農產品中典型真菌毒素免疫檢測技術及其應用研究進展

劉振江 潘興魯 郭艷國 吳小虎 徐軍 董豐收 鄭永權

摘要 真菌毒素是一類由產毒真菌產生的次級代謝產物。由于其種類多、毒性強、污染范圍廣的特點，對人和動物的健康存在威脅。因此建立精準、高效的真菌毒素檢測技術對農產品中真菌毒素的監測和防控具有重要意義。免疫分析技術因其靈敏度高、檢測速度快和對操作人員要求低等優點被廣泛應用于農產品的檢測。本文重點介紹了近年來黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及伏馬菌素B1等典型真菌毒素快速免疫檢測技術，分析了各檢測技術的優缺點，并概述了其檢測技術產品化，展望了今后真菌毒素檢測技術的發展方向。

關鍵詞 農產品;?真菌毒素;?免疫快速檢測技術;?研究進展

中圖分類號： R 155.5; TS 207.5

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2021681

Abstract Mycotoxins are secondary metabolites produced by toxic fungi. They are very harmful to human and animals due to their diversified variety， strong toxicity and wide pollution range. Therefore， the establishment of accurate and efficient detection technology for mycotoxins is of great significance for the monitoring of mycotoxins in agricultural products. Immunoassays are widely used for the detection of mycotoxins in agricultural products because of their high sensitivity， fast detection speed and low requirements for operators. This review focused on the rapid immunoassay methods of detecting typical mycotoxins such as aflatoxin B1， zearalenone， ochratoxin A， deoxynivalenol and fumonisin B1 developed in recent years， analyzed the advantages and disadvantages of each method， summarized the commercialization of immunoassay methods， and discussed the future development of mycotoxins detection technology.

Key words agricultural products;?mycotoxin;?immunoassay;?research progress

真菌毒素是真菌在生長過程中產生的次級代謝產物，目前已經報道的1 000多種真菌的代謝產物中有近2 000種真菌毒素［1］。毒理學研究和食品安全監管機構最關注的有黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及伏馬菌素B1等，這些真菌毒素廣泛存在于糧食、油料和飼料等農產品中［2］。為此，制訂科學的殘留限量標準和建立有效的檢測分析技術，對于保障人類生命健康具有重要意義。目前，真菌毒素的檢測技術主要包括儀器分析法［3］和免疫分析法［4］。其中儀器分析方法對真菌毒素的檢測往往需要昂貴的儀器設備，且操作復雜。而免疫分析有關的檢測技術由于其具有特異性強、靈敏度高、易于操作等優點，受到了越來越多的關注與應用。本文重點討論了黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及伏馬菌素B1等真菌毒素的免疫分析技術，包括酶聯免疫分析方法、時間分辨熒光免疫分析技術、免疫膠體金標記快速檢測法、化學發光酶免疫分析技術、電化學免疫傳感器檢測技術以及免疫親和柱層析凈化-熒光光度法，并對其進行詳細闡述。同時還介紹了免疫檢測技術產品化研究進展，最后展望了今后真菌毒素檢測技術的發展方向。

1?真菌毒素免疫檢測技術研究進展

真菌毒素對農產品的污染已經成為日益嚴重的世界性問題，很多案例表明真菌毒素已經對人類的生存安全造成了嚴重的威脅［5］。因此，為了保障人類的生存健康，對真菌毒素進行準確監測和有效控制已成為政府以及產品檢測企業的主要目標。目前真菌毒素的分析測定已有許多方法，其中免疫分析快檢技術以其優越的特性引起了人們的廣泛關注。

1.1?酶聯免疫分析方法

酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）利用抗原與抗體的特異性結合以及高活性酶標記抗體催化底物的變化，實現高靈敏度快速檢測的目的。ELISA具有操作簡單、靈敏度高、特異性強等優點，可通過光度、熒光等常規測量手段實現定量檢測。目前已有大量文獻報道了利用ELISA法檢測真菌毒素，例如呂俊美［6］制備了玉米赤霉烯酮的單克隆抗體，研制了用于檢測玉米、飼料和牛奶等食品中玉米赤霉烯酮試劑盒，檢測范圍為5.75～165.96 ng/mL。Liu等［7］創造性地制備了新型酶標二抗，利用金屬有機框架同時包裹酶和抗體，大大提升了酶標二抗的熱穩定性及有機溶劑耐受性，對比傳統的酶標抗體其檢測限提升了126倍，其對玉米赤霉烯酮檢測范圍為0.5 ng/L～0.476 μg/L。Pei等［8］發展了一種基于脲酶介導金納米花金屬化的新型等離子體共振ELSIA方法，用于超靈敏檢測谷物和白葡萄酒中赭曲霉毒素A的含量，其檢測限達到了8.205 pg/mL，檢測范圍為5.0～640 pg/mL。

