苜蓿花葉病毒ELISA檢測方法的建立及其在大豆病毒調查和抗性資源鑒定中的應用

戰笑蕾 王馨玥 李小宇 張春雨 劉建青 王晨 王斌 梁雨欣 王永志 程曉非

摘要 苜蓿花葉病毒（alfalfa mosaic virus， AMV）是一種世界性分布、宿主范圍廣、具有嚴重危害性的植物病毒，能引起大豆的嚴重病害。本研究利用原核表達的AMV CP蛋白制備的抗血清，建立了高效、準確的AMV間接ELISA檢測方法，并應用于病害調查和抗性鑒定，結果表明制備的3份抗血清對重組蛋白和AMV感染的大豆植物粗提液的效價均達到256 000倍，血清特異性分析結果顯示3份抗血清僅識別感染AMV的大豆葉片，不識別感染大豆花葉病毒（soybean mosaic virus， SMV）的大豆葉片。通過建立的AMV間接ELISA與常規RT-PCR同時對采集的50份疑似感染AMV的大豆樣品進行檢測，有46份樣品檢測結果一致，符合率達92%。利用建立的AMV ELISA方法和課題組已建立的SMV ELISA方法對吉林省大豆主產區的大豆樣品進行病毒檢測的結果表明，病毒檢出率為38.30%，SMV的檢出率達30.85%，AMV的檢出率達17.06%，復合侵染率為9.61%。對接種AMV的40個大豆品種進行抗性鑒定，結果顯示40份大豆全部感染AMV，但是病毒載量存在差異，部分品種表現出AMV抗性，其中大豆抗性資源11份，首次發現AMV造成的大豆病害已經成為吉林省大豆的主要病害之一。

關鍵詞 大豆;?苜蓿花葉病毒;?抗性鑒定;?間接ELISA

中圖分類號： S 431.14

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022011

Abstract Alfalfa mosaic virus （AMV） is a plant virus with worldwide distribution， wide host range， and serious harmfulness， which causes serious disease in soybean. In this study， the antiserum prepared by prokaryotic expression of AMV CP protein was used to establish an efficient and accurate indirect ELISA method for detection of AMV， which was applied to disease investigation and resistance identification. The results showed that the titers of the prepared three antiserums against recombinant protein and crude extract of soybean plants infected with AMV reached 256 000 times. Serum specificity analysis showed that the three antiserums only recognized AMV infected soybean leaves and did not recognize soybean mosaic virus （SMV） infected soybean leaves. A total of 50 soybean samples suspected to be infected with AMV were simultaneously detected by the established AMV indirect ELISA and conventional RT-PCR methods. The detection results of 46 samples were consistent， and the coincidence rate was 92%. The established AMV ELISA method and SMV ELISA method were used to detect the virus in soybean samples from the main soybean producing areas in Jilin province. The results showed that the detection rate of virus was 38.30%， the positive rate of SMV was 30.85%， the positive rate of AMV was 17.06%， and the composite infection rate was 9.61%. Resistance identification of 40 soybean varieties inoculated with AMV showed that all 40 soybean varieties were infected with AMV， but the viral load was significantly different. Some varieties showed AMV resistance， including 11 soybean resistant resources. The soybean disease caused by AMV had become one of the main diseases of soybean in Jilin province for the first time.

Key words soybean;?alfalfa mosaic virus;?resistance identification;?indirect ELISA

