響應面法優化產黃青霉的培養條件

關舒怡 田晶

摘要 產黃青霉是一種遍布于土壤、腐爛物質等基物中的真菌，可產生酶類、青霉素及有機酸等物質，是工業上用于發酵生產青霉素的重要絲狀真菌。產黃青霉的菌落生長和產孢量有一定的特點，在一定程度上受到外界培養條件的影響。為篩選出產黃青霉菌的最佳培養條件，本試驗以產黃青霉為研究對象，研究培養溫度、光周期、培養基初始pH對產黃青霉培養的影響，以菌落直徑和產孢量為指標，通過單因素及響應面試驗對產黃青霉的培養條件進行優化處理。結果表明，在溫度24.1 ℃、pH 7.0、光周期24 L處理時產黃青霉菌落直徑最大，產孢量也最大，最適合產黃青霉菌生長，并通過試驗驗證該條件為最佳培養條件。

關鍵詞 產黃青霉；響應面法；產孢量；培養條件

中圖分類號 TQ465.1? ?文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）06-0039-05

產黃青霉屬無性型真菌，是一種屬于半知菌亞門絲孢綱絲孢目從梗孢科青霉屬的真菌，可以分泌多種胞外酶來分解底物，也可以產生真菌毒素，是工業上重要的真菌之一，也是一種遍布于土壤、空氣及腐爛的有機物質等基物中的真菌[1-2]。產黃青霉是工業上β-內酰胺類抗生素的來源菌株。實際生活中，伴隨著人們對青霉素的需求不斷增加，產黃青霉菌株的培養可為大量獲得青霉素提供物質基礎。為此，本試驗通過單因素及響應面試驗優化得出最適合產黃青霉的培養條件，為產黃青霉的擴大培養提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種。供試菌株：產黃青霉，試管斜面保存于4 ℃的冰箱中。使用時取出活化，接種于SDAY培養基上，置于25 ℃生化培養箱中培養，當菌絲生長到培養皿2/3時，方可使用。

1.1.2 培養基。SDAY培養基：蛋白胨10.0 g，酵母粉2.0 g，葡萄糖40.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1.0 L。

1.1.3 試驗器材。PHS-3CpH測試儀（上海啟前電子科技有限公司）；SPX-250生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；BXM-30R高壓蒸汽鍋（上海博迅實業有限公司設備廠）；RXZ-280A人工氣候箱（寧波江南儀器廠）；BSA224S電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；M1-L213B微波爐（廣東美的廚房電器制造有限公司）；SMART生物顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限公司）；HH0-C1112B超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 產黃青霉的活化處理。配制SDAY培養基，分裝滅菌后，挑取單菌落轉接入裝有SDAY培養液的培養皿，在恒溫25 ℃下培養7～10 d，備用。

1.2.2 產黃青霉的接種。產黃青霉接種操作在超凈工作臺上進行，首先進行紫外消毒30 min，點燃酒精燈，用酒精對手、器皿進行消毒，在酒精燈附近進行倒平板。取菌絲生長達到培養皿2/3的SDAY培養基，在菌落中心至邊緣1/2處，用6 mm的打孔器制出數塊已產孢的菌餅。無菌條件下，用接種針將菌餅挑于平板培養基表面中心位置，用封口膜封住平板，并將平板倒置于培養箱中培養。

1.2.3 產黃青霉產孢量的測定。將每代菌株培養7 d后，在菌落中心至邊緣1/2處，用6 mm的打孔器制出2塊已產孢的菌餅，將其放入20 mL含0.05%吐溫80的無菌水中，用玻璃棒攪拌3 min將其混勻，后用4層紗布過濾，最后用血球計數板計數，計算產孢量[3-5]。計算公式如下：

