結(jié)直腸癌中MMR蛋白表達(dá)意義的驗證與研究

陳國群 嵇學(xué)仙 沈苗 毛建英 李斐

結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率已排在全球惡性腫瘤的前3 位，并逐年增高［1］。隨著基因分子生物學(xué)的深入研究，發(fā)現(xiàn)由錯配修復(fù)（MMR）蛋白功能缺陷引起的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制相關(guān)［2］。近年來，由MSI 引起了較多臨床工作者的關(guān)注。由MMR 蛋白功能缺陷引起的高度MSI（MSI-H）在結(jié)直腸癌的指導(dǎo)治療中作用明顯，對其預(yù)后的評估也有重要意義［3-4］。經(jīng)相關(guān)文獻(xiàn)檢測，所有結(jié)直腸癌病例中，有3%～5%的病例與遺傳性結(jié)直腸癌綜合征相關(guān)，其中以Lynch 綜合征最為常見［5］，Lynch 綜合征是一種遺傳性家族性疾病，大部分患者會發(fā)生結(jié)直腸癌，患者及其家族中MMR 基因突變攜帶者，均有發(fā)生腸外多組織癌變的傾向。定期結(jié)腸鏡檢查，對于Lynch 綜合征的家族遺傳傾向患者，可以早期診斷腫瘤并及時進(jìn)行干預(yù)治療［6］。本研究旨在分析MMR 蛋白免疫組化（IHC）檢測與MSI 分子檢測的一致性，以及與臨床多方面的相關(guān)性，并作為Lynch 綜合征的一種常規(guī)篩查手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019 年3 月至2022 年6 月本院病理科結(jié)直腸癌根治術(shù)后經(jīng)病理學(xué)確診，腫瘤為原發(fā)性且術(shù)前未經(jīng)新輔助治療的232 例患者，其中男133 例，女99 例；年齡42～85 歲，平均年齡65 歲。

1.2 方法 對結(jié)直腸癌腫塊標(biāo)本進(jìn)行MMR 蛋白（MLH1、MSH2、MSH6 及PMS2）IHC 檢測，缺失表達(dá)者進(jìn)行分子檢測。本研究經(jīng)由本院倫理委員會及技術(shù)委員會審核通過（2020.10）。（1）IHC：結(jié)直腸癌根治及活檢標(biāo)本離體后，先經(jīng)10%甲醛液固定≥6 h，后脫水機(jī)梯度酒精脫水，石蠟包埋，進(jìn)行連續(xù)切片（切片厚3～4μm），行常規(guī)HE 及IHC EnVision 法染色。一抗采用兔抗人單克隆抗體PMS2、MSH6，鼠抗人單克隆抗體MLH1 和MSH2，抗體向北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司購買，按產(chǎn)品說明步驟進(jìn)行染色。最后由本科兩名主任醫(yī)師進(jìn)行IHC 切片的復(fù)讀。IHC 判讀標(biāo)準(zhǔn)：觀察正常腸腺上皮細(xì)胞及周圍淋巴細(xì)胞等內(nèi)對照細(xì)胞，以細(xì)胞核棕黃/黃色為正常著色的前提下，腫瘤細(xì)胞陽性表達(dá)（+）為核著棕黃/黃色，陰性表達(dá)（-）為腫瘤細(xì)胞核未著色；MLH1、MSH2、MSH6 及PMS2 均呈陽性為MMR 正常蛋白表達(dá)（PMMR，圖1-2），任意一種蛋白表達(dá)缺失則判讀為MMR 蛋白缺失（DMMR）［7］（圖3-4）。（2）分子檢測：MSI 檢測由迪安公司（杭州）采用MSI檢測試劑盒進(jìn)行，采用熒光PCR 擴(kuò)增結(jié)合毛細(xì)管電泳法，檢測NR-21、NR24、BAT-25、BAT-26、MONO-27 五個位點(diǎn)。具體方法：由科內(nèi)2 名病理診斷主治醫(yī)師經(jīng)光鏡下觀察常規(guī)HE 切片選取樣本，腫瘤樣本為腫瘤成分≥20%的腫瘤石蠟包埋組織和對照樣本為石蠟包埋癌旁正常組織；樣本經(jīng)DNA 提取、PCR 擴(kuò)增、毛細(xì)管電泳分離后，分析判定微衛(wèi)星檢測結(jié)果。結(jié)果判定根據(jù)不穩(wěn)定單核苷酸重復(fù)位點(diǎn)個數(shù)，由兩名分子病理醫(yī)師進(jìn)行判讀，≥2 個位點(diǎn)判斷為MSI-H，≤1 個位點(diǎn)判斷為微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定或微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSI-L/MSS）。

圖1 腸癌（MSH2×100）

圖2 腸癌（MSH6×100）

圖3 腸癌（MLH1×100）

圖4 腸癌（PMS2×100）

1.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以n或%表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMR 蛋白及MSI 表達(dá)情況 MMR 蛋白表達(dá)情況：232 例結(jié)直腸癌病例中，＞99%的病例MMR 表達(dá)良好（細(xì)胞核均勻染色），個別病例細(xì)胞核弱染色，但均有內(nèi)對照（淋巴細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞著色）。MMR 總?cè)笔Ю龜?shù)為12 例，表達(dá)缺失率為5.17%，具體情況如下：MLH1（12 例，5.17%）、MSH2（0 例）、MSH6（0 例）、PMS2（12 例，5.17%），MLH1 和PMS2 均為共同表達(dá)。文獻(xiàn)報道4.3%～20.0%的結(jié)直腸癌為DMMR［8-13］，冰島的一項長達(dá)九年對1,182 例結(jié)直腸癌標(biāo)本進(jìn)行MMRIHC 篩查，發(fā)現(xiàn)DMMR 者共132 例，占腸癌的11.2%［14］；來自亞洲人群的一項日本人研究顯示1,234例結(jié)直腸癌病例中，有61 例（4.9%）DMMR 患者［15］。鑒于人種、地域、飲食、氣候的差異，理論上我們應(yīng)該與日本的研究數(shù)據(jù)相符，實(shí)際上也的確如此。DMMR 病例進(jìn)行MSI 分子檢測均提示MSI-H，符合率100%。文獻(xiàn)報道DMMR與高度MSI 一致率＞90%［16-17］，與文獻(xiàn)報道相符。

