CD34 在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其與臨床病理特征的關系

曾紅春，楊育生，鄭維喆，錢秀紅

1.上海市松江區中心醫院超聲科，上海 201600；2.上海市松江區中心醫院病理科，上海 201600

甲狀腺癌具有較高的人群患病率，病理類型多為甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）[1]。盡管PTC 具有良好的臨床預后和長期伴癌生存期，仍有10%～15%的患者發生復發、轉移和與癌癥相關的死亡[2]。既往研究認為血管因素參與了甲狀腺乳頭狀癌的轉移過程，由于PTC 在不同的生長階段，結節內部可發生不同的纖維化和鈣化，微血管數量也會隨之發生變化。迄今，關于PTC 微血管化狀態與其臨床病理特征之間的關系尚存有爭議[3-5]。本研究收集2014年1月—2021年11月在上海市松江區中心醫院行甲狀腺手術患者169 例（176 個結節）的臨床病理資料，擬分析CD34 在PTC及甲狀腺良性結節中的表達，采用全景模式下計數單位面積的微血管密度（microvascular density，MVD），比較分析PTC 與甲狀腺良性結節間、PTC 侵犯組與無侵犯組間、PTC 伴或不伴橋本氏甲狀腺炎間MVD 的相關性，以期進一步了解CD34 表達與其臨床病理特征的內在聯系。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集在本院行甲狀腺手術患者169 例（176 個結節）的臨床病理資料，其中，男28 例，女141 例；年齡22～84 歲，平均（53.74±11.54）歲。良性組99個（結節性甲狀腺腫57 個、橋本氏甲狀腺炎24 個、濾泡狀腺瘤18 個），結節最大徑0.6～4.0 cm。惡性組77 個（均為甲狀腺乳頭狀癌），結節最大徑0.2～2.5 cm。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①資料完整；②術前未接受任何治療；③標本滿足CD34 染色標準；④CD34 著色良好。

排除標準：①資料不完整者；②術前接受過治療者；③標本不滿足CD34 染色標準者；④CD34 著色差者。

1.3 方法

①研究分組：病理結果和臨床資料中顯示有包膜侵犯、脈管或血管侵犯以及淋巴結轉移或遠處轉移任何一項者為侵犯組，無上述任何病理特征者為無侵犯組。按照腫瘤周圍組織是否伴有橋本氏甲狀腺炎，將患者分為橋本氏甲狀腺炎背景和非橋本氏甲狀腺炎背景。

②CD34 免疫組織化學染色：采用EnVision 二步法染色，石蠟切片4 μm，70℃烘箱不少于1.5 h，石蠟切片脫蠟，用EDTA（pH=8.0）98℃微波修復10 min，自然冷卻至室溫，流水沖洗，PBS液（pH=8.0）清洗3次，1 min/次。用0.3%過氧化氫抑制內源性過氧化物酶滅活10 min，PBS 液（pH=8.0）清洗3 次，1 min/次。CD34 工作液（鼠單抗，克隆號QBEnd/10）室溫孵育60 min，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer solution,PB）（pH=8.0）清洗3 次，1 min/次。然后用Haopoly-HRP 鼠/兔通用二抗試劑盒室溫孵育15 min，PBS 液（pH=8.0）清洗3 次，1 min/次，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine, DAB）顯色5 min，用流水反復沖洗，復染30 s，用1%鹽酸酒精分化，溫水進行藍化、組織脫水透明、樹膠封片。鏡下血管內皮細胞染成棕黃色為CD34 陽性。

1.4 觀察指標

采用K-Viewer 病理圖像閱讀器進行全景讀片，由兩位高年資醫生在低倍鏡下（×20）選擇熱點最高的區域，然后在高倍鏡（×40）下進行單位面積下（50 000 μm2）的微血管計數（條/單位面積），計數3次取平均值；所有數據資料均存圖留檔，初次評估完成后1 周，采用雙盲法按照同樣方法復測1 次，兩次結果取平均值。計數標準：①避開壞死液化和纖維化區；②棕染的內皮細胞或細胞叢認定為單個微血管；③獨立成條或分支結構未中斷者按1 條計數。

