食品中蠟樣芽孢桿菌檢驗方法驗證結果分析

摘要 ［目的］驗證國標平板計數法、最大或然數（most probable numbe，MPN）計數法檢測食品中蠟樣芽孢桿菌的適用性。［方法］參照GB 4789.14—2014《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 蠟樣芽孢桿菌檢驗》中平板計數法、MPN計數法檢測樣品中蠟樣芽孢桿菌濃度，對比不同方法的檢測結果。同時以蠟樣芽孢桿菌為陽性對照，蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌為陰性對照，驗證方法的特異性。［結果］該方法具有特異性，能夠準確檢出蠟樣芽孢桿菌的計數，方法精密度和重復性好，回收率在84%～100%。［結論］2種方法均具有適用性和可操作性，均能達到標準方法要求的技術指標水平，檢驗結果準確可靠。

關鍵詞 食品；蠟樣芽孢桿菌；方法驗證；平板計數法；MPN計數法

中圖分類號 TS207 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2023）09-0184-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.09.044

Abstract ［Objective］To verify the applicability of national standard plate counting method and MPN counting method for detecting Bacillus cereus in food.［Method］The concentration of Bacillus cereus in samples was detected by the first method （plate counting method） and the second method （MPN counting method） according to GB 4789.14-2014 "National Standard for Food Safety，Microbiological Test of Food，Test for ?cereus"，and the detection results of different methods were compared.At the same time，Bacillus cereus was used as positive control，and Bacillus mycoides，Bacillus thuringiensis and Bacillus megaterium ?used as negative control to verify the specificity of the method.［Result］The method had specificity and could accurately detect the count of Bacillus cereus.The method had good precision and repeatability and the recovery rate was 84%-100%.［Conclusion］Both methods have applicability and operability，and can meet the technical index level required by the standard method，and the test results are accurate and reliable.

Key words Food;Bacillus cereus;Methods validation;Plate counting method;MPN counting method

作者簡介 許涵秋（1986—），女，福建寧德人，工程師，從事食品安全檢測研究。

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）自從1950年被Hauge氏首次報道其能引起食物中毒以來，就一直為人們所廣泛關注［1］。蠟樣芽孢桿菌是一種好氧、兼性厭氧的桿狀革蘭氏陽性細菌，屬于芽孢桿菌科蠟樣芽孢桿菌屬，能形成熱穩定的內生孢子，對環境具有很強的適應性［2-3］。因此，它能夠廣泛存在于幾乎所有種類食品中，在乳制品、嬰幼兒食品、糧食、肉制品、海產品、蜂蜜及蔬菜水果等食品中均檢出過蠟樣芽孢桿菌［4-21］。蠟樣芽孢桿菌在水、空氣、土壤中也廣泛存在［22］，有研究表明，蠟樣芽孢桿菌在10～45 ℃、pH 2～11均可生長，最適生長溫度為28～35 ℃，pH為4.3～9.3［23］。

2017年，中國疾病預防控制中心衛生應急中心發布的食物中毒事件數據顯示，由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒事件分別占食物中毒事件總數和中毒總人數的1.72%和3.63%，僅次于細菌性食物中毒、沙門氏菌、副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌腸毒素，位列第五［24-25］。

2014—2016年，山西省共采集11類食品7 822份樣品進行食源性致病菌檢測分析，蠟樣芽孢桿菌檢出率最高，為11.0%［26］。2015—2020年，江西省豐城市采集轄區內各類食品604份樣品進行檢測分析，結果檢出12株蠟樣芽孢桿菌，檢出率為1.99%［27］。2018年，吉林省共采集8個轄區內各類外賣食品830份樣品進行檢測分析，結果檢出40株蠟樣芽孢桿菌，檢出率為4.82%［28］。2011—2015年，吉林省共采集9個轄區內流通環節食品1 693份樣品進行檢測分析，結果檢出557株蠟樣芽孢桿菌，檢出率為32.90%，其中乳與乳制品的蠟樣芽孢桿菌污染最為嚴重，檢出率為39.45%；其次為餐飲食品和嬰幼兒配方食品，檢出率分別為31.49%和31.09%［29］。2020年，武漢市共采集各類食品200份樣品進行檢測分析，結果檢出36株蠟樣芽孢桿菌，檢出率18.00%，為最高［30］。產毒素蠟樣芽孢桿菌按照食物中毒癥狀分為嘔吐型和腹瀉型2種，其分泌的毒素耐高溫、耐高壓，在食品加工過程中不能被分解，人們誤食被其污染的食品會引起嘔吐或者腹瀉，可以導致各種局部或全身性感染，如壞死性腸炎、肝功能衰竭、菌血癥和腦膜炎［31-33］，甚至導致死亡［34］。由此可見，快速、準確地檢測蠟樣芽孢桿菌是控制食品污染和感染后治療的關鍵環節。

