猴樟CbMYB308轉(zhuǎn)錄因子基因克隆及生物信息學(xué)分析

胡甜 葉蘇梅 郝璦瀅 王藝潤 韓浩章 張穎 王曉李 張麗華

摘要 為研究猴樟CbMYB308蛋白的序列結(jié)構(gòu)和功能，該文克隆猴樟CbMYB308基因CDS序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，克隆得到的序列具有1個942 bp完整的ORF框，編碼313個氨基酸，與沉水樟中收錄的RWR91885.1基因序列一致性達(dá)97.29%，系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果表明，猴樟CbMYB308蛋白具有較高的保守性；猴樟CbMYB308蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，CbMYB308蛋白具有PLN03091家族結(jié)構(gòu)域，為R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子，CbMYB308蛋白化學(xué)分子式為C1496H2356N432O489S11，相對分子量34.57 kDa，理論等電點6.12，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，無序化特征明顯，為脂溶性和親水性蛋白，磷酸化氨基酸位點有53個，亞細(xì)胞定位預(yù)測為細(xì)胞核。

關(guān)鍵詞 猴樟；轉(zhuǎn)錄因子；基因克隆；生物信息學(xué)分析

中圖分類號 S792.23 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）03-0014-04

猴樟（Cinnamomun bodinieri Levl.）為樟科樟屬常綠喬木，主要分布于我國南方地區(qū)，是我國重要的精油加工樹種、綠化樹種和林用樹種。我國關(guān)于猴樟的研究主要集中于精油資源、林用特性、組培技術(shù)和引種栽培等方面，近年來的研究表明，猴樟的生長速度和抗寒性優(yōu)于香樟[1]，可以替代香樟在我國北方地區(qū)推廣應(yīng)用。很早就進(jìn)行了香樟新品種選育工作，相繼選育出涌金、霞光、御黃等彩葉品種[2-4]，然而，關(guān)于猴樟彩葉新品種選育較少。研究表明，花青素種類、組成及其代謝調(diào)控是植物葉片呈色的關(guān)鍵因素，而花青素代謝主要受轉(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH、WD40及其復(fù)合物的調(diào)控[5]，其中MYB類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控功能研究最受關(guān)注，本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出調(diào)控植物花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子，并分析其特性，以期為猴樟新品種選育提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為猴樟變種（春季葉色為紅色）2年生種苗，于2019年3月上旬播種，2021年3月上旬進(jìn)行移栽。于2021年8月20日，取猴樟枝條頂部幼嫩葉片進(jìn)行液氮速凍后，用RNAperp Pure Plant Kit（天根，北京）試劑盒提取材料的總RNA，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大連）方法去除基因組DNA后，用TR Prime Mix（random primer）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得的cDNA產(chǎn)物作為模板。

1.2 基因克隆

根據(jù)猴樟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得在紅葉猴樟變種葉片中上調(diào)表達(dá)的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計CDS擴(kuò)增引物[F（5′—3′）：AGAATGGGAAGAGCGCC；R（5′—3′）：TCAA TCTACAAGCTTCTTATGC]，PCR反應(yīng)采用25 μL體系[6]，反應(yīng)產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞（TSINGKE，北京），挑單菌落進(jìn)行PCR鑒定，將PCR陽性菌落培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒送擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.3 生物信息學(xué)分析

通過ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）將猴樟CbMYB308基因翻譯成蛋白序列；利用NCBI的CCD工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測；利用Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）對氨基酸序列的理化性質(zhì)和等電點進(jìn)行分析；采用Prot Scale（https：//web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行蛋白質(zhì)的親/疏水性預(yù)測；采用PRABI（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl）在線軟件進(jìn)行蛋白二級結(jié)構(gòu)分析；利用Fold Index軟件（https：//fold.weizmann.ac.il/fldbin/findex）分析氨基酸折疊無序化特性分析；采用SoftBerry ProtComp 9.0（http：//linux1.softberry.com/）和Cell-PLoc 2.0在線分析軟件（http：// www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位；采用Swiss-Model（http：//www.Swissmodel.expasy.org）預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，并利用PyMOL軟件生成三級結(jié)構(gòu)模型；利用MEGA7.0生成與CbMYB308的CDS序列同源性較近的物種序列進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 猴樟CbMYB308基因的克隆與重組載體構(gòu)建