1.5 統計方法

采用SPSS 20.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料符合正態分布，以(±s)表示，組間差異比較采用t檢驗；計數資料以頻數和百分率（%）表示，組間差異比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman相關檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 甲狀腺良惡性結節間MVD 比較

PTC 組CD34 表達量顯著高于良性組，見圖1、圖2。PTC 組MVD（30.610±11.513）條/單位面積高于良性組（23.160±10.362）條/單位面積，差異有統計學意義（t=4.506，P＜0.001)。

圖1 PTC 組織CD34 表達，EnVision 法(×200)

圖2 結節性甲狀腺腫CD34 表達，EnVision 法(×200)

2.2 MVD 與PTC 最大徑的相關性分析

不同大小PTC 結節間MVD 比較，差異無統計學意義（F=0.580，P=0.630），見表1。采用Spearman 相關性分析PTC 最大徑與MVD 的相關性，結果顯示，PTC 最 大 徑 與MVD 間 無 相 關 性（r=-0.052，P=0.651）。

表1 不同大小PTC 結節MVD 的比較[(±s),條/單位面積]

表1 不同大小PTC 結節MVD 的比較[(±s),條/單位面積]

最大徑（mm）≤5（n=33）6～10（n=31）11～15（n=9）＞15（n=4）MVD 24.550±9.757 25.550±9.212 21.440±7.970 21.750±6.238 F 值0.580 P 值0.630

2.3 MVD 與PTC 侵襲性的相關性分析

PTC 侵犯組與無侵犯組間MVD 比較，差異無統計 學意義（t=-0.484，P=0.630），見表2。兩組 間Spearman 相關性分析顯示，MVD 與PTC 侵襲性無相關性（r=0.157，P=0.172）。

表2 甲狀腺乳頭狀癌侵犯組與無侵犯組間MVD 的比較[(±s),條/單位面積]

表2 甲狀腺乳頭狀癌侵犯組與無侵犯組間MVD 的比較[(±s),條/單位面積]

組別侵犯組（n=17）無侵犯組（n=60）MVD 29.410±10.932 30.950±11.739 t 值-0.484 P 值0.630

2.4 PTC 伴橋本氏甲狀腺炎與不伴橋本氏甲狀腺炎間MVD 的比較

PTC 伴橋本氏甲狀腺炎與不伴橋本氏甲狀腺炎間MVD 比較，差異無統計學意義（t=0.651，P=0.517），見表3。橋本背景與非橋本背景PTC 患者發生侵犯的概率比較，差異無統計學意義（χ2=0.085，P=0.771），見表4。

表3 PTC 伴橋本氏甲狀腺炎與不伴橋本氏甲狀腺炎間MVD 比較[(±s),條/單位面積]

表3 PTC 伴橋本氏甲狀腺炎與不伴橋本氏甲狀腺炎間MVD 比較[(±s),條/單位面積]

不同背景橋本背景（n=14）非橋本背景（n=63）MVD 32.430±13.993 30.210±10.978 t 值0.651 P 值0.517

表4 橋本氏甲狀腺炎背景和非橋本氏甲狀腺炎背景下PTC 侵犯組和非侵犯組間比較

3 討論

新生血管是惡性腫瘤賴以生存的基礎[6]。PTC 結節內部的微血管狀態在不同生長階段呈動態性變化[7-8]。不同的生長周期，PTC 結節可發生不同程度的纖維化和鈣化，致使微血管結構遭到破壞，PTC 結節MVD（38.0±6.1）條/高倍視野低于良性結節（62.5±13.5）條/高倍視野（P＜0.05），同時導致結節內部微血管分布不均勻，結節內部的MVD 低于周圍正常甲狀腺組織，PTC 與甲狀腺組織交界處MVD 高于中央區[4]。李剛等[9]研究表明超聲造影后PTC 結節實測值小于灰階超聲模式下的測量值，而良性結節超聲造影測值與灰階超聲模式下測值比較，差異無統計學意義（P＞0.05），這一征象也間接表明PTC 結節的微血管分布狀態不均衡，周邊的新生血管較中央豐富。因此，既往的研究結果普遍認為PTC 是乏血供的腫瘤。隨著對PTC 的深入研究，有學者在超聲造影過程中發現，部分PTC 出現“造影劑滯后”的現象，這部分PTC內部MVD 的集成光密度值（integrated optical density value, IOD）明顯高于不出現“造影劑滯后”的結節[10]。溫群等[5]研究也顯示PTC 的MVD（51.77±36.50）條/高倍視野高于甲狀腺良性結節（38.48±26.21）條/高倍視野（P＜0.05）,本研究結果顯示，PTC 組MVD（30.610±11.513）條/單位面積高于良性組（23.160±10.362）條/單 位 面 積（P＜0.05），表 明PTC 也可以具有富血管化的特征。