我國現行的GB 31607—2021 《食品安全國家標準 散裝即食食品中致病菌限量》首次在食品安全國家標準中規定了以米為主要原料制作的散裝即食食品中蠟樣芽孢桿菌的限量為10 000 CFU/g（mL），而在其他食品中還沒有限量要求，建議國家食品安全標準中增加其他類別食品特別是嬰幼兒配方食品、嬰幼兒輔助食品的蠟樣芽孢桿菌指標，更好地確保人民群眾食品安全。蠟樣芽孢桿菌的檢驗方法依據GB 4789.14—2014 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 蠟樣芽孢桿菌檢驗》，但該標準中對于蠟樣芽孢桿菌檢測的部分操作步驟和細節沒有詳細說明，部分技術參數沒有明確規定，這些可能會導致檢測的不規范。

在使用標準方法進行檢測之前，實驗室需證實能夠正確運用標準方法以驗證其技術能力是否達到了標準的規定要求［35］。該研究通過將蠟樣芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌接種于腦心浸出液肉湯（BHI）制備成菌懸液，加標于樣品中，按GB 4789.14—2014中平板計數法和MPN計數法的檢驗步驟進行檢驗計數，并在重復條件下對2種定量方法進行比較研究，驗證方法的重復性、加標回收率；同時以蠟樣芽孢桿菌為陽性對照，蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌為陰性對照，驗證方法的特異性，為完善蠟樣芽孢桿菌定量檢測提供理論依據，也為制定相關技術驗收標準提供基礎試驗支撐。

1 材料與方法

1.1 試材與試劑 蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）［CMCC（B） 63303，廣東環凱微生物科技有限公司］；蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides）［CICC 21473，中國工業微生物菌種保藏管理中心］；蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）［CICC 22945，中國工業微生物菌種保藏管理中心］；巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）［CGMCC 1.0217，廣東微生物菌種保藏管理中心］。

腦心浸出液肉湯（BHI）、甘露醇卵黃多黏菌素（MYP）瓊脂、多黏菌素B、胰酪胨大豆多黏菌素肉湯（TSB）、營養瓊脂、50%卵黃乳液、胰酪胨大豆羊血（TSSB）瓊脂、硫酸錳營養瓊脂、酪蛋白瓊脂、蠟樣芽孢桿菌生化鑒定試劑盒、革蘭氏染色液、動力-硝酸鹽培養基（A法）、磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自廣東環凱微生物科技有限公司；米糕（農貿市場小作坊）。

1.2 儀器與設備

SM 530自動高壓蒸汽滅菌器（重慶雅馬拓科技有限公司）；AC2-6S1生物安全柜（新加坡 ESCO科技有限公司）；SPX-250-Ⅱ 生化培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化。

將蠟樣芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌標準菌株從-80 ℃冰箱中取出，劃線接種至營養瓊脂斜面活化，于36 ℃培養18～24 h。連續轉接2代，保證菌種的活性。

1.3.2 混合標準菌液的制備。

用1 μL無菌接種環各勾取一環蠟樣芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌于10 mL BHI培養基，36 ℃培養24 h。

1.3.3 樣品和加標樣稀釋液的制備。

稱取25 g米糕于無菌均質袋中，加入225 mL PBS，制成10倍樣品稀釋液，重復2次。同時稱取24 g米糕于無菌均質袋中，吸取1 mL混合標準菌液加入其中，加入225 mL PBS，制成10倍加標樣稀釋液。

1.3.4 樣品的稀釋與接種（平板計數法）。

吸取“1.3.3”中1∶10的樣品和加標樣稀釋液置于9.0 mL無菌PBS稀釋液中，充分混勻制成1∶100的樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1 mL滅菌吸管。根據對樣品濃度的估計，選擇2～3個適宜稀釋度的樣品勻液，在進行10倍遞增稀釋時，分別吸取0.3、0.3、0.4 mL稀釋液于MYP瓊脂平皿內，用L型涂布棒涂抹均勻。分別吸取0.3、0.3、0.4 mL空白稀釋液加入3個MYP瓊脂平皿內作空白對照。靜置10 min，待樣液吸收后，將平板翻轉，（30±1） ℃培養24 h，培養后計數平板上的所有菌落數。

1.3.5 樣品的稀釋與接種（MPN計數法）。

吸取“1.3.3”中1∶10的樣品和加標樣稀釋液置于9.0 mL無菌PBS稀釋液中，充分混勻制成1∶100的樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1 mL滅菌吸管。根據對樣品濃度的估計，取3個適宜連續稀釋度的樣品勻液，接種于10 mL TSB中，每一稀釋度接種3管，每管接種1 mL于（30±1）℃培養48 h。用1 μL無菌接種環從各管中分別移取1環，劃線接種到MYP瓊脂平板上，（30±1） ℃培養24 h。

