多花黃精炭疽病病原菌鑒定

但雨柔 劉銘 崔馨燕 馬萬里 湯子萱 尹福強

摘要 炭疽病是多花黃精最嚴重的病害之一。本研究從重慶市萬州區(qū)采集疑似為炭疽病的多花黃精病葉，分離培養(yǎng)獲得了培養(yǎng)性狀不同的2株炭疽菌，致病性測定表明這2株菌株都可引起多花黃精炭疽病;利用核糖體內轉錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）、肌動蛋白（ACT）、幾丁質合成酶（CHS-1）和β-微管蛋白（TUB）基因進行多基因系統發(fā)育分析，發(fā)現這2株菌株分別與松針炭疽菌Colletotrichum fioriniae和博寧炭疽菌C.boninense聚在一起，形成明顯分支。結合形態(tài)學特點，確定引起多花黃精炭疽病的病原菌為松針炭疽菌C.fioriniae和博寧炭疽菌C.boninense。其中松針炭疽菌C.fioriniae引起黃精炭疽病是首次報道。

關鍵詞 多花黃精;?分離鑒定;?多基因系統發(fā)育分析;?松針炭疽菌;?博寧炭疽菌

中圖分類號： S 432.1

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2021699

Abstract Anthracnose is one of the most serious diseases on Polygonatum cyrtonema. Two strains were isolated from leave samples with symptoms of anthracnose of P.cyrtonema collected from Wanzhou， Chongqing. Following infection assay on the plant suggested that both strains were the pathogenic agents that were identified as Colletotrichum fioriniae and C.boninense based on morphological， cultural characteristics and phylogenetic analyses of internal transcribed space （ITS）， actin （ACT）， chitin synthase 1（CHS-1） and β-tubulin （TUB） gene. And this is the first description of C.fioriniae pathogen responsible for P.cyrtonema anthracnose.

Key words Polygonatum cyrtonema;?isolation and identification;?multiple-gene phylogenetic analysis;?Colletotrichum fioriniae;?Colletotrichum boninense

多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua是天門冬科Asparagaceae黃精屬Polygonatum的多年生草本植物，是2015版《中國藥典》收錄的黃精屬3個種中的1個，主要分布于重慶、四川、云南、貴州、湖南、浙江等地［1］。多花黃精藥食同源，具有補氣益腎、安五臟、潤心肺之功效，是數十種復方滋補藥劑的重要組成成分，市場前景廣闊。多花黃精喜溫暖濕潤的環(huán)境，稍耐寒，怕干旱，海拔500～600 m最適宜其生長。

多花黃精是重慶市脫貧攻堅期間引進的主要中藥材之一，目前在渝東北、渝東南多區(qū)縣廣泛種植，種植面積超過700 hm2。隨著多花黃精栽培面積的不斷擴大，各種病害的發(fā)生也日益加重，尤其是炭疽病，重病區(qū)隨機選取100株，發(fā)病率達70%，嚴重影響了多花黃精的產量及品質。炭疽菌寄主范圍廣泛，變異豐富。引起多花黃精、滇黃精Polygonatum kingianum和雞頭黃精Polygonatum sibiricum炭疽病的病原菌主要有膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides［2］、果生炭疽菌C.fructicola［2］、博寧炭疽菌C.boninense［2］、尖孢炭疽菌C.acutatum［2］、滇黃精炭疽菌C.kingianum［3］和C.spaethianum［4］。本研究利用ITS、ACT、CHS-1和TUB構建多基因聯合系統發(fā)育樹，并結合形態(tài)學鑒定萬州多花黃精炭疽病病原菌，旨在為該病的診斷和防治提供理論依據。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?病葉采集

2021年5月于重慶市萬州區(qū)龍駒鎮(zhèn)花坪村多花黃精種植基地采集病葉，觀察并記錄其發(fā)病部位與病斑特點。

1.1.2?分子鑒定所用引物

擴增真菌DNA核糖體內轉錄間隔區(qū)（internal transcribed spaces，ITS）、肌動蛋白（actin，ACT）、幾丁質合成酶（chitin synthase，CHS-1）和微管蛋白（β-tubulin，TUB）基因的引物（表1）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2?病原菌的分離純化