根據(jù)克隆后的凝膠電泳圖（圖1），以猴樟的cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增得到1條約1 000 bp的條帶，片段大小與預(yù)期一致，通過測序得到長942 bp的CDS序列。PCR產(chǎn)物送公司測序，測序結(jié)果與沉水樟中收錄的RWR91885.1基因進(jìn)行比對，序列一致性高達(dá)97.29%，具備MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能。將克隆獲得的基因編碼蛋白通過NCBI BLAST Protein與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，根據(jù)比對結(jié)果顯示，所克隆得到的序列具有1個942 bp完整的ORF框，推導(dǎo)編碼313個氨基酸，將獲得的目的基因命名為CbMYB308。

2.2 猴樟CbMYB308蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 猴樟CbMYB308蛋白的理化性質(zhì)分析。利用Protparam軟件對猴樟CbMYB308蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，猴樟CbMYB308蛋白相對分子量34.57 kDa，理論等電點6.12，表明CbMYB308基因編碼蛋白為弱酸性，化學(xué)分子式為C1496H2356N432O489S11，原子總數(shù)為4 784，不穩(wěn)定指數(shù)值為48.55，不穩(wěn)定系數(shù)大于40時為不穩(wěn)定蛋白，因而該蛋白質(zhì)是不穩(wěn)定的。脂溶指數(shù)為66.77，CbMYB308基因編碼蛋白為脂溶性蛋白，帶負(fù)電荷的殘基（asp+glu）總數(shù)為39，帶正電荷的殘基（arg+lys）總數(shù)為36。利用NCBI的CCD工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果表明（圖2），CbMYB308蛋白具有PLN03091家族結(jié)構(gòu)域，具備R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子。利用Prot Scale（https：//web.expasy.org/protscale/）對猴樟CbMYB308基因編碼蛋白的親水性進(jìn)行分析（圖3），總平均親水性值（GRAVY）為-0.568，預(yù)測該蛋白為親水性蛋白。蛋白質(zhì)親水性分析對于研究其跨膜特征和二級結(jié)構(gòu)有著重要的指導(dǎo)意義，通常認(rèn)為，氨基酸分值越低親水性越強，分值越高疏水性越強。猴樟CbMYB308基因編碼蛋白各氨基酸序列中第267位氨基酸分值最低為-2.556，親水性值最強；第303位氨基酸分值最高，為2.089，疏水性最強，就整體分析而言，親水性氨基酸均勻分布在整個多膚鏈中，沒有明顯的疏水性區(qū)域，因此，推測猴樟CbMYB308基因編碼蛋白為親水性蛋白。

2.2.2 猴樟CbMYB308蛋白二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果表明該蛋白定位于細(xì)胞核。根據(jù)蛋白二級結(jié)構(gòu)在線預(yù)測結(jié)果（圖4），該蛋白的組成為122個氨基酸（38.98%）為α-螺旋、39個氨基酸（12.46%）為延伸主鏈，23個氨基酸（7.35%）為β轉(zhuǎn)角及129個氨基酸（41.21%）為隨機(jī)卷曲，因而猴樟CbMYB308主要由α-螺旋和隨機(jī)卷曲組成；蛋白質(zhì)中二硫鍵橋的可能數(shù)量為76種不同組合。利用Fold Index對猴樟CbMYB308蛋白進(jìn)行氨基酸序列折疊無序化分析（圖5），結(jié)果表明，該蛋白存在7個氨基酸無序化區(qū)域，共包含178個氨基酸，折疊無序化比例為56.87%，折疊無序化指數(shù)為0.056，無序化特征明顯。蛋白磷酸化位點進(jìn)行預(yù)測結(jié)果（圖6），該多肽鏈0.500以上分值的氨基酸位點為53個，其中包含36個絲氨酸（S）、15個蘇氨酸（T）和2個酪氨酸（Y）磷酸化位點。根據(jù)蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果和同源建模分析（圖7），CbMYB308編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)與PDB：1a5j.1.A的氨基酸序列一致性達(dá)46.23%，1a5j.1.A序列的編碼蛋白R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。

