曹利君 畢月 鄧曉宇 黃瑛 劉晶

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是廣泛分布在水產(chǎn)品中的一種嗜鹽性革蘭陰性細(xì)菌，也是導(dǎo)致水產(chǎn)品中毒的主要細(xì)菌，屬弧菌科中的弧菌屬，其進(jìn)入人體后將引發(fā)多種疾病，例如急性胃腸炎和原發(fā)性敗血癥等［1-2］。既往研究證實(shí)，VP 主要致病作用在于其可產(chǎn)生兩種毒力因子（直接溶血素tdh 和溶血相關(guān)毒素trh），部分毒株甚至可攜帶一種以上毒力因子，而誤食被VP 污染后的產(chǎn)品可出現(xiàn)腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐等典型胃腸炎反應(yīng)以及胃腸重復(fù)性感染等癥狀，嚴(yán)重者甚至?xí)霈F(xiàn)休克［3-4］。在沿海地區(qū)和國家，例如日本、臺灣等，由VP 引起的細(xì)菌性食源性疾病占比＞50%［5］。而近年來，造成沿海地區(qū)食物中毒的主要致病菌是VP，不僅取代了原來的沙門菌，并且因該菌引起的細(xì)菌性食物中毒占＞40%，對公眾的健康安全造成嚴(yán)重影響［6］。基于此，本研究圍繞鎮(zhèn)海區(qū)VP 感染患者病菌樣本進(jìn)行生物學(xué)特征分析，并探究影響VP 感染的危險(xiǎn)因素，為后續(xù)該地區(qū)實(shí)現(xiàn)VP 感染的有效治療及防控提供有效數(shù)據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源于收集 收集2020 年1 月至2022 年2月期間寧波市鎮(zhèn)海區(qū)3 家綜合性醫(yī)院、5 家社區(qū)服務(wù)中心腹瀉患者的糞便標(biāo)本。腹瀉的定義：排便≥3 次/d，并伴有水樣便、黏液便、膿血便等性狀改變。采集同時收集相關(guān)的臨床資料，標(biāo)本采用Cary-Blair 培養(yǎng)基專用運(yùn)送。

1.2 細(xì)菌檢測 按照國家科技重大專項(xiàng)傳染病監(jiān)測技術(shù)平臺項(xiàng)目《腹瀉癥候群監(jiān)測方案》要求的方法，糞便標(biāo)本進(jìn)行沙門氏菌、志賀菌、致瀉性大腸埃希菌（腸致病性大腸埃希菌、腸出血性大腸埃希菌、產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌和腸集聚性大腸埃希菌）、霍亂弧菌、VP、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、嗜水氣單胞菌、類志賀鄰單胞菌、彎曲菌的分離培養(yǎng)；細(xì)菌鑒定采用法國生物梅里埃公司VITEK 全自動細(xì)菌分析儀及配套的鑒定板條進(jìn)行。

1.3 血清分群方法 針對可疑菌落應(yīng)用3%氯化鈉溶液制備成10 mg/L 的菌懸液，置于121℃恒溫環(huán)境下持續(xù)1 h 完成滅活；之后行離心操作獲得上清液，加入5%甘油的3%氯化鈉溶液完成重懸并滴15μL 分離的菌懸液在潔凈玻片，搖動玻片40 s 觀察其凝集狀況，若存在明顯凝集現(xiàn)象判定為陽性，無明顯凝集反應(yīng)判定為陰性，同時使用無菌生理鹽水作為自凝對照。