大豆是我國重要的糧食作物，2019年中央1號文件正式提出實施大豆振興計劃［1］。吉林地區的氣候與土壤為大豆提供了良好的生長發育環境，一直以來都是我國大豆種植的主產區。已知能夠侵染大豆的病毒有50種以上，其中大豆花葉病毒（soybean mosaic virus， SMV）和苜蓿花葉病毒（alfalfa mosaic virus， AMV）是危害吉林省大豆質量與產量的主要病毒。SMV隸屬于馬鈴薯Y病毒科Potyviridae馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus，是引起大豆花葉病的主要病原，在世界各地的大豆產區均有發生。該病毒于1915年在美國康涅狄格州首次被發現，自然條件下可造成10%到50%的減產，損失最高可達94%。AMV屬于雀麥花葉病毒科Bromoviridae苜蓿花葉病毒屬Alfamovirus，是一種世界性分布的病毒［2］。該病毒于1931年在美國的紫花苜蓿中首次被發現，此后在亞洲、非洲、南美、北美相繼被報道［3］。AMV能夠侵染51科430多種雙子葉植物，其中包括豆科和茄科等許多重要經濟作物，主要通過蚜蟲以非持久方式進行傳播，也可以汁液摩擦傳播，在某些植物中還能通過種子傳毒［4］。AMV造成的癥狀從隱蔽到嚴重不等，主要表現為花葉、皺縮、黃化和環斑畸形等，是一種具有嚴重危害性的植物病毒［5-8］。目前尚無有效治療病毒病的藥劑，高效、精準的病毒檢測技術是該病害防治的前提。

AMV的基因組全長約為8 300 nt，由3條正義單鏈RNA組成，根據長度分別命名為RNA1、RNA2和RNA3［9］。RNA1編碼的P1蛋白的N-末端有類似轉甲基酶的區域，C-末端有類似解旋酶的區域;RNA2編碼的P2蛋白有依賴于RNA復制的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase， RdRp），兩者共同構成了AMV的復制酶。RNA3含有2個開放閱讀框，編碼病毒的運動蛋白（movement protein，MP）和24 kD的病毒衣殼蛋白（coat protein， CP）。MP位于RNA3的5′末端，由RNA3直接翻譯，CP位于RNA3的3′末端，通過亞基因組RNA4翻譯［10-12］。研究發現，除了病毒粒子組裝外，CP還在細胞間運動、復制和促進病毒翻譯中起著重要的作用［13-14］。目前植物病毒檢測技術主要以分子生物學檢測和血清學檢測為主。對AMV的檢測主要以CP為靶標，序列比對表明，不同AMV株系的CP在核苷酸水平上的一致性為93%～99%，在氨基酸水平上的一致性為92%～100%［2，15-16］。具有高特異性、高靈敏度的RT-PCR是近年來應用于AMV研究的分子生物學檢測技術，有學者通過CP保守區設計特異性引物建立不同作物AMV的檢測方法［5，17-19］。RT-PCR需要專業人員與設備，成本較高且操作復雜，不適用于基層高通量的田間樣品檢測［17］。基于血清學的ELISA（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）檢測技術，具有成本低、操作簡單等優點。韓俊麗等利用美國生產的AMV三抗夾心ELISA法（TAS-ELISA）成功檢測到AMV［20］。Ahoonmanesh等利用兔和雞的抗體建立了檢測AMV的雙抗夾心ELISA法，該方法還可用于蚜蟲傳播病毒的研究［21］。

目前國內AMV的ELISA檢測主要依賴于進口試劑盒，本研究首次以AMV的大豆中國分離物衣殼蛋白為抗原，通過免疫動物，獲得AMV大豆分離物的抗體，建立了大豆AMV間接ELISA檢測方法，首次對吉林省大豆進行AMV流行病學調查，發現AMV已經成為吉林省大豆的主要病害之一。初步應用于大豆種質資源的AMV抗性分析，鑒定大豆抗性資源11份，為抗病育種和抗病機理的研究提供技術支持。

1?材料與方法

試驗于2020年至2021年在吉林省農業科學院植物保護研究所微生物重點實驗室和東北農業大學農學院完成。

1.1?材料

供試材料：感染AMV的大豆及苜蓿葉片、pET-28a載體、Top10感受態菌株、BL21（Plyss）表達菌株均由吉林省農業科學院實驗室保存;40份黑龍江大豆品種由東北農業大學農學院保存。

