大腸桿菌DH5a菌株高效電擊轉化條件的優化

呂新 劉蘭英 李玥仁

摘 要：為探索大腸桿菌DH5a高效電擊轉化條件，通過對電擊轉化條件中細胞生長狀態、DNA加入量、感受態細胞體積、電場強度、速凍和恢復時間等關鍵因素進行優化，篩選出大腸桿菌DH5a高效電擊轉化條件。結果表明：大腸桿菌在細胞生長狀態OD600值為0.6時制備感受態細胞，按每管50 μL體積分裝、-80℃乙醇速凍后，加入10 pg pUC 19質粒DNA，在20 kv·cm-1電場強度、電容25 μF、電阻200 Ω條件下電擊轉化，轉化后恢復培養60 min，轉化效率達1010 cfu·μg-1 DNA以上水平，可滿足基因文庫構建、抗體庫篩選等試驗需求。

關鍵詞：大腸桿菌;DH5a菌株; 高效；電擊轉化

中圖分類號：Q 939.9? ?文獻標志碼：A? ?文章編號：0253-2301（2023）02-0008-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.02.002

Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China; 2. Fujian Key Laboratory

of Agroproducts Quality & Safety， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： In order to explore the conditions of highefficiency electroporation transformation for Escherichia coli DH5a， the key factors in the conditions of electroporation transformation such as the cell growth state， the adding quantity of DNA， the volume of competent cells， electric field intensity， quick freezing and recovery time were optimized， thus to screen the conditions of highefficiency electroporation transformation for Escherichia coli DH5a. The results showed that： the competent cells of Escherichia coli were prepared when the OD600 value of the cell growth state was 0.6. The competent cells were packed in 50 μL per tube， and frozen in ethanol at -80℃. Then， 10 pg pUC 19 plasmid DNA was added， and the cells were transformed by electric shock under the conditions of 20 kv·cm-1 electric field intensity， 25 μF capacitance and 200 Ω resistance. After the transformation， the cells were cultured for 60 min. The transformation efficiency was above 1010 cfu·μg-1 DNA， which could meet the needs of genomic library construction and antibody library screening.

Key words： Escherichia coli； DH5a strain； Highefficiency； Electroporation transformation

自1972年Cohen等[1]首次報道將質粒DNA成功轉化大腸桿菌Escherichia coli，E.coli后，大腸桿菌感受態細胞轉化已發展為一項分子生物學實驗中的常規技術，主要應用于DNA片段克隆以及基因文庫構建等方面，但不同試驗場景對轉化效率要求存在較大差異，DNA片段克隆只需轉化效率在106 cfu·μg-1 DNA左右就可以滿足試驗要求，而基因文庫構建、抗體庫篩選等研究則需要1010 cfu·μg-1 DNA以上的轉化效率。目前大腸桿菌感受態細胞轉化方法可分為物理法和化學法，化學法主要包括氯化鈣法[1]、Hanahan法[2]以及Inoue法[3]，其中氯化鈣法轉化效率在

106～108 cfu·μg-1 DNA，Hanahan法和Inoue法轉化效率在108 cfu·μg-1 DNA左右，偶能達到109 cfu·μg-1 DNA的水平，均不能滿足基因文庫構建、抗體庫篩選等試驗要求[4-5]。電擊轉化法作為一種物理方法，雖可將轉化效率提高至1010 cfu·μg-1 DNA以上水平，但需要提前對大腸桿菌感受態細胞制備和轉化條件進行優化方能達成。

大腸桿菌電擊轉化主要包括感受態細胞制備和轉化兩個步驟[5-7]，目前在電擊轉化條件優化研究方面存在許多不足之處，主要表現在很多研究將電擊轉化的兩個步驟割裂開，一部分研究僅針對感受態細胞制備條件如菌體培養基、溫度、菌體生長狀態等條件進行優化，忽略了轉化條件對轉化效率的影響[8-9]，而另一部分研究則只針對轉化條件如轉化電場強度、恢復培養基成分和轉化后復蘇時間等方面進行優化[4，10-11]，沒有考慮到菌體生長狀態等感受態細胞制備條件帶來的影響，最終導致電擊轉化試驗優化結果不穩定、重現性差。本研究以大腸桿菌DH5a菌株為試驗對象，同時對電擊轉化條件中感受態細胞制備和轉化條件中關鍵因素進行優化，篩選出高效電擊轉化條件，為基因文庫構建、抗體庫篩選等試驗提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 質粒與菌株 大腸桿菌DH5a菌株、pUC 19質粒均為福建省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所微生物實驗室保存。

1.1.2 材料與試劑 胰蛋白胨、酵母粉（英國Oxoid公司）；葡萄糖、瓊脂粉、氨芐青霉素、質粒DNA提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]；NaCl、KCl、MgCl2、NaOH、甘油（分析純，上海阿拉丁生化科技有限公司）。