1.4 PCR 擴(kuò)增tdh 和trh 毒力基因 挑取米粒大小糞便（盡可能取黏液膿血部分），于放置有0.5 mL 生理鹽水的離心管中振蕩混勻，13,000 r/min 離心2 min。去盡上清液，沉淀中直接加入100μL 核酸抽提液充分混勻，沸水浴10 min。13,000 r/min 離心5 min，取上清液4μL做PCR 反應(yīng)。取PCR 反應(yīng)液（n×26μL）與TDHTRH-TLH 檢測混合液（n×10μL）混合，震蕩混勻數(shù)秒，3,000 r/min 離心數(shù)秒。取上述混合液36μL 于薄壁PCR 反應(yīng)管或PCR 反應(yīng)板中，然后將已處理標(biāo)本、陽性對照品、陰性對照品各4μL 分別加入薄壁PCR 反應(yīng)管或PCR 反應(yīng)板中，蓋好薄壁 PCR 反應(yīng)管蓋或PCR 反應(yīng)板膜，立即進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)管置于定量熒光PCR 儀上，37℃×2 min；94℃×2 min；循環(huán)1 次，再按93℃×15 sec →60℃×60 sec，循環(huán)45 次；單點(diǎn)熒光檢測在60℃，反應(yīng)體系為40μL。

1.5 藥敏試驗(yàn) 采用法國生物梅里埃公司VITEK 全自動細(xì)菌分析儀及配套的藥敏板條進(jìn)行。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌（ATCC25923）和大腸埃希菌（ATCC25922）。

1.6 觀察指標(biāo)（1）觀察患者血清分群結(jié)果；（2）觀察菌株毒力基因檢測結(jié)果；（3）觀察納入樣本的藥敏試驗(yàn)結(jié)果；（4）觀察VP 腹瀉患者的臨床特征；（5）VP感染的單因素分析；（6）二元Logistic 回歸分析VP 腹瀉患者發(fā)病的危險(xiǎn)因素。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。臨床資料數(shù)據(jù)以n或%表示，行χ2檢驗(yàn)，VP 發(fā)病的危險(xiǎn)因素采用二元Logistic 回歸分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 收集VP 菌株對應(yīng)患者的臨床資料情況，顯示存在87.60%（106/121）的患者排泄糞便呈水樣，2 例患者（占比1.65%）的排泄糞便樣為膿血狀；腹瀉頻次為1～17 次/d，中位數(shù)為7 次；有10 例患者（占比8.26%）伴隨腹痛癥狀，7 例患者（占比5.79%）伴有機(jī)體發(fā)熱癥狀，平均體溫為38.6℃。121 例VP 患者中，105 例患者（占比86.78%）采用抗生素治療，85例患者（占比70.25%）采用輸液治療，32 例患者（占比26.45%）采用口服用藥治療，6 例患者（占比4.96%）采用輸液和口服聯(lián)合用藥。

2.2 血清分群結(jié)果 121 株分離自患者糞便的VP 經(jīng)血清凝集，共分為4 個血清群，其中O3 群共97 株，占比80.17%；O4 群共21 株，占比17.36%；O10 群發(fā)現(xiàn)2 株，占比1.65%；O8 群發(fā)現(xiàn)1 株，占比0.83%。上述血清分群結(jié)果顯示第一優(yōu)勢群為O3 群，第二優(yōu)勢群為O4 群。

2.3 毒力基因檢測結(jié)果 本研究對獲取的121 株菌株樣本均采用實(shí)時熒光PCR 方法檢測其獨(dú)立基因，顯示121 株菌株毒力基因tdh 均為陽性，trh 均為陰性。見圖1。

圖1 采用實(shí)時熒光PCR方法對VP菌株進(jìn)行檢測及其tdh和trh基因表達(dá)的部分結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 在所用的抗菌藥物中，VP 菌株對氨芐西林（AMP）耐藥率最高，為85.12%，見表1。

表1 本研究納入菌株樣本的藥敏測定結(jié)果情況

2.5 針對VP 感染的影響因素進(jìn)行分析（1）單因素分析：根據(jù)本515 例腹瀉患者VP 感染情況建立分組，分別為VP 感染組（n=121）及陰性對照組（n=394），對比兩組患者臨床資料數(shù)據(jù)，顯示兩組患者性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組患者年齡、職業(yè)、發(fā)病時間、發(fā)病期是否食用水產(chǎn)品等比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見表2。（2）二元Logistic 回歸分析發(fā)生VP 感染的危險(xiǎn)因素：將表2 中P＞0.05 的因素作為自變量，發(fā)生VP 感染作為因變量，采用二元Logistic回歸分析顯示監(jiān)測病例年齡為20～59 歲、5～10 月、進(jìn)食水產(chǎn)食品是食源性疾病監(jiān)測病例VP 感染的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。