1.2?主要試劑及儀器

主要試劑：6×His標簽單克隆抗體購自生工生物工程（上海）股份有限公司;限制性內切酶、DNA聚合酶購自安諾倫（北京）生物科技有限公司;TRIzol試劑盒、1st Strand cDNA Synthesis Kit購自大連寶生物公司（TaKaRa）;DAB顯色試劑盒、TMB顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;EasyFusion Assembly Master Mix同源重組克隆試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司;Ni2+離子親和層析柱購自美國GE公司;無內毒素質粒小提中量試劑盒購自天根生化科技 （北京）有限公司;HRP標記的兔抗鼠IgG抗體和弗氏佐劑購自美國Sigma-Aldrich公司。

主要儀器：洗板機、酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司;高速冷凍臺式離心機（CT15RE型）購自日本日立公司。

1.3?AMV CP基因克隆及同源性分析

采用TRIzol法從感染AMV的大豆葉片及苜蓿葉片中提取總RNA，根據1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書合成cDNA，并以其為模板，根據AMV CP基因保守序列設計特異性引物：AMV-CPs（5′-AGG-AGATATACCATGGGAAGTTCTTCACAAAA-GAAAGCTGGTG-3′）和AMV-CPa（5′-GGTGGTGGTGCTCGAGATGACGATCAAGATCGTCAGC-3′）;以cDNA為模板，利用合成的特異性引物進行PCR擴增，PCR擴增采用10 μL反應體系：Premix Ex TaqTM 5 μL、cDNA 1 μL、10 μmol/L正反向引物各0.5 μL、ddH2O 3 μL。PCR反應體系：94℃預變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環;72℃延伸10 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送往吉林省庫美科技有限公司測序驗證。利用Clustal X軟件對2種不同來源的AMV CP的氨基酸序列進行比對分析。

1.4?重組蛋白的表達與純化

通過同源重組法將AMV CP基因與pET-28a載體連接，構建pET-28a-AMV重組載體，轉化DH5α感受態細胞，挑取單菌落后擴大培養，提取重組質粒測序驗證。將構建成功的pET-28a-AMV轉入大腸桿菌BL21 Rossetta表達感受態細胞，挑取單菌落擴大培養，當OD600值為0.5～0.6時，IPTG誘導3 h，12 000 r/min離心20 min，棄上清，去離子水重懸菌體，超聲裂解后分別收集上清和菌體，SDS-PAGE電泳檢測，鑒定重組蛋白表達情況，通過8 mol/L尿素溶解包涵體蛋白，經Ni2+親和層析柱得到純化的AMV CP蛋白。純化后的蛋白進行Western blot鑒定：重組蛋白進行SDS-PAGE電泳，一抗采用6×His標簽單克隆抗體，二抗采用辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG，DAB顯色液顯色。

1.5?抗血清的制備及特異性分析

純化后的AMV CP蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合，充分乳化后對昆明鼠進行基礎免疫，采用肌肉注射，每次每只小鼠免疫50 μg的重組蛋白，每隔2周以蛋白加等體積弗氏不完全佐劑加強免疫3次后尾部采血，通過間接ELISA對抗血清效價進行檢測。

通過Western blot方法對制備的AMV抗血清進行特異性分析，將檢測的大豆葉片用10 mL 0.01 mol/L PBS研磨后提取上清，進行SDS-PAGE電泳，一抗使用制備的AMV 抗血清，二抗采用辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG，DAB顯色液顯色。

1.6?間接ELISA檢測方法的建立及應用

1.6.1?間接ELISA檢測方法的建立

碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋AMV CP蛋白至2 μg/mL后100 μL/孔包被酶標板，4℃靜置過夜;加入5%脫脂奶280 μL/孔，37℃封閉1 h;檢測抗體用5%脫脂奶稀釋后加入酶標板，100 μL/孔，搖床65 r/min，37℃孵育1 h;酶標抗體用5%脫脂奶稀釋后加入酶標板，100 μL/孔，搖床65 r/min，37℃孵育1 h，以上每一步結束后，PBST洗滌6次;加入TMB顯色液100 μL/孔，避光顯色8～10 min，以2 mol/L H2SO4溶液為終止液50 μL/孔終止顯色;酶標儀測定OD450處吸光度值，根據公式：檢測樣品OD450（P值）/陰性對照OD450（N值）≥ 2.1判定檢測結果為陽性。

