Cry類和Vip3Aa類Bt殺蟲蛋白對亞洲玉米螟的毒力和增效作用

胡小華 王振營 何康來 解海翠 王月琴

摘要 篩選對靶標害蟲高效的Bt殺蟲蛋白、評價蛋白組合對靶標害蟲的殺蟲作用，對于轉基因抗蟲新品種的研發具有重要的指導意義。本文采用人工飼料混合法評價了Cry1Ab、Cry1Fa、Cry1Ca、Cry1Ba、Cry2Aa、Vip3Aa11、Vip3Aa20、Vip3Aa19共8種Bt殺蟲蛋白對亞洲玉米螟的毒力;同時評估了Cry1Ab/Vip3Aa19、Cry1Fa/Vip3Aa19混合蛋白對亞洲玉米螟的殺蟲作用，篩選出毒力最佳的組合比例。結果表明：Cry1Ab、Cry1Fa、Cry2Aa對亞洲玉米螟的LC50在0.24～0.72 μg/g之間，其中Cry1Ab的毒力最強，顯著高于Cry1Fa和Cry2Aa蛋白，Cry1Fa與Cry2Aa毒力無顯著性差異。Cry1Ca、Cry1Ba、Vip3Aa11、Vip3Aa20、Vip3Aa19對亞洲玉米螟的LC50均大于50 μg/g。當Cry1Ab/Vip3Aa19、Cry1Fa/Vip3Aa19混合比例為1∶1時，增效作用最強，增效因子分別為3.18和1.58。本研究結果為多價轉基因玉米的研發提供了重要依據。

關鍵詞 Bt;?Cry;?Vip3Aa;?亞洲玉米螟

中圖分類號： S 433.4

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2021671

Abstract Selection of Bt toxin with high efficiency and evaluation of insecticidal effects between toxins against target pests is very important for development of new transgenic insect-resistant varieties. We evaluated the toxicities of Cry1Ab， Cry1Fa， Cry1Ca， Cry1Ba， Cry2Aa， Vip3Aa11， Vip3Aa19 and Vip3Aa20 against Ostrinia furnacalis by diet-incorporation bioassay， as well as the possible interaction between Cry1Ab and Vip3Aa19， Cry1Fa and Vip3Aa19 toxins， and select the proportion of the best combination of toxins. The LC50 values of Cry1Ab， Cry1Fa and Cry2Aa ranged from 0.24 to 0.72 μg/g. Among them， Cry1Ab had the highest toxicity， significantly different from Cry1Fa and Cry2Aa， and Cry1Fa and Cry2Aa had no significant difference. The LC50 values for Cry1Ca， Cry1Ba， Vip3Aa11， Vip3Aa20 and Vip3Aa19 were all higher than 50 μg/g. When bioassays were performed with toxin mixture at the ratio of 1∶1， the Cry1Ab/Vip3Aa19 and Cry1Fa/Vip3Aa19 showed synergistic effect， with synergism factors of 3.18 and 1.58， respectively. The above results could be useful for developing of pyramided transgenic maize.

Key words Bacillus thuringiensis;?Cry;?Vip3Aa;?Ostrinia furnacalis

自1996年美國首次批準商業化種植轉基因抗蟲玉米防治歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis以來，轉基因作物在全球范圍內已經連續種植25年。截至2019年，全球26個國家種植了1.904億hm2轉基因作物［1］。轉基因抗蟲作物不僅有效防治了靶標害蟲，減少了殺蟲劑的使用量，而且保護了天敵和生物多樣性，增加了農民的收入［2-4］。然而，轉基因作物的大面積推廣使靶標害蟲長期處于一定的篩選壓力之下，導致田間抗性種群的產生，如亞澳白裙夜蛾Busseola fusca和地中海玉米蛀莖夜蛾Sesamia nonagrioides對Cry1Ab、西部玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgifera 對Cry3Bb1、小蔗螟Diatraea saccharalis 對Cry1F 和Cry1A.105等［5-8］。