目前，市面上已有多家公司生產ELISA試劑盒，用于玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及伏馬菌素B1等真菌毒素的檢測。由于其高靈敏度和特異性，非常適合批量樣品的篩選。因此，ELISA法經常應用于大量樣品的現場初篩。但其缺點是抗原抗體在特異性識別過程中容易受到環境因素以及交叉反應影響，酶穩定性和活性重復性差，易造成假陽性和假陰性的結果。

1.2?時間分辨熒光免疫分析技術

時間分辨熒光免疫分析技術（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）是利用具有特殊熒光信號的鑭系離子與螯合劑結合標記蛋白質、激素和抗體等，在特定的反應體系中反應，然后使用時間分辨熒光儀測定特異性熒光強度，通過熒光強度推導分析物濃度的一種分析方法。相較于其他檢測方法，TRFIA法具有可排除其他熒光干擾，靈敏度高，并且一次可以檢測多個不同樣品的優勢。例如Wang等［9］結合時間分辨熒光傳感和免疫層析的優點，利用銪納米粒子標記黃曲霉毒素B1抗體，建立了一種靈敏、快速的黃曲霉毒素B1時間分辨熒光免疫層析檢測方法。檢測范圍為0.3～10.0 μg/kg，檢測限為0.1 μg/kg。Tang等［10］制備了銪和鋱納米球兩種新型的熒光增強標記物，分別標記黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的抗獨特型納米抗體，建立了兩條熒光時間分辨分析條帶，用于黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的定量檢測。在最佳條件下，檢測黃曲霉毒素B1的線性范圍為0.13～4.54 ng/mL，玉米赤霉烯酮的線性范圍為0.20～2.77 ng/mL，其檢測限分別為0.05 ng/mL和0.07 ng/mL。

目前，TRFIA具有很好的發展前景，若能夠尋找并設計合成出一種比較理想的鑭系螯合物探針，改進其標記和簡化分離的技術，就可以提高其靈敏度。另外實現多重標記構建多分析物同時檢測，將是今后研究的重點。

1.3?免疫膠體金標記快速檢測法

免疫膠體金標記快速檢測法（immunocolloidal gold labelling rapid assay）是利用膠體金作為標記材料，操作簡便，其檢測結果可實現可視化的一種分析方法，在免疫分析技術中得到了廣泛應用。Hou等［11］利用25 nm的膠體金建立了多重免疫分析方法，可同時定性檢測小麥和玉米樣品中伏馬菌素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮。條件優化后，其靈敏度得到極大提高。伏馬菌素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的可視化檢測限分別達到60、12.5 ng/mL和6 ng/mL。此外，膠體金免疫層析試紙條對這3種真菌毒素也具有很高的特異性，

伏馬菌素B1與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮

無交叉反應。盧寶駒［12］將黃曲霉毒素B1抗體與膠體金溶液混合，得到膠體金標記的黃曲霉毒素B1抗體溶液，以傳統的控制線（C）及檢測線（T）進行顯色比較，制備了一個可快速檢測黃曲霉毒素B1的試劑條。扶勝等［13］通過膠體金標記赭曲霉毒素A抗體，組裝試紙條檢測赭曲霉毒素A，結果表明，赭曲霉毒素A檢測試紙條對谷物類樣品檢測限為5 ng/mL，對飼料樣品檢測限為100 ng/mL，檢測時間為10 min，試紙條具有較好特異性，假陽性率小于5%，假陰性率為0。

雖然免疫膠體金標記檢測法在檢測真菌毒素中應用廣泛，但其仍然存在一些不足之處。膠體金制備成本較高，易受環境干擾，同時也易受樣品基質干擾。另外，免疫膠體金標記快速檢測法結果采用肉眼觀測，易對結果判斷不一甚至出現錯誤。