1.3.6 菌種確定和鑒定。參照GB 4789.14—2014進行革蘭氏染色鏡檢、生化鑒定盒生化分型鑒定。挑取純培養的單個菌落于高倍（16×100）顯微鏡下進行革蘭氏染色鏡檢。挑取純培養的單個菌落，按GB 4789.14—2014中步驟進行過氧化氫酶試驗、動力試驗、硝酸鹽還原試驗、酪蛋白分解試驗、溶菌酶耐性試驗、V-P試驗、葡萄糖利用（厭氧）試驗、根狀生長試驗、溶血試驗、蛋白質毒素結晶試驗等生化分型鑒定試驗。

2 結果與分析

2.1 2種方法的計數結果

按照“1.3”的試驗方法，進行培養、驗證和計數，結果如表1～2所示。經過計數，混合標準菌液中蠟樣芽孢桿菌的平均含量為4.7×106 CFU/mL，折算為25 g加標樣中蠟樣芽孢桿菌的含量為1.9×105 CFU/g。

2.2 2種方法的實際樣本加標試驗檢測結果比較

根據表1～2結果，25 g加標樣中蠟樣芽孢桿菌的含量為1.9×105 CFU/g，回收率以平均值除以1.9×105乘以100計算，得平板計數法的回收率為84.2%、MPN計數法的回收率為100%。結果如表3所示，結果表明2種方法均能較好地計數食品中蠟樣芽孢桿菌的數量。

對試驗結果采用統計假設檢驗方法分析，運用F檢驗法進行等精度測量判定，T檢驗法進行數據一致性判定，判定結果如表4所示。計算步驟如下：

（1）統計量F（f1，f2）=S12S22，式中，S1為兩組對比數據的大值標準偏差；S2為兩組對比數據的小值標準偏差；自由度f1=n1-1，f2=n2-1；次數n1=n2=3。經計算，F（f1，f2）=1.00;取顯著水平α=0.05，查F分布臨界值表得概率p=0.95水平下F0.95（2，2）=19.00，可得F（f1，f2）＜F0.95（2，2），可判斷兩組對比數據屬于等精度測量。

（2）統計量T=1-2Spn1n2n1+n2，SP=（n1-1）S12+（n2-1）S22n1+n2-2，式中，1、2為兩組對比數據平均值；S1、S2為兩組對比數據標準偏差；Sp為兩組對比數據合并標準偏差。計算得T=1.061；取顯著水平α=0.05，自由度f=n1+n2-2=3+3-2=4，查T分布雙側臨界值表得tα，f=t0.05，4=2.776。可得T＜tα，f，可判斷兩組對比數據結果一致。

結果說明2種方法檢測結果波動性相對較小，精密度和重復性較好，有利于結果的準確性與重現性。

2.3 確定和鑒定結果

2.3.1 革蘭氏染色鏡檢。

蠟樣芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌的革蘭氏染色鏡檢結果如圖1所示，結果表明4種菌株均為革蘭氏陽性芽孢桿菌，大多呈短鏈排列。其中巨大芽孢桿菌呈單個或短鏈排列，部分菌鏡檢結果呈現陰性反應，可能由于其活化效果不佳，菌體死亡或自溶使部分陽性菌呈陰性反應。

2.3.2 MYP瓊脂平板上菌落形態。蠟樣芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌在MYP瓊脂平板上的培養結果如圖2所示，結果表明，蠟樣芽孢桿菌的典型菌落為粉紅色，表示不發酵甘露醇，周圍有白色沉淀環，表示產卵磷脂酶；蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌的典型菌落為粉紅色，其中蘇云金芽孢桿菌周圍有粉色沉淀環；巨大芽孢桿菌在MYP瓊脂平板上生長受抑制，典型菌落為灰白色，培養基紅色褪去而顯示出淡黃色，表示發酵甘露醇產酸，并且周圍無沉淀環，表明該菌株在MYP瓊脂平板上不產卵磷脂酶。

2.3.3 營養瓊脂平板上菌落形態。

蠟樣芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌的根狀生長試驗結果如圖3所示，結果表明蠟樣芽孢桿菌在營養瓊脂平板上呈灰白色，不透明，表面呈融蠟狀，邊緣呈擴展狀，直徑4～10 mm，呈粗糙山谷狀生長的特征。蕈狀芽孢桿菌呈根狀生長的特征，蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌均無上述生長典型特征。