第一代轉基因玉米主要表達Cry1Ab蛋白（‘MON810‘Bt11‘Bt176）、Cry1Ac蛋白（‘DBT-418）、Cry1F蛋白（‘TC1507）、Cry9C蛋白（‘CHB-351）;第二代轉基因抗蟲作物是將兩個或者多個基因同時導入同一植株內，用來防治同一種害蟲，達到延緩抗性產生、擴大殺蟲譜的目的［9］。如‘MON89034（表達Cry2Aba/Cry1A.105蛋白）、‘MON88017（表達Cry1Fa/Cry1Ab蛋白）、‘Bt11×MIR162（表達Cry1Ab/Vip3Aa20蛋白）等［10］。選擇蛋白組合時，不僅要考慮蛋白的互補性、蛋白結合受體位點的能力，同時需要考慮蛋白間的協同增效作用或拮抗作用［11］。增效作用能提高防治效力，達到1+1>2 的效果;相反，拮抗作用削弱了聚合多種Bt殺蟲蛋白的優勢，降低防治效果。蛋白之間的相互作用可以通過評價單個蛋白的毒力和蛋白混合物的毒力效果來判斷［12］。

亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis是為害我國玉米的重要害蟲，對玉米生產和農業安全造成嚴重的威脅［13-14］。室內生測表明多種Cry1類蛋白對玉米螟具有較高的毒力，如Cry1Aa、Cry1Ac、Cry1Ah、Cry1Ie［15-17］等;田間抗性鑒定結果表明轉基因抗蟲玉米‘Bt799‘Bt11和‘MON810對亞洲玉米螟有很高的殺蟲效果和良好的田間抗螟性［18-20］。草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda 是世界性重大遷飛害蟲，自2019年1月入侵我國云南省后，進一步蔓延擴散至黃淮海夏玉米主產區，對我國玉米等作物生產安全構成嚴重威脅。室內生測結果表明：轉cry1Ab基因玉米和轉cry1Ab/vip3Aa玉米對草地貪夜蛾具有良好的控制效果［21］。2020年1月21日，國產轉基因抗蟲玉米‘DBN9936（表達Cry1Ab蛋白）和‘瑞豐125（表達Cry1Ab和Cry2Aj蛋白）獲得了在北方春玉米區的生產應用安全證書;2021年1月11日，‘DBN9936擴區審批至黃淮海夏玉米區、西南玉米區、南方玉米區。2021年，農業農村部對轉基因玉米開展了產業化試點。

Cry1Ab、Cry1Fa和Vip3A是目前國際上商業化應用最廣泛的防治鱗翅目害蟲的轉基因抗蟲玉米表達的 Bt 殺蟲蛋白，因此，本文評估了8種殺蟲蛋白（Cry1Ab、Cry1Fa、Cry1Ba、Cry1Ca、Cry2Aa、Vip3Aa11、Vip3Aa19、Vip3A20）和2個組合（Cry1Ab/Vip3Aa19、Cry1Fa/Vip3Aa19）對亞洲玉米螟的毒力，篩選出Cry1Ab和Cry1Fa分別與Vip3Aa19組合的最佳毒力的比例，為多價轉基因玉米的研發提供科學依據。

1?材料與方法

1.1?供試昆蟲

亞洲玉米螟室內敏感種群：原始種群于2015年6月采集自吉林省松原市普通玉米種植田，在室內無瓊脂人工飼料［22］上連續飼養多代，飼養過程中未接觸任何殺蟲劑或Bt殺蟲蛋白。

幼蟲在溫度（27±1）℃、相對濕度70%～80%、光周期L∥D=16 h∥8 h的條件下飼養。

1.2?供試Bt殺蟲蛋白

Cry1Ab、Cry1Fa、Cry1Ca、Cry1Ba、Cry2Aa活化蛋白購自北京樂士寧科技有限公司（由美國Case Western Reserve University的Marianne P. Carey實驗室生產，經胰蛋白酶活化的毒素），純度為98%的白色粉末晶體，均用50 mmol/L、pH=10的Na2CO3溶解。Vip3Aa19、Vip3Aa20分別由北京大北農生物技術有限公司和先正達生物科技有限公司提供，均用1 mmol/L、pH=10的PBS溶解。Vip3Aa11購自美延（北京）農業科技有限責任公司，用1 mmol/L、pH=10的PBS溶解。

1.3?毒力測定

采用人工飼料混合法測定Bt殺蟲蛋白對亞洲玉米螟幼蟲的毒力，人工飼料配方具體參考宋彥英等［22］。主要步驟如下：

1）將Bt殺蟲蛋白設置6～9個濃度梯度，保證幼蟲死亡率在10%～90%。Cry1Ab和Cry1Fa的濃度設置為0、0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5 μg/g;Cry2Aa的濃度設置為0、0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、12.5、25.0 μg/g;Cry1Ba、Cry1Ca、Vip3Aa11、Vip3Aa19、Vip3Aa20的濃度設置為0、0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、12.5、25.0、50.0 μg/g。