以上試驗每孔設置3個平行，同時設置陽性（感染AMV的大豆葉片）、陰性（健康的大豆葉片）、空白（去離子水）3個對照。

1.6.2?靈敏度檢測

將AMV CP蛋白從1 000 ng/mL等比稀釋至7.812 5 ng/mL，運用建立的檢測方法對其進行檢測，建立間接ELISA靈敏度曲線，并得出最低檢測限。

1.6.3?樣品檢測

對田間采集的50份疑似感染AMV的大豆樣品進行檢測，分別將健康的大豆葉片、疑似感染AMV的大豆葉片按1∶10（m/V，g/mL）比例加入碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）研磨后取上清100 μL/孔，包被酶標板，運用建立的間接ELISA方法和RT-PCR方法進行驗證。AMV特異性引物：AMV CPs（5′-ATGAGTTCTTCACAAAAGAAAGCTGG-3′）和AMV CPa（5′-ATGACGATCAAGATCGTCAGCTTC-3′），按1.2中步驟進行PCR擴增，對比兩種方法的檢測結果，驗證其準確性。

1.7?吉林省大豆SMV病毒和AMV病毒感染情況調查

2021年8月，在吉林省公主嶺市、遼源市、撫松市、敦化市和資源區5個地區選擇連片地塊面積在1 hm2以上的生產田為代表，采用五點取樣法隨機采集大豆樣品，經液氮速凍后置于-80℃冰箱保存。利用建立的AMV間接ELISA檢測方法和實驗室已建立的SMV間接ELISA檢測方法［22］對大豆樣品進行檢測，分析不同地區大豆植株的病毒感染情況。

1.8?不同大豆品種的AMV抗性評價

取感染AMV的大豆葉片加入PBS（pH 7.4）進行研磨，12 000 r/min 離心3 min，取上清液。在種植的40個不同品種的大豆葉片上噴灑500目金剛砂，吸取100 μL病毒液滴在噴灑金剛砂的葉片上，用手指輕輕涂抹3～5次，摩擦接種3 min后用清水沖洗接種葉，再覆蓋一層濕紙巾保濕。觀察葉片發病情況，接種21 d后，取新生葉片進行間接ELISA檢測，分析不同品種大豆的感染情況。

以上試驗每孔設置3個平行，同時設置陽性（感染AMV的大豆葉片）、陰性（健康的‘威廉姆斯10號大豆）、空白（去離子水）3個對照。

2?結果與分析

2.1?AMV CP蛋白的表達與鑒定

PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現在694 bp左右有一條特異性條帶，與AMV CP基因大小相符合，經測序后確定為AMV CP基因，CP蛋白序列對比結果表明（圖1），來源于大豆的AMV與來源于苜蓿的AMV CP序列同源性為96%，有4個氨基酸殘基不同。

將成功構建的pET-28a-AMV轉入表達菌Rossetta中，擴大培養后經IPTG誘導，分別取誘導前、后的菌體及純化后的AMV CP蛋白進行SDS-PAGE電泳鑒定，如圖2a所示，在25 kD左右有一條特異性的條帶，與預期大小一致，以包涵體形式表達。Ni2+離子親和層析柱對目的蛋白純化后進行SDS-PAGE電泳鑒定，在25 kD左右觀察到單一的目的條帶，證明已得到高純度的目的蛋白。純化后的蛋白進行Western blot鑒定，在25 kD左右有一條清晰的特異性條帶（圖2b），證明純化后的重組蛋白為AMV CP蛋白。