結節大小被認為是PTC 的風險預測因素，隨PTC 體積增大，BRAFV600E 突變率增加，PTC 體積增大與被膜侵犯、CAF 增生密切相關[11]。然而，各項研究得出的PTC 最大徑的預測診斷界值差別較大，從6.5～40 mm 不等，很難將PTC 的大小直接作為量化的風險預測指標[12-14]。導致研究結果差異性較大的原因可能與PTC 的組織生物學特性有關。腫瘤的大小由腫瘤的生長速度決定，而生長速度的快慢又與新生血管有著直接關系。當腫瘤快速生長時，在多種促血管生成因子的作用下，新生血管大量增生，以滿足快速生長的需要，此時PTC 擁有較為豐富的血管網。隨著腫瘤的繼續增大，腫瘤異質性和浸潤性生長的特點可引起新生血管損傷，結節內部出現纖維化和鈣化，導致PTC 新生血管數量減少和分布不均衡。因此，不同生長階段PTC 結節的大小與MVD 并非總是呈現為正相關，本研究結果顯示不同大小PTC 結節與MVD 間無相關性（P＞0.05），這一研究結果符合PTC 的動態性病理變化。

有研究認為MVD 與PTC 的侵襲性相關，高危組PTC 患者以及有甲狀腺外和局部血管侵犯患者的MVD 顯著高于非侵犯組PTC（P＜0.05）[15]。MVD 除了與血管侵犯有關外，還與淋巴結轉移有密切的相關性[16]。但在另外一項研究中，MVD 在PTC 伴有淋巴結轉移和不伴有淋巴結轉移組間差異無統計學意義（P＞0.05），MVD 與淋巴結轉移沒有相關性[17]。本研究結果顯示，侵犯組與非侵犯組間MVD 比較，差異無統計學意義（P＞0.05），MVD 與PTC 的侵襲性之間無顯著的相關性（P＞0.05）。從PTC 的組織生物學特性考慮，PTC 在進展過程中新生血管會遭到動態性破壞，使得血管化的進程受到阻遏。橋本氏甲狀腺炎背景與PTC 發生發展的相關性日益受到關注，有研究顯示，罹患橋本氏甲狀腺炎的患者，甲狀腺惡性腫瘤的發生率將會提高，尤其是PTC、甲狀腺髓樣癌和淋巴瘤[18-19]。這部分患者發生BRAFVE600基因突變的概率明顯高于未合并橋本氏甲狀腺炎的患者[20]。一項關于PTC 侵襲性風險因素的回歸性研究表明，只有多灶性PTC 合并橋本氏甲狀腺炎是淋巴結轉移的危險因素，而橋本氏甲狀腺炎尚不構成獨立危險因素[21]。本研究顯示，PTC伴有橋本背景與不伴橋本背景的MVD 比較，差異無統計學意義（P＞0.05），PTC 伴有橋本氏甲狀腺炎和不伴有橋本氏甲狀腺炎發生侵襲性的概率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。由于納入研究的橋本氏甲狀腺炎患者的例數較少，橋本氏甲狀腺炎背景是否是PTC 侵襲性的風險因素，仍有待于進一步研究。

綜上所述，PTC 的MVD 高于甲狀腺良性結節，這一研究結果符合惡性腫瘤的組織生物學特性。而PTC 的血管化狀態與PTC 的大小、侵襲性及橋本氏甲狀腺炎背景無明顯相關性。