1.1.3 儀器與設備 分光光度計（TU1901，北京普析通用）；電脈沖基因轉化儀（Gene Pulser II，美國Biorad公司）；臺式離心機（Sigma 114，德國希格瑪公司）；超凈工作臺（C2HJHC1112B，上海智城公司）；核酸蛋白定量儀（Qubit 2，美國Thermo Scientific公司）；恒溫培養箱（DHP9082型，上海一恒科學儀器有限公司）；0.2 cm電擊杯（美國Biorad公司）。

1.1.4 培養基 SOB培養基：2%（W/V）胰蛋白胨、0.5%（W/V）酵母粉、0.05%（W/V）NaCl、2.5 mmol·L-1 KCl、10 mmol·L-1 MgCl2。SOC培養基：2%（W/V）胰蛋白胨、0.5%（W/V）酵母粉、0.05%（W/V）NaCl、2.5 mmol·L-1 KCl、10 mmol·L-1 MgCl2、20 mmol·L-1葡萄糖。

1.2 試驗方法

1.2.1 大腸桿菌DH5α感受態細胞制備 取出從-80℃保存的大腸桿菌DH5α菌株，在SOB固體培養基上劃線，置37℃培養箱中倒置培養24 h，挑取大腸桿菌DH5α單菌落至5 mL SOB液體培養基中，于37℃、200 r·min-1過夜培養12～15 h；用移液槍吸取0.5 mL過夜培養物，在超凈工作臺中按1∶100比例接種于50 mL SOB液體培養基中，37℃、200 r·min-1振蕩培養至不同生長狀態，在超凈工作臺上轉移至50 mL離心管中，冰浴10 min后在4℃、5000 r·min-1離心10 min，棄上清，收集細胞；加入50 mL 0℃預冷的18.25 MΩ的去離子水，用移液槍吹懸細胞，4℃、5000 r·min-1離心10 min，棄上清，收集細胞，重復洗滌細胞1次；加入25 mL 0℃預冷的10%甘油緩沖液，用移液槍吹懸細胞，4℃、5000 r·min-1離心10 min，棄上清，收集細胞；加入0.5 mL 10%甘油緩沖液吹懸細胞，按每管40 μL體積分裝后，-80℃保存。

1.2.2 大腸桿菌DH5α感受態細胞電擊轉化 取1 ng pUC 19質粒DNA，加入到40 μL 大腸桿菌DH5α感受態細胞中，手指輕彈使pUC 19質粒DNA和感受態細胞充分混勻，冰浴30 min；轉移至0℃預冷的電擊杯（內徑0.2 cm）中，用電轉儀進行電擊（電壓22 kv·cm-1，電容25 μF，電阻200 Ω，電擊1次）；立即向電擊杯中加入960 μL SOC恢復培養基，移液槍反復輕輕吹打混勻，全部吸至離心管中，37℃、180 r·min-1振蕩培養1 h后，涂布于含有終濃度為100 μg·mL-1氨芐青霉素的SOB固體培養基平板上，37℃過夜培養，統計菌落數量，并計算感受態細胞的轉化效率（轉化效率為每單位重量質粒DNA產生的轉化子數量）。

1.2.3 生長狀態對大腸桿菌DH5α感受態細胞轉化效率的影響 分別選取培養至OD600=0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1和1.2的大腸桿菌DH5α菌液（按1.2.1中所述方法制備感受態細胞），并按1.2.2中所述電擊轉化后，統計菌落數量，計算感受態細胞的轉化效率。

1.2.4 質粒DNA加入量對大腸桿菌DH5α感受態細胞轉化效率的影響 按1.2.3確定的最佳OD600值制備感受態細胞，分別取1、10、1、10和100 ng pUC 19質粒DNA，加入到5個40 μL 大腸桿菌DH5α感受態細胞中。按1.2.2中所述電擊轉化后，統計菌落數量，計算感受態細胞的轉化效率。

1.2.5 感受態細胞體積對大腸桿菌DH5α感受態細胞轉化效率的影響 按1.2.4優化的質粒DNA加入量，分別加入到40 μL·管-1、50 μL·管-1、60 μL·管-1、70 μL·管-1、80 μL·管-1分裝的大腸桿菌DH5α感受態細胞中，按1.2.2中所述電擊轉化后，統計菌落數量，計算感受態細胞的轉化效率。

1.2.6 電場強度對大腸桿菌DH5α感受態細胞轉化效率的影響 按1.2.5優化的感受態細胞體積，分別按16、18、20、22和24 kv·cm-1設置不同電場強度，電容25 μF，電阻200 Ω，0.2 cm電擊杯進行電擊轉化。電轉化后按1.2.2中所述后續操作，統計菌落數量，計算感受態細胞的轉化效率。

1.2.7 低溫速凍對大腸桿菌DH5α感受態細胞轉化效率的影響 將新制備的50 μL 大腸桿菌DH5α感受態細胞，置-80℃預冷的乙醇中速凍5 min后，按1.2.6優化的電場強度進行電擊轉化。電轉化后按1.2.2中所述后續操作，統計菌落數量，計算感受態細胞的轉化效率。