1.4?化學發光酶免疫分析技術

化學發光酶免疫分析技術（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是將高特異性的免疫分析法與高靈敏度的化學發光分析法有機結合，以化學發光作為檢測信號的一種新型免疫分析測定方法［14］。CLEIA在操作步驟上與ELISA基本相同，不同的是與酶反應的底物不是顯色劑而是發光劑。CLEIA體系的發光強度有時會比較弱，通常會使用一些增強劑來增強光信號。這些增強劑能夠影響化學發光反應的動力學，從而增強了光信號強度［15］。CLEIA法具有特異性強、靈敏度高、線性范圍寬、操作方便并且自動化程度高等優勢。已廣泛應用于臨床檢驗、環境檢測、生物分析及真菌毒素快速檢測等領域［16］。例如Liu等［17］基于噬菌體模擬表位取代化學合成的抗原，發展了一種新型CLEIA方法用于檢測玉米赤霉烯酮。構建的CLEIA方法IC50為31.4 pg/mL，而常規ELISA方法的IC50為2.26 ng/mL。Wang等［18］利用生物素-鏈霉親和素與金納米顆粒有機組合進行信號放大，建立了一種高靈敏度的CLEIA方法檢測食品中的玉米赤霉烯酮。Fang等［19］采用對碘苯酚增強的辣根過氧化物酶催化魯米諾-過氧化氫化學發光體系作為信號檢測系統，建立了一種檢測黃曲霉毒素B1的CLEIA方法。該方法與市售ELISA試劑盒具有良好的相關性，相關系數為0.909 8，表明所建立的CLEIA方法可用于實際樣品中黃曲霉毒素B1的測定。

1.5?電化學免疫傳感器檢測技術

電化學免疫傳感技術（electrochemical immunosensor）是以抗原抗體間特異性反應為基礎，結合電化學傳感器簡單和高靈敏的特性構建的一種高靈敏度的快速分析技術。其檢測原理是以固定在支持物表面的抗原或抗體作為識別元件，識別對應的抗體或抗原并且形成穩定的復合物，再將免疫反應的有關變化轉換為電信號，通過信號處理器處理實現對目標物的檢測。電化學傳感器擁有很多優良特性： 1）節省了檢測時間，并使檢測成本大大降低;2）操作簡單便于攜帶，易于推廣使用;3）應用范圍廣、前景好，可被推廣到多個領域，如食品檢測、醫療安全、環境保護及發酵工業等［20］。

目前，研究者已開發出多種電化學免疫傳感器用于檢測真菌毒素。例如Zhang等［21］采用雙抗體夾心法檢測黃曲霉毒素B1，檢測范圍為0.01～100 ng/mL，檢測限為0.003 5 ng/mL，此傳感器已經被應用于玉米粉中的黃曲霉毒素B1檢測，效果良好。Foubert等［22］為了檢測玉米赤霉烯酮，使用不同策略將玉米赤霉烯酮抗體固定在金電極表面，并對其性能進行比較。開發了一種高靈敏度的流動注射電容式免疫傳感器，分析時間更短。Abdul Kadir等［23］ 報道了一種用單克隆抗體修飾的絲網印刷金電極和銀-氯化銀假參比電極測定伏馬菌素的電化學親和傳感器，其檢測限為5 μg/L，檢測范圍為1～1 000 μg/L。

1.6?免疫親和柱層析凈化-熒光光度法

免疫親和柱層析凈化-熒光光度法（immunoaaffinity column-fluorescence detector， IAC-FD）是利用免疫親和柱將待測樣品凈化，結合熒光光度測定， 快速、準確、定量分析真菌毒素的一種方法。Lee等［24］利用IAC-FD法對生牛乳中的黃曲霉毒素M1進行了檢測，其檢測限可達0.002 μg/L，添加回收結果也滿足殘留檢測的要求。王晶等［25］利用IAC-FD法測定醬油和醋中黃曲霉毒素（B1+B2+G1+G2）含量，檢測限分別可達到2.5 μg/kg和1 μg/kg，其中醬油中添加平均回收率為89.3%～103.5%，相對標準差為4.6%～11.9%，醋中添加平均回收率為86.9%～97.3%，相對標準差為3.6%～6.3%。王勇等［26］利用IAC-FD對雞飼料中的黃曲霉毒素（B1+B2+G1+G2）進行了檢測，該方法的檢測限為2.0 μg/kg，相對標準偏差低于10%，平均回收率為85%～90%。

IAC-FD法以其靈敏度高、高效、有毒有害試劑使用少、樣品量少、檢測時間短（10～15 min）和自動化程度高等優點得到了迅速發展，目前市面上已有多種檢測真菌毒素的免疫層析親和柱產品，但產品較為昂貴，且需配備相關儀器設備才能實現自動化熒光定量檢測。不適用于現場檢測，可用于實驗室檢測批量樣品。