采用常規(guī)組織分離法從帶有典型癥狀的病葉上分離病原菌［8］。對分離的病原菌進行單孢純化［9］，并轉移至PDA試管斜面培養(yǎng)基上，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3?病原菌的致病性測定

選取3株健康多花黃精植株，用滅菌的接種針在上部葉片主脈兩側對稱地各穿刺1次，將直徑5 mm的菌餅接種于葉片上，菌落正面緊貼葉片一側穿刺處，同時另一側穿刺處接種相同規(guī)格的無菌PDA作為對照，接種后用保鮮膜包裹接種處;接種后將盆栽多花黃精置于28℃保濕培養(yǎng)，觀察記錄發(fā)病情況，待接種葉片發(fā)病后從發(fā)病部位重新分離病原菌，并觀察是否與接種菌株一致。

1.4?病原菌鑒定

1.4.1?形態(tài)學鑒定

將分離純化的菌株接種至PDA平板上，置于培養(yǎng)箱中在28℃，L∥D=12 h∥12 h條件下恒溫培養(yǎng)7 d，觀察并記錄菌落形態(tài);待其產孢后，挑取少量孢子制作玻片顯微觀察，并隨機選取50個分生孢子測量孢子大小。依據《真菌鑒定手冊》中描述的病原菌形態(tài)對其進行形態(tài)學鑒定［10］。

1.4.2?多基因聯合鑒定

使用植物基因組DNA提取試劑盒（DP305，購自天根生化（北京）科技有限公司）提取代表菌株A1，A2的DNA。采用表1引物對菌株進行PCR擴增。PCR反應體系總體積為40 μL，包括2×ES PCR Master Mix 20 μL ［K1071，生工生物工程（上海）股份有限公司］，ddH2O 15 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.8 μL，模板DNA 3.4 μL。反應程序如下，ITS：95℃預變性2 min;95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，33個循環(huán);72℃延伸10 min。ACT：95℃預變性5 min;95℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，33個循環(huán);72℃延伸5 min。CHS-1與TUB程序相同：94℃預變性5 min;94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán);72℃延伸10 min。以ddH2O替代模板DNA作為陰性對照。

PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將獲得的序列純化后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測得的序列在NCBI（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）上使用BLAST進行序列比對和同源性分析，下載相似性高的序列及其相應的模式菌株序列（表2），使用TBTools軟件和PhyloSuite軟件對模式菌株以及A1、A2菌株的序列按照 ITS-ACT-CHS-TUB 的順序進行編輯和串聯，以甘薯黑痣病菌Monilochaetes infuscans（CBS 869.96）作為外群，使用 MEGA X軟件按照 neighbor joining法構建系統發(fā)育樹，bootstrap 設定為1 000。

2?結果與分析

2.1?多花黃精炭疽病癥狀、病原菌分離及致病性測定

多花黃精炭疽病主要危害中上部葉片，4月－5月開始發(fā)病，9月－10月尤為嚴重。發(fā)病初期，在葉片中間或邊緣出現圓形或不規(guī)則小斑，隨著病情發(fā)展，病斑逐漸擴大，病斑中央變?yōu)楹稚踔涟枷荽┛祝▓D1a）。通過組織分離法得到108株菌株，根據培養(yǎng)性狀分為兩種類型，分別命名為A1、A2，其中A1類型64株，A2類型44株。單孢純化后保存于重慶三峽學院生物與食品工程學院。

盆栽的健康多花黃精葉片刺傷接種A1菌株后5 d，圍繞穿刺孔出現淺褐色病斑，與自然發(fā)病病斑相似，后期病斑干枯;A2菌株導致的癥狀與A1菌株相似，但相較于A1菌株，接種后發(fā)病速度較慢，病斑較小（圖1）。對照無病癥病斑。兩個菌株再分離得到的菌株菌落、顯微特征均與接種菌株相同。