2.2 DMMR 病例的臨床資料與分析 單因素分析，DMMR 病例與結(jié)直腸癌患者的腫瘤大小、腫瘤分化程度以及UICC 分期具有明顯相關(guān)性，見表1。

表1 232例結(jié)直腸癌患者M(jìn)MR表達(dá)與臨床病理的關(guān)系（n）

2.3 DMMR 病例的臨床追蹤 結(jié)合阿姆斯特丹Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)、修訂版的貝塞斯達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，12 例DMMR 患者中，有1 例高度懷疑為林奇綜合征病例，但因經(jīng)濟(jì)等多方面原因，患者未做林奇綜合征的基因檢測。隨訪過程中，該例患者復(fù)查腸鏡，提示左半結(jié)腸癌，其兄妹及母親行腸鏡檢查，也均檢及管狀腺瘤。故可將該患者列為“林奇綜合征樣”病例，對其家族進(jìn)行隨訪。余11 例DMMR患者中，有4 例患者在術(shù)后兩年隨訪中，腸鏡檢出管狀腺瘤，3 例CT 檢出肺部磨玻璃結(jié)節(jié)，1 例子宮肌瘤，1例前列腺癌。

3 討論

微衛(wèi)星作為一種在復(fù)制過程中長度一般保持不變的具有端重復(fù)單元的DNA，容易在復(fù)制過程中出現(xiàn)錯配。MSI 的發(fā)生即DNA 復(fù)制過程中產(chǎn)生錯配DNA，MMR蛋白無法對其準(zhǔn)確識別并修復(fù)［18-19］進(jìn)而導(dǎo)致的結(jié)果。DMMR 更常見于低分化癌、腫瘤體積較大以及UICC 分期Ⅰ～Ⅱ期患者。目前，臨床診療中發(fā)現(xiàn)，檢測腫瘤MSI 對結(jié)直腸癌的診療和判斷預(yù)后有重要意義，大部分學(xué)者認(rèn)為，MSI-H 提示結(jié)直腸癌患者預(yù)后良好［20］。另外，大多數(shù)研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者M(jìn)SI 可作為5-FU 輔助治療無效的預(yù)測標(biāo)志物［21］。

林奇綜合征是一種由于DNA MMR 基因發(fā)生胚系突變所致的常染色體顯性遺傳病。突變基因攜帶者本人及家族成員最常多發(fā)結(jié)直腸癌，在所有結(jié)直腸癌的所占比例約3%～5%，還會發(fā)生腸外其他多種相關(guān)腫瘤，包括女性發(fā)生子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌，泌尿系腫瘤如膀胱癌、腎癌，消化道腫瘤如胃癌、小腸癌等。攜帶者有較高風(fēng)險終生患結(jié)直腸癌和子宮內(nèi)膜癌，而且普遍在年紀(jì)較輕時發(fā)病，平均診斷年齡分別約為45 歲和46 歲，而普通人群多為中老年發(fā)病。早期發(fā)現(xiàn)診斷林奇綜合征可以通過及時治療降低結(jié)直腸癌患者死亡率并預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)生，降低其發(fā)病率。

因此有效的篩查手段至關(guān)重要，參考美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）推薦使用MSI 或IHC 對所有結(jié)直腸癌患者進(jìn)行林奇綜合征篩查。綜合考慮操作簡便、價格實(shí)惠等因素，病理科會選用IHC 法檢測MMR 蛋白，篩查腫瘤MSI 狀態(tài)。經(jīng)驗證，本研究DMMR 與高度MSI一致率達(dá)到100%。故MMR 蛋白IHC 檢測可作為MSI分子檢測的完美替代品，可以減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，并結(jié)合臨床資料以及結(jié)合阿姆斯特丹Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)、修訂版的貝塞斯達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，可作為林奇綜合征的篩查手段。

最新研究顯示：已被用于多種惡性腫瘤治療的程序性細(xì)胞死亡受體1（PD-1）抗體，對普通人群結(jié)直腸癌患者治療效果不明顯，因結(jié)直腸癌被視為免疫“冷”腫瘤，故而對抗PD-1 治療不敏感。DMMR/MSI-H 的分子特征是篩選免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs）治療患者的重要分子標(biāo)志物［22］。PD-1 免疫檢查點(diǎn)藥物對MSI-H 的CRC 表現(xiàn)出高緩解率，并且在其他MSI-H 晚期腫瘤也對PD-1 治療有較好的療效，包括子宮內(nèi)膜癌、胃癌、膽管癌和小腸癌。2017 年NCCN 臨床實(shí)踐指南更新，推薦PD-1 免疫檢查點(diǎn)藥物用于具有MSI-H 或dMMR 分子表型的mCRC 的治療。因此MSI 可以作為PD-1 免疫檢查點(diǎn)藥物有效性的生物標(biāo)志物。