2）混合蛋白與飼料。將對應劑量的蛋白加入蒸餾水中，混合均勻后與無瓊脂半人工干粉飼料攪拌混勻，同時設置蒸餾水作為空白對照。

3）接入幼蟲并封口。將混合均勻的人工飼料分裝到 48孔培養板中，每孔用毛筆挑入1頭初孵幼蟲（孵化時間＜12 h），每個蛋白濃度3個重復，每個重復48頭，共144頭。然后用封口膜覆蓋（Cat# 3M-9733， Minnesota Mining and Manufacturing Company， Minnesota， USA），防止試蟲逃逸。并用解剖針扎孔，保證空氣流通，避免濕度太大造成幼蟲死亡。

4）飼養并調查結果。將所有培養板放置在溫度（27±1）℃、相對濕度70%～80%、光周期L∥D=16 h∥8 h的培養箱內，飼養期間無需更換或添加飼料，7 d后調查試驗結果，記錄每板幼蟲死亡數量。幼蟲死亡評判標準：用毛筆輕觸蟲體尾部，蟲體無反應或單頭存活幼蟲體重＜0.1 mg。

1.4?數據統計與分析

用對數-幾率值法模擬劑量-死亡率反應曲線，統計計算過程采用PoloPlus Probit軟件。根據95%置信區間判斷差異性，如果置信區間有重疊，則無顯著差異;如果置信區間無重疊，則有顯著差異。

通過比較實際死亡率和預期死亡率，評價Cry類和Vip3A類蛋白間的相互作用。預期死亡率是在兩種蛋白間不存在相互作用且獨立發揮作用的假設下得到的死亡率［23］。根據Tabashnik的方法［11］：

LC50（m）=1raLC50（a）+rbLC50（b）

其中，LC50（m）：混合蛋白預期致死中濃度;LC50（a）和LC50（b）分別是蛋白a和蛋白b對靶標害蟲的致死中濃度;ra和rb分別是a蛋白和b蛋白在混合蛋白中的比例。增效因子（synergism factor，SF）按如下公式計算：

SF=LC50（m）LC50

其中，LC50為混合蛋白對靶標害蟲的實際致死中濃度。當SF>1時，表現為增效作用;當SF=1時，表現為疊加作用;當SF＜1時，表現為拮抗作用。

2?結果與分析

2.1?8種Bt殺蟲蛋白對亞洲玉米螟的毒力

8種Bt殺蟲蛋白對亞洲玉米螟幼蟲的毒力測定結果如表1所示。LC50從0.24 μg/g到大于50 μg/g，其中Cry1Ab對亞洲玉米螟的毒力最強，LC50僅為0.24 μg/g。Cry1Fa和Cry2Aa對亞洲玉米螟的毒力顯著低于Cry1Ab，LC50分別為0.52 μg/g和0.72 μg/g，但是兩種蛋白的毒力不存在顯著差異。Cry1Ba、Cry1Ca、Vip3Aa11、Vip3Aa19、Vip3Aa20對亞洲玉米螟的致死效果差，LC50均大于50 μg/g （表1）。

2.2?Cry1Ab和Vip3Aa19蛋白混合后對亞洲玉米螟的毒力

為了進一步明確Cry1Ab和Vip3Aa19之間的相互作用，評價了兩種蛋白在不同混合比例下對亞洲玉米螟初孵幼蟲的毒力，結果見表2。當Cry1Ab和Vip3Aa19混合的比例分別為1∶1和1∶2時，SF分別為3.18和1.32，均大于1，表明存在增效作用。其他比例組合的實際LC50均高于預期LC50，SF值范圍為0.49～0.96，說明存在一定的拮抗作用。

2.3?Cry1Fa和Vip3Aa19蛋白混合對亞洲玉米螟的毒力

Cry1Fa/Vip3Aa19在不同混合比例下對亞洲玉米螟初孵幼蟲的毒力測定結果表明：當Cry1Fa/Vip3Aa19混合比例為1∶1和1∶2時，實際LC50均低于預期LC50，SF分別為1.58和1.32，均大于1，存在較弱的增效作用。當兩種蛋白的混合比例為5∶1時，SF為1，表現為簡單的相加作用。當兩種蛋白的混合比例為2∶1和1∶5時，SF均小于1，說明存在一定的拮抗作用（表3）。