2.2?分離菌株的鑒定

2.2.1?分離菌株的形態(tài)學特征

從病葉上分離得到兩種不同形態(tài)的菌株，A1菌株菌落正面產生白色氣生菌絲且蓬松（圖2a），背面邊緣橘黃色，中央橘紅色（圖2b）。菌絲平均生長速率為11.71 mm/d。顯微鏡下分生孢子單孢，透明，圓柱狀，兩端鈍圓（圖2c）。分生孢子大小為（11.72～12.87） μm × （3.90～4.30） μm，平均12.36 μm?×4.08 μm （n=50）。A2菌株菌落正面產生較少氣生菌絲，菌落中間出現白色顆粒狀（圖2d），背面為白色菌絲，中間灰黑色且有一圈灰黑色顆粒（圖2e）。菌絲平均生長速率為10.14 mm/d。顯微鏡下分生孢子單孢，透明，圓柱狀， 基部平截呈臍狀（圖2f）。分生孢子大小為（10.18～13.97） μm × （4.10～5.10） μm，平均12.25 μm ×4.57 μm（n=50）。根據病原菌上述的形態(tài)特征，初步鑒定為炭疽菌屬的兩個不同種。

2.2.2?分離菌株的多基因系統發(fā)育分析

分離菌株的ITS、ACT、CHS和TUB基因序列的GenBank登錄號分別為OK0661018（A1-ITS）、OL439942（A1-ACT）、OL439944（A1-CHS）、OL439946（A1-TUB）、OK662384（A2-ITS）、OL439943（A2-ACT）、OL439945（A2-CHS）和OL439947（A2-TUB）。在基于多基因構建的系統進化樹中（圖3），菌株A1與Colletotrichum fioriniae（菌株號LF603）聚為一個獨立的進化支，支持率為98%;菌株A2與Colletrichum boninense（菌株號PL1p）聚為一個獨立的進化支，支持率為100%。確定菌株A1為松針炭疽菌C.fioriniae，A2為博寧炭疽菌C.boninense。

3?結論與討論

炭疽菌寄主范圍廣泛，復合種復雜。本研究通過分離鑒定，結合形態(tài)學及多基因系統發(fā)育樹分析，將引起重慶市多花黃精炭疽病的病原菌鑒定為松針炭疽菌Colletotrichum fioriniae和博寧炭疽菌C.boninense，其中C.fioriniae引起黃精炭疽病是首次報道。

C.fioriniae是尖孢炭疽復合種Colletotrichum acutatum complex中的成員。1965年，澳大利亞的Simmonds在研究番木瓜腐爛病時分離到一種病原菌，將其命名尖孢炭疽菌C.acutatum［11］。2008年Marcelino等［12］首次發(fā)現C.fioriniae。C.fioriniae能夠引起芍藥Paeonia lactiflora［13］、黃緬桂Michelia champaca［14］等的炭疽病，但此前未見其引起黃精炭疽病的報道。

C.boninense最初屬于C.gloeosporioides的廣義種范疇［15-16］，Moriwaki等［17］利用基因系統分析發(fā)現C.boninense可進化為一個新的分支，從而將C.boninense鑒定為一個新的引起炭疽病的病原菌。C.boninense可引起多種中藥材的炭疽病，包括滇黃精［3］、鉤藤Uncaria rhynchophylla［18］、黃連Coptis chinensis［19］等，給中藥材生產帶來極大影響。

據報道，能夠侵染滇黃精的炭疽菌較多，包括膠孢炭疽菌、果生炭疽菌、博寧炭疽菌和尖孢炭疽菌等［2］，但防治過程中一般并不區(qū)分其致病菌種屬。除常規(guī)農業(yè)防治和物理防治外，也可選用咪鮮胺、多菌靈、氟硅唑、戊唑醇、己唑醇、咪鮮胺·三唑酮等化學藥劑進行噴霧防治［18，20］。

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（責任編輯：田?喆）