1.2.8 恢復時間對大腸桿菌DH5α感受態細胞轉化效率的影響 將速凍后的50 μL 大腸桿菌DH5α感受態細胞，按20 kv·cm-1、電容25 μF，電阻200 Ω設置參數，在0.2 cm電擊杯進行電擊轉化，立即向電擊杯中加入950 μL SOC恢復培養基，移液槍反復輕輕吹打混勻；將電擊杯中的菌液全部吸出至離心管中，37℃、180 r·min-1分別振蕩培養30、60、90和120 min，涂布于含有終濃度為100 μg·mL-1氨芐青霉素的SOB固體培養基平板上，37℃過夜培養，統計菌落數量，并計算感受態細胞的轉化效率。

2 結果與分析

2.1 細胞生長狀態對大腸桿菌DH5α感受態細胞轉化效率的影響

由圖1可知，不同細胞生長狀態下所制備的感受態細胞的轉化效率存在差異，其中以大腸桿菌DH5α細胞生長狀態OD600值為0.6時效果最好，轉化效率為10.7×108 cfu·μg-1 DNA。

2.2 質粒DNA加入量對大腸桿菌DH5α感受態細胞轉化效率的影響

由圖2可知，過低或過高的質粒DNA加入量均會導致大腸桿菌DH5a感受態細胞轉化效率降低，但在10 pg和1 ng的質粒DNA加入量時，兩者的轉化效率明顯高于其他質粒DNA加入量，分別為12.3×108 cfu·μg-1 DNA和12.5×108 cfu·μg-1 DNA。

2.3 感受態細胞體積對大腸桿菌DH5α感受態細胞轉化效率的影響

由圖3可知，不同的感受態細胞體積會導致轉化效率出現高低起伏，其中以50 μL體積的感受態細胞轉化效率最高，其轉化效率為4.2×109 cfu·μg-1 DNA。

2.4 電場強度對大腸桿菌DH5α感受態細胞轉化效率的影響

由圖4可知，不同電場強度下感受態細胞轉化效率會出現高低變化，其中以電場強度為20 kv·cm-1時，感受態細胞轉化效率最高，達7.8×109 cfu·μg-1 DNA。

2.5 低溫速凍對大腸桿菌DH5α感受態細胞轉化效率的影響

由圖5可知，-80℃乙醇速凍后，大腸桿菌DH5α感受態細胞轉化效率得到進一步提升，已超過1010 cfu·μg-1 DNA，達到1.11×1010 cfu·μg-1 DNA水平。

2.6 恢復時間對大腸桿菌DH5α感受態細胞轉化效率的影響

由圖6可知，恢復時間為60 min時感受態細胞轉化效率為1.12×1010 cfu·μg-1 DNA，恢復時間延長至90 min時感受態細胞轉化效率進一步提升至1.28×1010 cfu·μg-1 DNA，而再繼續延長恢復時間至120 min時感受態細胞轉化效率為1.27×1010 cfu·μg-1 DNA，與90 min相比感受態細胞轉化效率提升不大，故恢復時間在60～90 min時感受態細胞轉化效率可在1010 cfu·μg-1 DNA以上。

3 討論與結論

電擊轉化是目前已知的轉化方法中轉化效率最高的，其基本原理是利用作用于細胞膜兩側的高壓瞬時電場產生的電位差，使細胞膜極化形成可逆孔洞，這些孔洞可以使DNA一類的大分子進入細胞[5，12]。有研究表明影響電轉化效率的最主要的因素是電池強度和細胞生長狀態，其中電場強度的增強會增加DNA的導入量，但也會造成細胞的大量死亡，只有當電場強度和脈沖時長以一定方式組合而導致50%～70%的細胞死亡時轉化效率達到最高[9， 13-14]。因此，在進行電轉化時，必須篩選合適的電場強度才可能達到最高的轉化效率。本試驗結果表明，在電場強度為20 kv·cm-1時，感受態細胞轉化效率最高，到7.8×109 cfu·μg-1 DNA。細菌的生長狀態也直接影響轉化效率。研究表明，在細菌生長需經歷4個不同時期，其中以對數生長期早中期時轉化效率最高，而隨著細菌的老化其轉化效率也將大大降低。本試驗結果表明，不同細胞生長狀態下感受態細胞的轉化效率存在差異，其中以在OD600值為0.6時轉化效率最高。

電擊轉化中質粒DNA加入量、感受態細胞體積、速凍和恢復時間等因素也會對轉化效率產生影響，通過對上述條件優化，最終最優電擊轉化條件為：在細胞生長狀態OD600值為0.6制備感受態細胞，并按每管50 μL體積分裝-80℃乙醇速凍后，加入10 pg pUC 19質粒DNA，在20 kv·cm-1電場強度、電容25 μF、電阻200 Ω條件下電擊轉化，轉化后恢復培養60 min，轉化效率可達1010 cfu·μg-1 DNA以上水平。

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（責任編輯：柯文輝）