2.2?抗血清效價及特異性分析

分別以AMV CP重組蛋白和感染AMV的大豆葉片粗提物為抗原包被酶標板，將免疫4次后獲得的抗血清梯度稀釋，采用間接ELISA檢測方法對抗血清的效價進行檢測，結果如圖3所示，制備的3份AMV抗血清檢測AMV CP蛋白和AMV感染大豆葉片蛋白粗提物，效價均能達到256 000倍。

通過Western blot檢測對制備的AMV抗血清進行特異性分析，如圖4所示，制備的AMV抗血清能夠特異性識別感染AMV的不同品種的大豆葉片;不識別感染大豆花葉病毒soybean mosaic virus（SMV）的大豆葉片，說明制備的AMV抗血清特異性良好。

2.3?間接ELISA檢測方法靈敏度

將AMV CP蛋白等比稀釋，運用建立的間接ELISA檢測方法進行檢測，如圖5所示，以AMV CP蛋白濃度為橫坐標，P/N值為縱坐標建立標準曲線，得出線性方程y=0.022 2x+0.964 5，R2=0.998 5，當P/N=2.1時，AMV CP蛋白的最低檢測限為46.7 ng/mL。

2.4?檢測方法準確性分析

利用本研究建立的AMV間接ELISA檢測方法和RT-PCR方法對50份大豆樣品進行檢測，兩種方法檢測結果均為陽性的樣品數為30份，均為陰性的樣品16份，ELISA檢測結果為陰性而RT-PCR檢測結果為陽性的樣品4份，可得：一致率＝（共同陽性結果份數+共同陰性結果份數）/樣品總數，即92%。

2.5?吉林省大豆SMV病毒和AMV病毒感染情況調查

對采集的1 342份大豆樣品進行間接ELISA檢測，病毒檢出率為38.30%，SMV的陽性檢出率達30.85%，AMV的陽性檢出率達17.06%，雙病毒復合侵染的陽性檢出率達9.61%，表明這兩種病毒在吉林省大豆種植區普遍存在。

對不同大豆種植區病毒感染情況的調查分析表明（表1），各個產區大豆樣品的感染率普遍偏高。其中敦化地區陽性檢出率最高，達42.70%，公主嶺地區陽性檢出率相對較低，為35.75%。此次調查的5個地區中，只有遼源地區不存在病毒復合侵染的情況，其他4個產區均存在雙病毒復合侵染的情況，陽性檢出率分別為3.62%、9.11%、12.00%、17.88%。其中敦化地區復合侵染率最高。

2.6?大豆品種的AMV抗性評價

AMV接種40個大豆品種，接種21 d后，發現‘墾豐22等29個大豆品種出現出典型AMV感染癥狀，葉片大面積黃化、葉片邊緣明顯卷曲皺縮，植株生長受到嚴重影響（圖6a），推測這些品種可能對AMV沒有抗性;‘黑農23等11個供試大豆品種的幼苗表現出較輕微的發病癥狀，主要表現為葉片有黃色斑點或者并無明顯的黃斑，無法直接觀察到AMV感染的特征（圖6b），說明這些品種可能對AMV侵染具有抗性或耐病性。運用建立的AMV間接ELISA檢測方法對其進行病毒檢測，結果如圖7所示，40個大豆樣品全部感染AMV病毒，其中‘墾豐22的OD450值最高而且高于陽性對照，結合田間癥狀表現，該品種是高感AMV品種;‘黑農23‘黑農24‘黑農30‘黑農34‘黑農44‘黑農71‘中龍606‘黑農55‘墾豐17‘黑河3號‘綏農53的OD450值在0.2到0.25之間，病毒載量較低，結合田間癥狀評價，這11個品種具有AMV抗性;其余28個品種OD450在0.25到0.4之間，病毒載量較高。表明不同大豆品種對AMV的抗性有明顯差異。