產孢量=N/80×4×106

式中：N表示顯微鏡下80個小格觀察到的實際孢子數。

1.3 單因素試驗

1.3.1 溫度對產黃青霉培養的影響。將產黃青霉接種于SDAY培養基中，選擇培養溫度為15、20、25、30、35 ℃，調節初始pH值為7.0，光周期為12 L/12 D，3次重復，分別在不同的培養溫度條件下培養7 d，測定產黃青霉菌落直徑和產孢量。

1.3.2 初始pH對產黃青霉培養的影響。配制初始pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的培養基，按上述方法分別接種到不同培養基中，在溫度為25 ℃、光周期為12 L/12 D的條件下培養7 d，3次重復。測定產黃青霉的菌落直徑和產孢量。

1.3.3 光周期對產黃青霉培養的影響。按照上述方法進行接種，在溫度為25 ℃、初始培養基pH為7條件下，使用人工氣候箱控制光周期分別為24 D、6 L/18 D、12 L/12 D、18 L/6 D、24 L，光照強度設置為4 000 lx，培養7 d后，測定產黃青霉菌落直徑和產孢量。3次重復。

1.4 響應面Box-Behnken Design設計優化產黃青霉的培養條件

在單因素試驗基礎上，對產黃青霉的培養進行響應面優化，運用 Box-Behnken設計試驗，以單因素試驗確定的培養溫度、初始pH、光周期為主要考察因子，分別用A、B、C表示，并以-1、0、1分別代表自變量的高、中、低水平[6-8]。

1.5 驗證試驗

利用Design-Expert 10.0軟件分析得到產黃青霉的最佳培養條件，在該條件下重復3次試驗，驗證得到的培養條件是否為最佳方案。

2 結果與分析

2.1 產黃青霉培養單因素試驗的結果與分析

2.1.1 溫度對產黃青霉生長的影響。如表1所示，培養溫度對產黃青霉生長的影響起著關鍵的作用，產孢量總體較高。15～25 ℃時，隨著溫度的升高，菌落生長速率和產孢量逐漸增加；溫度為25 ℃時，產孢量最高，之后隨著溫度的不斷升高，產孢量開始下降；35 ℃時，菌落生長速度大幅降低。因此，當培養溫度在20～30 ℃時，為產黃青霉的最適培養溫度。

2.1.2 培養基初始pH對產黃青霉生長的影響。如表2所示，培養基初始酸堿度的不同會對產黃青霉的生長有一定的影響，但對產黃青霉生長的整體影響不大。從數據可分析得出：產黃青霉菌在pH為5～9的范圍內都可以生長，當培養基初始pH在5～7時，產黃青霉生長的菌落直徑和產孢量隨著酸性的降低而增加；當培養基初始pH在7～9時，產黃青霉生長的菌落直徑和產孢量隨著培養基堿性的增加而減少。當培養基初始pH=7時，產黃青霉菌落直徑達到最大5.33 cm，產孢量達到峰值為8.17×107 cfu·mL-1。綜上所述，產黃青霉菌生長的最佳培養基初始pH為7。

2.1.3 光周期對產黃青霉生長的影響。如表3所示，產黃青霉菌在不同光周期培養的條件下，菌落的直徑及產孢量有一定的差異。在光照時間為24 D～24 L時，產黃青霉菌落直徑和產孢量隨著光照時間的增加而增大。在光周期為24 L條件，即全光照處理時，產黃青霉菌落直徑達到最大為5.70 cm，產孢量達到最多為7.64×107 cfu·mL-1。可見，當光周期為24 L時，最適合產黃青霉生長。

2.2 產黃青霉培養條件響應面試驗結果及分析

2.2.1 響應面試驗結果與方差分析。根據上述對培養溫度、初始pH、光周期單因素試驗的結果，進行Box-Behnken Design設計三因素三水平表，具體因素和水平見表4。

試驗通過響應面軟件的Box-Behnken得出試驗方案，根據前期單因素試驗結果，以產黃青霉產孢量為響應值，選取A（培養溫度）、B（初始pH）、C（光周期）3個因素進行響應面優化處理，試驗設計及產孢量結果見表5。