3?結論與討論

不同Bt殺蟲蛋白的殺蟲譜不同，且對靶標害蟲的毒力不同。因此，在研發轉基因作物時，有必要評估不同Bt殺蟲蛋白對靶標害蟲的毒力。本文采用飼料混合法評價了8種Bt殺蟲蛋白對亞洲玉米螟的毒力，其中Cry1Ab對玉米螟初孵幼蟲的毒力效果最好，顯著高于另外7種蛋白。Cry1Ab除了對亞洲玉米螟具有較強的毒力外，對其他鱗翅目害蟲也具有較強的毒力，包括歐洲玉米螟、小菜蛾Plutella xylostella、草地貪夜蛾等［24-26］。1996年，以歐洲玉米螟和巨座玉米螟D.grandiosella為靶標害蟲的轉單價Bt玉米在美國商業化種植，包括轉cry1Ab玉米（‘Bt11‘MON810）和轉cry1Ac玉米（‘DBT-418）［9］。2002年，為了擴大殺蟲譜、延緩抗性產生，美國和澳大利亞率先批準種植轉雙價基因棉花‘Bollgard II（表達Cry1Ac/Cry2Ab蛋白）防治美洲棉鈴蟲 Helicoverpa zea 和棉鈴蟲H.armigera。2011年，阿根廷開始種植‘Bt11×MIR162，主要防治草地貪夜蛾、小蔗螟等鱗翅目害蟲［8，27-28］。前期研究結果表明，Vip3Aa對黏蟲Mythimna separata、草地貪夜蛾、粉紋夜蛾Trichoplusia ni、煙芽夜蛾Heliothis virescens等鱗翅目害蟲均具有較好的毒力［29-31］，本研究結果顯示Cry1Ba、Cry1Ca、Vip3Aa對亞洲玉米螟沒有毒力，可能是因為這些蛋白在玉米螟幼蟲中腸上不存在相應的特異性結合位點。但是Vip3Ca對亞洲玉米螟敏感品系和Cry1Ab抗性品系均具有很好的毒力［32］。該試驗結果為新基因的挖掘、轉基因作物的研發提供了重要的參考信息。

隨著轉基因作物的不斷推廣，靶標害蟲的抗性問題引起越來越多的重視。但在選擇多個基因疊加時，不僅要考慮單個基因的毒力，還要考慮蛋白之間的相互作用［11， 33］。多個研究表明，當Cry類和Vip類蛋白混合時，存在增效、拮抗或者疊加作用。Bergamasco等［34］報道了Cry1Ia10和Vip3Aa相互作用的物種特異性。體外競爭結合試驗表明，在草地貪夜蛾體內，Cry1Ia10和Vip3Aa具有不同的結合位點，表現為增效作用。在灰翅夜蛾S.eridania體內，兩種蛋白競爭結合同一個受體位點，表現為明顯的拮抗作用［34］。Cry9Aa和Vip3Aa蛋白在水稻二化螟Chilo suppressalis體內存在特異性結合并具有不同的受體結合位點是協同增效作用的主要因素［35］。本研究發現當Cry1Ab和Vip3Aa19、Cry1Fa和Vip3Aa19為1∶1混合時，表現為增效作用，表明共表達兩種蛋白將提高轉基因作物對亞洲玉米螟的防治效果，延緩抗性的產生。Vip3Aa和Cry1Ab對草地貪夜蛾具有顯著的增效作用［36］;Cry1Fa和Vip3Aa19對黏蟲亦有顯著的增效作用［30， 37］。除了受體位點的不同，蛋白間氨基酸序列的差異也可能是產生增效作用的原因［38］。同種蛋白組合的相互作用可能因為受試靶標的不同而不同。比如Cry1Ca 和Vip3Aa對草地貪夜蛾表現為拮抗作用，而對小蔗螟表現為增效作用。

不同蛋白組合的增效作用是提高蛋白毒力的方法之一。評價混合蛋白的相互作用，利用啟動子調控Bt殺蟲蛋白的表達量，可以最大程度地提高轉基因作物的抗蟲作用，實現轉基因作物與Bt生物資源的可持續利用。本研究結果將為中國的轉基因玉米研發提供基礎數據，促進轉基因玉米的可持續應用。

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（責任編輯：田?喆）