表2 兩組患者臨床資料數(shù)據(jù)差異比較［n（%）］

3 討論

VP 主要致病作用在于其產(chǎn)生的溶血素，包括不耐熱溶血素（TLH）、tdh、trh，其中tdh、trh 是主要致病因子，擁有毒力基因tdh 和/或trh 的為致病株，而無擁有這兩個基因的為非致病株。本資料結(jié)果顯示，tdh作為VP 的種特異性基因，菌株攜帶率為100%，trh 攜帶率為0%，其中O3 群占比80.17%，為第一優(yōu)勢血清群。需要注意的是，近年來我國抗菌藥物應(yīng)用率呈顯著遞增態(tài)勢，相應(yīng)的病原菌耐藥性日益加劇，采用藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，從患者糞便中分離到的VP 菌株對AMP耐藥率最高，為93.3%，這與其他地區(qū)VP 菌株的耐藥性研究結(jié)果存在一定差異，說明VP 的耐藥性是動態(tài)變化的，VP 菌株耐藥性差異可能與不同地區(qū)、不同就診場所及應(yīng)用的抗菌藥物習(xí)慣不同，以及菌株來源不同等因素有關(guān)。

為了進(jìn)一步分析鎮(zhèn)海區(qū)VP 感染患者臨床情況，本資料對該地區(qū)VP 發(fā)病的影響因素進(jìn)行分析，顯示年齡20～59 歲是VP 發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一，分析其原因，可能是該年齡段人群外出就餐頻率較高，VP 感染風(fēng)險(xiǎn)加劇導(dǎo)致腹瀉癥狀出現(xiàn)，既往有學(xué)者對其他地區(qū)的研究中也獲得了相似結(jié)論［7］。因此，對于外出就餐頻率較高人群，后續(xù)應(yīng)對其積極開展相應(yīng)的健康就餐相關(guān)宣教指導(dǎo)活動，引導(dǎo)該類人群做好行為管理，保持良好的飲食衛(wèi)生習(xí)慣，樹立健康飲食觀念。此外，本研究通過單因素分析發(fā)現(xiàn)從事不同職業(yè)人群在VP 感染方面也存在明顯差異（P＜0.05），但二元Logistic 回歸分析結(jié)果顯示職業(yè)因素并非VP 感染的危險(xiǎn)因素。既往臨床有研究表明，VP 腹瀉病例中工人、農(nóng)民群體的發(fā)病率較高，出現(xiàn)這一情況的原因可能與該類人群所處環(huán)境的衛(wèi)生條件較差、自身經(jīng)濟(jì)收入水平較低、衛(wèi)生管理及食品安全意識較差有關(guān)，但關(guān)于職業(yè)因素對VP 感染的影響效用仍有待展開進(jìn)一步的調(diào)查研究。本資料結(jié)果顯示，VP 感染多發(fā)作于5～10 月，這可能與鎮(zhèn)海區(qū)氣溫環(huán)境有關(guān)，與既往關(guān)于浙江省其他地區(qū)VP 感染因素分析的研究結(jié)論基本一致［8］。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，VP 在30℃～35℃環(huán)境下生長活性明顯升高，因此在每年5～10 月期間，需要相關(guān)市場衛(wèi)生監(jiān)管部門加強(qiáng)衛(wèi)生安全檢查工作，并通過展開各種衛(wèi)生飲食宣教工作來幫助該地居民養(yǎng)成良好飲食習(xí)慣，提高其食品安全意識，強(qiáng)化普通居民對食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)認(rèn)識。

綜上所述，VP 感染是鎮(zhèn)海區(qū)腹瀉病例的主要原因之一，其感染有明顯的季節(jié)性高峰，并可能受到患者年齡、監(jiān)測時間、進(jìn)食水產(chǎn)食品的影響。提高食源性疾病的綜合監(jiān)測質(zhì)量，加強(qiáng)腹瀉病例的VP 菌株檢測，開展有針對性的防病知識宣傳，對于控制本地VP 腹瀉病例疫情具有積極效用。