使用Design-Expert 10.0中的Analysis分析表5，得出產黃青霉的不同培養條件和產孢量之間的回歸方程：產孢量Y=6.36-0.44A-0.12B+1.58C+0.09AB+0.15AC+0.15BC-0.80A2-0.63B2+0.71C2（式中：A、B、C分別為培養溫度、培養基初始pH和光周期）。

依照上述擬合回歸方程，應用響應面軟件對產黃青霉培養條件進行方差和顯著性分析。由Box-Behnken Design結果（表6）分析得出，回歸方程P值為0.005 4，小于0.01，差異極顯著，且失擬項（Lack of Fit）的P值為0.298 7，明顯大于0.05，差異不顯著，說明用該方程預測試驗中培養溫度、初始pH、光周期這3個影響因子與產黃青霉產孢量的關系時合理；由F值的大小可以推斷出3個因子對產黃青霉產孢量的影響大小，C>A>B（52.87>4.15>0.30），即光周期對產孢量的影響最大。模型的相關系數R2=0.914 2，校正決定系數Radj2=0.803 8，則通過試驗建立的模型可以表示80.38%的響應值變化。

2.2.2 響應面交互作用分析。圖1～3是由試驗響應值（產黃青霉產孢量）與培養溫度、初始pH、光周期三者中任意2個因素所形成的等高線圖和響應面曲面圖，直觀顯示出各個因子交互作用情況下響應面的3D 和等值線分析圖，可以體現培養溫度、初始pH和光周期3個條件下，控制任意一個因子不變時，產黃青霉產孢量隨著其他2個影響因子的變化情況。如圖1～3所示，產黃青霉產孢量與培養溫度（A）與初始pH（B）呈開口向下的拋物線關系，產黃青霉產孢量與培養溫度（A）與光周期（C）、初始pH（B）與光周期（C）呈斜曲面的關系，通過響應面分析結果，結合光周期為24 L（全光照）情況分析可以得出：在該試驗培養溫度、初始pH、光周期3個因素所選取的取值范圍內，存在最佳點能使產黃青霉產孢量達到最大值。由圖1中分析可以明顯看出，當光周期不變時，在培養溫度為25 ℃，初始pH為7之前，培養溫度初始pH的不斷增加，產黃青霉產孢量逐漸增加，但當達到最大值后，開始逐漸減小。從響應面曲面圖的坡度以及 Box-Behnken Design結果分析可得，光周期C對產黃青霉產孢量的影響比A、B更大；A對產黃青霉產孢量的影響比B大。

2.3 最佳培養條件及驗證性試驗結果分析

由響應面軟件分析得出上述結果后，再通過numerical選項預測該試驗結果的最大值，可以得到產黃青霉的最佳培養條件為：培養溫度24.088 ℃，初始pH 7.015，光周期24 L，此時產黃青霉的產孢量為8.682 cfu·mL-1。充分考慮到試驗條件和實際操作的可能性，將產黃青霉的最佳培養條件調整為：培養溫度24.1 ℃，初始pH7.0，光周期24 L，進行3次驗證試驗，得出產黃青霉的產孢量為8.27×107 cfu·mL-1。該值與預測值較接近，相對誤差值為4.98%，說明該模型擬合程度高，具有實用價值。

3 結論

本試驗以菌落直徑和產孢量為指標，在單因素試驗的基礎上，通過采用響應面Box-Behnken設計試驗方法，得到產黃青霉的產孢量與溫度、光周期以及初始pH的回歸方程。試驗結果表明，產黃青霉菌最優的培養條件為：培養溫度24.1 ℃，初始pH7.0，光周期24 L時，此條件下產黃青霉的產孢量為8.27×107 cfu·mL-1。

4 參考文獻

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（責編：張宏民）

基金項目 山西省高等學校科技創新計劃項目（2021L566）。

作者簡介 關舒怡（1999—），女，山西運城人。研究方向：生物學。