2.3.4 動力試驗。

標準菌株動力試驗結果如圖4所示，結果表明，蠟樣芽孢桿菌在動力培養基中沿穿刺線呈擴散生長，巨大芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌沿穿刺線呈弱擴散生長，蕈狀芽孢桿菌沿穿刺線呈絨毛狀生長。

2.3.5 溶血試驗。蠟樣芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌的溶血試驗結果如圖5所示，結果表明，蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌在TSSB瓊脂平板上產溶血素，有完全溶血環；蕈狀芽孢桿菌在TSSB瓊脂平板上為弱溶血，巨大芽孢桿菌為不溶血。

2.3.6 酪蛋白分解試驗。蠟樣芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌的酪蛋白分解試驗結果如圖6所示，結果表明，蠟樣芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌菌株在酪蛋白瓊脂平板上均呈陽性反應，說明這些菌株均能分解培養基的酪蛋白，使得培養基由綠色變為藍色，生成的L-酪氨酸在菌落周圍形成透明圈；而巨大芽孢桿菌標準菌株在酪蛋白瓊脂平板上無上述現象。

2.3.7 蛋白質毒素結晶試驗。

蠟樣芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌的酪蛋白分解試驗結果如圖7所示，結果表明4種菌株均有產生游離芽孢（淺紅色），其中僅蘇云金芽孢桿菌有產生菱形蛋白色結晶體（深紅色）。

2.3.8 其他生化特征。

采用生化試劑盒鑒定，結果見表5。結果表明，蠟樣芽孢桿菌的生化特征和蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌十分相似。雖然淀粉和明膠的試驗能有效區分蠟樣芽孢桿菌與其他芽孢桿菌，但不能僅以這2項的試驗結果進行判定歸屬的菌種。

3 結論與討論

近年來，國內外食品中的蠟樣芽孢桿菌檢出率較高，檢驗機構正確地按照國家標準方法準確檢驗食品中的蠟樣芽孢桿菌顯得十分重要。該研究通過對國家標準GB 4789.14—2014中的2種定量方法（平板計數法、MPN計數法）進行比較研究，并在重復條件下對2種方法與實際添加菌數進行對比，結果表明，平板計數法、MPN計數法均能夠很好地計數食品中蠟樣芽孢桿菌的含量，方法精密度和重復性較好，回收率在84%～100%。

同時，該研究以蠟樣芽孢桿菌為陽性對照，蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌為陰性對照，通過多種形態學觀察和生化試驗，驗證方法的特異性，結果表明，蠟樣芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌在MYP瓊脂平板、營養瓊脂平板、TSSB瓊脂平板上的菌落形態存在不同程度差異，可以據此將它們區分開來，并以其他生化特征反應為輔助手段；其中營養瓊脂平板上的根狀生長試驗能有效鑒別蠟樣芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌。蘇云金芽孢桿菌與蠟樣芽孢桿菌大部分生化試驗結果都相似，只有通過蛋白質毒素結晶試驗能有效鑒別開。因此，通過MYP瓊脂平板分離純培養后，以根狀生長試驗和蛋白質毒素結晶試驗為關鍵手段，以形態學觀察和生化試驗為輔助手段，可以有效鑒別出蠟樣芽孢桿菌，大幅降低蠟樣芽孢桿菌的結果假陽性率。總之標準方法具有特異性，能夠有效鑒別出蠟樣芽孢桿菌。

目前，參照國標方法檢測食品中蠟樣芽孢桿菌的可參考文獻較少，對部分操作步驟細節和部分技術參數沒有明確規定。如一是國標中未對酪蛋白分解試驗中陰陽性反應的試驗現象進行說明與解釋；二是蛋白質毒素結晶試驗，只有當細菌產生大量游離芽孢，毒素結晶體才會釋放出來，才有可能通過染色鏡檢觀察到這些結晶體的形態。因此，這個試驗的關鍵是如何讓細菌在最短的時間內產生大量的游離芽孢。可按標準將單個可疑菌落接種于硫酸錳營養瓊脂平板上，（30±1）℃培養3～4 d。如鏡檢時未見游離芽孢，可延長培養時間，直至見到大量游離芽孢為止。染色鏡檢過程中應嚴格控制甲醇作用時間及染色時間，清洗時要徹底。蛋白質毒素結晶體的形態是多樣的，有菱形、圓形等，并且大小不一。

綜上所述，國標中的平板計數法和MPN計數法在檢測較高濃度的蠟樣芽孢桿菌時均具有適用性和可操作性，均能達到標準方法要求的技術指標水平，檢驗結果準確可靠。但因該試驗未對低濃度蠟樣芽孢桿菌進行檢驗，未能驗證2種方法在不同蠟樣芽孢桿菌含量的食品中適用性，因此還需進一步試驗驗證。

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