2?真菌毒素免疫檢測產品化研究進展

目前，真菌毒素的快檢產品主要是以免疫分析方法的應用為主。主要包括兩種：一是酶聯免疫吸附法為主的快速檢測試劑盒，其是最早應用在醫學檢測的商品化產品，后來逐漸應用于農產品中真菌毒素檢測領域;二是膠體金免疫層析技術為主的快檢試劑卡，其以操作簡單、檢測速度快、成本低廉、適用于現場檢測的優點，在20世紀末期得到初步發展并逐漸成為快速檢測產品的代表。

基于真菌毒素的嚴重危害，各個國家和地區都發展了相關快檢產品來檢測真菌毒素。例如奧地利Romer公司生產的側向層析檢測試紙（AgraStrip）可快速檢測多種食品和飼料樣品中的真菌毒素，分析用時最短只需3 min。AgraStrip Pro Total Fumonisin WATEX檢測伏馬菌素總定量范圍0～44 mg/L，檢測限0.1 mg/L;AgraStrip Pro Total Aflatoxin WATEX檢測黃曲霉毒素總定量范圍0～460 ng/mL，檢測限為2 ng/mL;AgraStrip Pro Zearalenone WATEX檢測玉米赤霉烯酮總定量范圍為0～1 650 ng/mL，檢測限25 ng/mL。ELISA酶聯免疫檢測試劑盒（AgraQuant）可同時檢測多個樣品，只需20～65 min即可完成42個樣品的檢測。美國Beacon公司生產的赭曲霉毒素檢測試劑盒檢測范圍2.0～50 ng/mL，檢測限為1.0 ng/mL;玉米赤霉烯酮檢測試劑盒檢測范圍0.02～1.0 mg/L，檢測限為10 ng/mL。蘇州快捷康生物技術有限公司研發的黃曲霉毒素B1試劑盒靈敏度為0.025 ng/mL，檢測時間75 min;玉米赤霉烯酮試劑盒靈敏度為0.5 ng/mL。

許多學者對現有的真菌毒素快檢產品進行了評價。例如周剛剛等［27］對德國R-biophar M生產的黃曲霉毒素M1檢測試紙條進行了檢測評價，結果發現該產品可定性檢測牛奶中的黃曲霉毒素M1污染，檢測能力滿足歐盟MRL要求。羅昱芬等［28］采用儀器法和青島Pribolab有限公司的 ELISA試劑盒同時測定牛乳中黃曲霉毒素B1和M1，結果發現儀器法測定高濃度M1時準確性優于ELISA法。原因是ELISA法抗體在其特異性、敏感性以及穩定性上都有一定缺陷。呂秋威等［29］評價了國內外應用較廣的9個品牌的不同真菌毒素檢測試劑盒，各品牌試劑盒對相應需要檢測的真菌毒素的檢測效果均較好，準確性和精確度都相對較高，但是尚未有一個品牌的試劑盒可以很好地同時檢測黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮以及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇這3種毒素。

3?展望

本文重點介紹了幾種常見的真菌毒素免疫檢測技術，并對這幾種真菌毒素的免疫快速檢測技術進行了概述，對其優劣之處進行了分析，同時介紹了其技術的產品化情況。雖然檢測真菌毒素的免疫檢測技術有很多，但仍然存在一些不足之處：1）目前只有酶聯免疫吸附法為主的快速檢測試劑盒與膠體金免疫層析技術為主的快檢試劑卡得到產業化，其他免疫分析技術的產業化還有較長的路要走;2）現有的真菌毒素免疫快檢產品主要是針對單一毒素分析，而農產品中常常存在兩個或兩個以上的毒素，今后應加強同時檢測多種毒素的免疫分析技術，以提高檢測效率和節約成本;3）抗體是免疫分析的核心，應進一步研發高質量的真菌毒素抗體，提高免疫分析技術的穩定性和可靠性。

隨著人們生活水平的逐漸提高，針對食品健康領域出現的各種問題，促使人們對食品安全的關注度空前提升。免疫快檢技術非常適合農產品中真菌毒素的快速分析，繼續深入研究和發展可靠的免疫分析技術和免疫分析產品，對及時掌握真菌毒素污染水平和有效控制具有重要意義。

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（責任編輯：楊明麗）