3?結論與討論

大豆病毒種類較多，僅憑表型難以區分，通常采用核酸和血清學檢測技術進行甄別［21-24］。血清學檢測技術簡單方便、耗時較短、更適合基層人員使用［27-28］。但是AMV的血清學檢測技術研究的較少，尤其是感染大豆的AMV研究更是鮮有報道。本研究從表現花葉和葉片壞死癥狀的大豆植株上獲得了AMV分離物，并克隆了大豆AMV分離物的CP基因，不同來源（大豆和苜蓿）的AMV CP蛋白有4個氨基酸殘基不同，因此，以AMV大豆分離物CP蛋白制備的抗體對大豆源AMV更具特異性和敏感性。以大腸桿菌重組表達的CP蛋白為免疫原制備的抗血清能特異性識別AMV病毒，而且效價非常高，說明大腸桿菌重組表達的AMV CP蛋白的免疫特性與天然病毒CP蛋白相似，而重組表達蛋白比病毒純化要簡便很多。另外，本研究選擇在載體pET-28b的Nco Ⅰ和Xho Ⅰ兩個酶切位點之間插入CP基因，這樣表達出來的重組CP蛋白除了His標簽以外，只有自身的序列，能夠最大程度體現AMV CP蛋白的抗原特性。

以本研究獲得的抗體為基礎建立的大豆源AMV間接ELISA檢測方法為田間樣品檢測提供了高效、精準的檢測技術，經試驗證明，準確性達到92%。本研究還證明該ELISA檢測方法適用于苜蓿的AMV檢測（數據未列出）。利用本研究獲得的重組CP蛋白，通過免疫BABL/c小鼠和細胞融合技術，可以制備AMV的單克隆抗體，建立雙抗體夾心ELISA，進一步提高AMV檢測的靈敏度和準確性。

吉林省是我國大豆種植的主產區，本研究首次對吉林省田間大豆植株進行AMV和SMV感染調查，結果表明，兩種病毒在大豆產區普遍存在，且存在復合侵染的情況，占全部樣品的9.61%;Malapi-Nelson等研究發現SMV與AMV復合侵染會導致大豆植株出現更為嚴重的癥狀［30］。從本次調查獲得的吉林省AMV檢出率（17%）來看，AMV已經成為影響吉林省大豆生產的主要病毒之一。敦化是吉林省大豆的主產區，來自敦化地區的大豆植株樣品中，AMV檢出率超過30%，為吉林省最高，并且復合感染率也達到了17.88%，個別田塊受AMV影響而大幅減產（產量損失大于35%），因此，針對AMV的防控技術和抗病育種研究顯得越來越重要。氣候變化和吉林省特殊的地理位置，導致蚜蟲等傳播介體種群數量逐年增長，可能是大豆AMV病害流行增加的原因之一，針對傳播介體的防控也應該受到足夠的重視［29］。

抗病育種是防控病毒病危害的有效手段，抗性鑒定是抗病育種的重要環節，國內學者培育和推廣了很多抗SMV的大豆品種，但是至今仍未有抗AMV和SMV的大豆雙抗品種和抗AMV的大豆單抗品種。應加強抗性資源的挖掘和AMV致病性與大豆抗病性分子機制的研究，選育抗性品種。本研究對黑龍江地區40個大豆主栽品種進行了AMV接種，接種21 d 后運用建立的間接ELISA方法對其進行病毒檢測。試驗結果顯示，40個大豆品種全部感染AMV病毒。本研究還發現部分感染AMV的大豆沒有明顯癥狀，屬于隱癥感染，因此病毒檢測有助于提高AMV抗性鑒定的準確性。本研究未發現對AMV免疫的大豆品種，但部分品種表現一定水平的抗性。結合AMV檢測技術，進一步對大豆種質資源進行AMV抗性鑒定，篩選抗性資源［31-32］，進而為品種選育提供科學依據。

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（責任編輯：田?喆）