2.2.3 猴樟CbMYB308蛋白序列同源比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹。在NCBI數(shù)據(jù)庫中對猴樟CbMYB308蛋白序列進(jìn)行blastp比對，根據(jù)結(jié)果下載比對得分較高的氨基酸序列，再通過MEGA7.0軟件構(gòu)建CbMYB308蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖8）。結(jié)果表明，猴樟CbMYB308蛋白在進(jìn)化樹上與同為樟科樟屬的沉水樟聚為一類，說明其親緣關(guān)系最近，樟科樟屬植物中該類蛋白具有較高的保守性。猴樟CbMYB308蛋白進(jìn)化樹中大概分3類，其中猴樟與沉水樟、博落回歸為一類，其次是麻雀花、流蘇馬兜鈴、藍(lán)星睡蓮和盧旺達(dá)睡蓮歸為一類，與猴樟親緣關(guān)系更遠(yuǎn)的深圳擬蓮、椰子、鐵皮石斛和鼓槌石斛歸為一類。

3 結(jié)論與討論

MYB轉(zhuǎn)錄因子對花青素生物合成包括正調(diào)控和負(fù)調(diào)控2個方面，其中起正調(diào)控作用的主要是R2R3-MYB蛋白S6亞組，該亞組具有保守的“KPRPR[S/T]F”基序，光照、溫度、糖、激素等均能誘導(dǎo)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，從而促進(jìn)花青素合成[7]。MYB轉(zhuǎn)錄因子對花青素生物合成調(diào)控具有組織特異性，是人們研究的重點，本研究結(jié)果表明，克隆得到的序列具有1個942 bp完整的ORF框，編碼313個氨基酸，與沉水樟中收錄的RWR91885.1基因序列一致性達(dá)97.29%，系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果表明，猴樟CbMYB308蛋白具有較高的保守性，與前期研究結(jié)果一致[7]；猴樟CbMYB308蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，CbMYB308蛋白具有PLN03091家族結(jié)構(gòu)域，為R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子，亞細(xì)胞定位預(yù)測為細(xì)胞核，結(jié)合表型來看，只在葉片顯示紅色，而在莖、花、根中不顯示紅色，說明CbMYB308具有明顯的組織特異性，研究結(jié)果為進(jìn)一步進(jìn)行猴樟葉片花青素合成途徑及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究提供了基礎(chǔ)。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 韓浩章，張麗華，王曉立，等. 猴樟與香樟幼苗的耐鹽堿性比較[J]. 西部林業(yè)科學(xué)，2019，48（05）：7-14.

[2] 王建軍. 香樟新品種‘涌金[J]. 林業(yè)科學(xué)，2010，46（08）：181.

[3] 王建軍. 香樟新品種‘霞光[J]. 林業(yè)科學(xué)，2015，51（06）：163.

[4] 王豪，張波，陸云峰，等. 香樟新品種‘御黃[J]. 園藝學(xué)報，2019，46（S2）：2924-2925.

[5] 王欣，張?zhí)熘? 園藝作物花青素合成調(diào)控研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)進(jìn)展，2022，12（01）：10-16.

[6] 韓浩章，張麗華，李素華，等. 猴樟CbP5CS1基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建[J/OL]. 分子植物育種：1-9.http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210720.1751.012.html.

[7] Stracke R，Werber M，Weisshaar B. The R2R3-MYB gene family in Arabidopsis thaliana.[J]. Current Opinion in Plant Biology，2001，4（5）：447-456.

（責(zé)編：王 菁）

基金項目 宿遷學(xué)院2020年優(yōu)秀論文培育團(tuán)隊項目；江蘇省自然科學(xué)基金（BK20201481）；宿遷市科技計劃（M202001）；宿遷市科技計劃（L202004）；宿遷學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊項目（2021td05）。

作者簡介 胡甜（1998—），女，江蘇南通人。研究方向：樟屬植物研究與應(yīng)用。

韓浩章*通信作者

收稿日期 2022-03-23